老化红细胞变形能力与膜钙依赖中性蛋白酶活性的关系
作者：刘成玉* 谭润鸾*
单位：* 青岛医学院诊断学教研室, 邮政编码 青岛266021
关键词：红细胞, 老化；变形能力, 红细胞；钙依赖中性蛋白酶；膜, 红细胞
微循环学杂志/990211
目的: 探讨老化红细胞变形能力变化与红细胞膜钙依赖中性蛋白酶(Calpain)活性的关系。方法: 采用红细胞变形能力测定仪、分光光度计和凝胶电泳法分别检测了42例健康人老化和年轻红细胞变形能力、Calpain和Ca2+-ATP酶活性及红细胞膜收缩蛋白(SP)相对含量的变化。结果: 老化红细胞的滤过指数(EFI)、Calpain活性明显增高, Ca2+-ATP酶活性和SP相对含量明显降低, 与年轻红细胞比较差异有极显著性(P均<0.001)。老化红细胞的EFI与Calpain呈正相关(r=0.627, P<0.001), 与Ca2+-ATP酶和SP相对含量呈负相关(r=-0.505, -0.611, P<0.001)。结论: 老化红细胞变形能力降低与红细胞膜Calpain活性增高所致的膜骨架蛋白溶解和破坏有密切关系。
, 百拇医药
Correlation between Erythrocyte Deformability and Activity of Ca2+-Dependent Protease in Aging Erythrocyte
Liu Chengyu, Tan Runluan
Department of Diagnostics, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
Objective: To explore the correlation between erythrocyte deformability and the activity of Ca2+-dependent protease(calpain) in aging erythrocyte. Methods: The erythrocyte filtration index(EFI), calpain and Ca2+-ATPase activities, and the content of spectrin(SP) were determined respectively in young and aged erythrocyte of 42 healthy subjects by using the erythrocyte deformability apparatus, spectrophotometry and gel electrophoretic analysis. Results: The EFI and the activity of calpain were significantly higher, the activity of Ca2+-ATPase and the relative content of SP in erythrocyte membrane were significantly lower in aged erythrocytes than those in young(P all <0.001). The EFI was positively correlated with calpain activity in aged erythrocyte(r=0.627, P<0.001), negatively correlated with Ca2+-ATPase activity and SP relative content(r=-0.505, -0.611, P<0.001). The erythrocyte membrane Ca2+-ATPase activity and SP relative content were negatively correlated with the calpain activity(r=-0.614, -0.592, P<0.001). Conclusion: The decrease of aged erythrocyte deformability was closely related to the hemolysis and degradation of erythrocyte membrane skeleton proteins caused by the increase of calpain activity in aged erythrocytes.
, 百拇医药
Key words:Erythrocyte, aging; Deformability, erythrocyte; Calpain; Membrane, erythrocyte
研究表明, 老化红细胞变形能力明显降低, 且其降低与血红蛋白浓度增高及膜弹性降低有关[1]。 红细胞膜钙依赖中性蛋白酶(Calpain)和它的内源性抑制剂(Calpastatin)形成红细胞中一个蛋白水解系统, 参与红细胞中的信号传导, 调节细胞形状、 体积和细胞膜通透性, 与高血压、 细胞老化等生理、 病理现象密切相关。 Calpain可限制性水解红细胞膜骨架蛋白和其它膜内蛋白, 导致红细胞损伤[2,3]。 而老化红细胞变形能力降低与Calpain的关系尚不清楚, 为此我们检测了42例健康人老化及年轻红细胞变形能力、 Calpain活性、 Ca2+-ATP酶活性及膜收缩蛋白(SP)相对含量的变化, 以探讨老化红细胞变形能力变化与Calpain活性的关系。
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1 资料与方法
1.1 资料来源
红细胞取自42例健康人肝素抗凝血。 42例健康人中, 男22例、 女20例, 年龄26～58岁, 平均40.5±10.7岁。
1.2 方法
1.2.1 老化红细胞分离: 根据Nakai[4]的方法, 采用聚蔗糖制成不连续梯度, 密度由1.074～1.095共5层。 健康人抗凝血采用生理盐水洗涤3次, 除去白细胞及血小板层, 制成压积红细胞。 用生理盐水稀释后加于聚蔗糖梯度的最上层, 于4 ℃、 2 500 r/min, 离心90 min, 取最上层红细胞为年轻红细胞, 最下层为老化红细胞。
1.2.2 红细胞变形能力测定: 采用上海医科大学生产的DXC-300A型核孔滤膜红细胞变形能力测定仪, 测定红细胞滤过指数(EFI)作为红细胞变形能力指标。 EFI愈大, 变形能力愈小, EFI愈小, 变形能力愈大。
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1.2.3 红细胞膜Calpain活性测定: 采用文献[5]方法中的反应体系, 于650 nm波长下测定体系中的酸溶性产物的含量, 以能释放吸收值为1的酸溶性产物的酶量为一个活力单位(U), 换算成mmol/L
s-1。
1.2.4 Ca2+-ATP酶活性测定: 采用Shalevo[6]方法, 结果以nmol/gs-1表示。
1.2.5 SP相对含量测定: 按Fairbanks的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及薄层扫描法测定红细胞膜SP相对含量的变化。
1.3 统计学处理
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检测结果以
±s表示, 二组间均数比较采用t检验, 相关关系采用直线相关分析。
2 结 果
附表显示, 老化红细胞EFI、 Calpain明显增高, Ca2+-ATP酶活性和SP相对含量明显降低, 与年轻红细胞比较差异有极显著性(t=5.619～7.280, P<0.001), 见附表。 老化红细胞EFI与Calpain呈正相关(r=0.627, P<0.001), 与Ca2+-ATP酶和SP相对含量呈负相关(r=-0.505, -0.611; P<0.001), Ca2+-ATP酶活性和SP相对含量与Calpain活性呈负相关(r=-0.614, -0.592; P<0.001)。
附表 二组红细胞EFI、 Calpain和Ca2+-ATP酶活性
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及SP测定结果(±s) 组 别
n
EFI
Calpain
(mmol/Ls-1)
Ca2+-ATP酶
(nmol/gs-1)
SP
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(%)
年轻红细胞
42
0.19±
0.02
0.46±
0.05
0.72±
0.04
28.52±
6.29
老化红细胞
42
, http://www.100md.com
0.32±
0.041)
1.37±
0.081)
0.44±
0.051)
17.60±
5.561)
注: 1) 与年轻红细胞比较: t=5.619～7.280, P<0.0013 讨 论
研究老化红细胞的变形能力, 对于阐明红细胞生命进程的机理以及相关疾病的诊断与治疗, 提高输血效率, 延长血液保存期, 认识细胞在正常状态下的发生发展及死亡过程以及病理状态下的变异、 细胞老化与器官间的相互作用的规律均有十分重要的意义。 一般认为, 老化红细胞变形能力的降低与胞浆内血红蛋白浓度增高和脂质过氧化损伤有关[1,7], 与老化红细胞内ATP不足, 不能维持细胞内Ca2+稳定而致的细胞形态和膜硬度异常亦有一定的关系。 但老化红细胞变形能力降低与红细胞膜Calpain活性以及因Calpain活性改变所致的膜蛋白异常的关系尚不清楚。
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本文结果显示, 老化红细胞膜Calpain活性明显增高, 而Ca2+-ATP酶活性和SP相对含量明显降低, 且老化红细胞EFI与Calpain活性呈正相关, 与Ca2+-ATP酶活性和SP相对含量呈负相关, 提示老化红细胞变形能力降低与红细胞胞膜Calpain活性增高、 Ca2+-ATP酶活性和SP相对含量降低有关。 老化红细胞膜Ca2+-ATP酶活性降低和SP相对含量降低除了与脂质过氧化损伤有关外[7], 主要与Calpain活性增高, 作用于红细胞膜区带3蛋白、 Ca2+-ATP酶和SP, 致其溶解、 变性或退化有关[3,8]。 而老化红细胞膜Calpain抑制剂的含量和活性较年轻红细胞降低是引起Calpain活性增高的重要原因[9]。 Calpain活性增高, 直接溶解和破坏红细胞膜SP和其它骨架结构蛋白, 引起老化红细胞膜骨架结构松散, 致其变形能力降低[10]。 Ca2+-ATP酶活性降低, 引起红细胞内和膜内Ca2+浓度增加, 致膜硬度增高, 红细胞变形能力降低。 同时, 红细胞内Ca2+浓度增加, 增强了Calpain的活性, 又加速了Ca2+-ATP酶和骨架蛋白的破坏[9], 导致红细胞变形能力进一步降低。
, 百拇医药
总之, 老化红细胞膜Calpain活性的增高, 导致了红细胞膜骨架蛋白的溶解和破坏, 从而引起红细胞变形能力降低, 参与了某些疾病和细胞老化及红细胞寿命缩短的发生与发展过程。 通过对老化红细胞膜Calpain活性和骨架蛋白的改变与红细胞变形能力变化的关系的探讨, 本实验为延缓细胞功能衰退、 改善老年健康等方面的研究提供了一条值得深入探讨的途径。
参考文献
1.Bosch FH, Werre JM, Schipper L, et al. Determination of red blood cell deformability in relation to cell age. Eur J Haematol, 1994, 52(1):35.
2.Hayashi M, Saito Y, Kawashima S, et al. Calpain activation is essential for membrane fusion of erythrocytes in the presence of exogenous Ca. Biochem Biophys Res Commun, 1992, 182:939.
, http://www.100md.com
3.Salamio F, Sparator B, Melloni E, et al. The plasma membrane capcium pump is the preferred calpain substrate within the erythrocyte. Cell Calcium, 1994, 15(1):28.
4.Nakai TH. Separation of human red cells by ultracentifugation in a discontinous density grandient and lipid peroxidation. Acta Hematol Japan, 1984, 47:1 230.
5.Murachi T, Tanaka K, Hatanaka M, et al. Intracellular Ca2+-dependent proteas(calpain) and its high-molecular weight endogenous inhibitor(calpastatin). Adv Enzyme Regul, 1980, 19:407.
, 百拇医药
6.Shalevo O, Lavi V, Hebbel RP, et al. Erythrocyte Ca2+-Mg2+-ATPase activity: increased sensitivity to oxidative in glucose-6-phosphidehydrogenase deficiency. Am J Homatol, 1985, 31:245.
7.Kiefer CR, Trainor JF, McKenney JB, et al. Hemoglobin spectrin complex: interference with spectrin tetramer assembly as a mechanism for compartmentalization of band 1 and band 2 complex. Blood, 1995, 86(1):366.
8.Gaczynska M. Changes in proteolytic susceptibility of human erythrocyte membrane proteins during red blood cell aging. Cytobios, 1992, 72(290～291):197.
, 百拇医药
9.Schwarz-Benmeir N, Glaser T, Barrog S, et al. Calpastatin in erythrocytes of young and old individuals. Biochem J, 1994, 304(2):365.
10.Maeda N, Nakajima T, Izamida T, et al. Decreased deformability of red cells in refractory anemia and the abnormality of the membrane skeleton. Biorheology, 1994, 31(4):395.
收稿日期：本文1998-09-20收到,1998-12-17接受, 百拇医药(刘成玉* 谭润鸾*)
单位：* 青岛医学院诊断学教研室, 邮政编码 青岛266021
关键词：红细胞, 老化；变形能力, 红细胞；钙依赖中性蛋白酶；膜, 红细胞
微循环学杂志/990211
目的: 探讨老化红细胞变形能力变化与红细胞膜钙依赖中性蛋白酶(Calpain)活性的关系。方法: 采用红细胞变形能力测定仪、分光光度计和凝胶电泳法分别检测了42例健康人老化和年轻红细胞变形能力、Calpain和Ca2+-ATP酶活性及红细胞膜收缩蛋白(SP)相对含量的变化。结果: 老化红细胞的滤过指数(EFI)、Calpain活性明显增高, Ca2+-ATP酶活性和SP相对含量明显降低, 与年轻红细胞比较差异有极显著性(P均<0.001)。老化红细胞的EFI与Calpain呈正相关(r=0.627, P<0.001), 与Ca2+-ATP酶和SP相对含量呈负相关(r=-0.505, -0.611, P<0.001)。结论: 老化红细胞变形能力降低与红细胞膜Calpain活性增高所致的膜骨架蛋白溶解和破坏有密切关系。
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Correlation between Erythrocyte Deformability and Activity of Ca2+-Dependent Protease in Aging Erythrocyte
Liu Chengyu, Tan Runluan
Department of Diagnostics, Qingdao Medical College, Qingdao 266021
Objective: To explore the correlation between erythrocyte deformability and the activity of Ca2+-dependent protease(calpain) in aging erythrocyte. Methods: The erythrocyte filtration index(EFI), calpain and Ca2+-ATPase activities, and the content of spectrin(SP) were determined respectively in young and aged erythrocyte of 42 healthy subjects by using the erythrocyte deformability apparatus, spectrophotometry and gel electrophoretic analysis. Results: The EFI and the activity of calpain were significantly higher, the activity of Ca2+-ATPase and the relative content of SP in erythrocyte membrane were significantly lower in aged erythrocytes than those in young(P all <0.001). The EFI was positively correlated with calpain activity in aged erythrocyte(r=0.627, P<0.001), negatively correlated with Ca2+-ATPase activity and SP relative content(r=-0.505, -0.611, P<0.001). The erythrocyte membrane Ca2+-ATPase activity and SP relative content were negatively correlated with the calpain activity(r=-0.614, -0.592, P<0.001). Conclusion: The decrease of aged erythrocyte deformability was closely related to the hemolysis and degradation of erythrocyte membrane skeleton proteins caused by the increase of calpain activity in aged erythrocytes.
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Key words:Erythrocyte, aging; Deformability, erythrocyte; Calpain; Membrane, erythrocyte
研究表明, 老化红细胞变形能力明显降低, 且其降低与血红蛋白浓度增高及膜弹性降低有关[1]。 红细胞膜钙依赖中性蛋白酶(Calpain)和它的内源性抑制剂(Calpastatin)形成红细胞中一个蛋白水解系统, 参与红细胞中的信号传导, 调节细胞形状、 体积和细胞膜通透性, 与高血压、 细胞老化等生理、 病理现象密切相关。 Calpain可限制性水解红细胞膜骨架蛋白和其它膜内蛋白, 导致红细胞损伤[2,3]。 而老化红细胞变形能力降低与Calpain的关系尚不清楚, 为此我们检测了42例健康人老化及年轻红细胞变形能力、 Calpain活性、 Ca2+-ATP酶活性及膜收缩蛋白(SP)相对含量的变化, 以探讨老化红细胞变形能力变化与Calpain活性的关系。
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1 资料与方法
1.1 资料来源
红细胞取自42例健康人肝素抗凝血。 42例健康人中, 男22例、 女20例, 年龄26～58岁, 平均40.5±10.7岁。
1.2 方法
1.2.1 老化红细胞分离: 根据Nakai[4]的方法, 采用聚蔗糖制成不连续梯度, 密度由1.074～1.095共5层。 健康人抗凝血采用生理盐水洗涤3次, 除去白细胞及血小板层, 制成压积红细胞。 用生理盐水稀释后加于聚蔗糖梯度的最上层, 于4 ℃、 2 500 r/min, 离心90 min, 取最上层红细胞为年轻红细胞, 最下层为老化红细胞。
1.2.2 红细胞变形能力测定: 采用上海医科大学生产的DXC-300A型核孔滤膜红细胞变形能力测定仪, 测定红细胞滤过指数(EFI)作为红细胞变形能力指标。 EFI愈大, 变形能力愈小, EFI愈小, 变形能力愈大。
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1.2.3 红细胞膜Calpain活性测定: 采用文献[5]方法中的反应体系, 于650 nm波长下测定体系中的酸溶性产物的含量, 以能释放吸收值为1的酸溶性产物的酶量为一个活力单位(U), 换算成mmol/L
s-1。1.2.4 Ca2+-ATP酶活性测定: 采用Shalevo[6]方法, 结果以nmol/g
s-1表示。1.2.5 SP相对含量测定: 按Fairbanks的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳及薄层扫描法测定红细胞膜SP相对含量的变化。
1.3 统计学处理
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检测结果以
±s表示, 二组间均数比较采用t检验, 相关关系采用直线相关分析。2 结 果
附表显示, 老化红细胞EFI、 Calpain明显增高, Ca2+-ATP酶活性和SP相对含量明显降低, 与年轻红细胞比较差异有极显著性(t=5.619～7.280, P<0.001), 见附表。 老化红细胞EFI与Calpain呈正相关(r=0.627, P<0.001), 与Ca2+-ATP酶和SP相对含量呈负相关(r=-0.505, -0.611; P<0.001), Ca2+-ATP酶活性和SP相对含量与Calpain活性呈负相关(r=-0.614, -0.592; P<0.001)。
附表 二组红细胞EFI、 Calpain和Ca2+-ATP酶活性
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及SP测定结果(
±s) 组 别n
EFI
Calpain
(mmol/L
s-1)Ca2+-ATP酶
(nmol/g
s-1)SP
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(%)
年轻红细胞
42
0.19±
0.02
0.46±
0.05
0.72±
0.04
28.52±
6.29
老化红细胞
42
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0.32±
0.041)
1.37±
0.081)
0.44±
0.051)
17.60±
5.561)
注: 1) 与年轻红细胞比较: t=5.619～7.280, P<0.0013 讨 论
研究老化红细胞的变形能力, 对于阐明红细胞生命进程的机理以及相关疾病的诊断与治疗, 提高输血效率, 延长血液保存期, 认识细胞在正常状态下的发生发展及死亡过程以及病理状态下的变异、 细胞老化与器官间的相互作用的规律均有十分重要的意义。 一般认为, 老化红细胞变形能力的降低与胞浆内血红蛋白浓度增高和脂质过氧化损伤有关[1,7], 与老化红细胞内ATP不足, 不能维持细胞内Ca2+稳定而致的细胞形态和膜硬度异常亦有一定的关系。 但老化红细胞变形能力降低与红细胞膜Calpain活性以及因Calpain活性改变所致的膜蛋白异常的关系尚不清楚。
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本文结果显示, 老化红细胞膜Calpain活性明显增高, 而Ca2+-ATP酶活性和SP相对含量明显降低, 且老化红细胞EFI与Calpain活性呈正相关, 与Ca2+-ATP酶活性和SP相对含量呈负相关, 提示老化红细胞变形能力降低与红细胞胞膜Calpain活性增高、 Ca2+-ATP酶活性和SP相对含量降低有关。 老化红细胞膜Ca2+-ATP酶活性降低和SP相对含量降低除了与脂质过氧化损伤有关外[7], 主要与Calpain活性增高, 作用于红细胞膜区带3蛋白、 Ca2+-ATP酶和SP, 致其溶解、 变性或退化有关[3,8]。 而老化红细胞膜Calpain抑制剂的含量和活性较年轻红细胞降低是引起Calpain活性增高的重要原因[9]。 Calpain活性增高, 直接溶解和破坏红细胞膜SP和其它骨架结构蛋白, 引起老化红细胞膜骨架结构松散, 致其变形能力降低[10]。 Ca2+-ATP酶活性降低, 引起红细胞内和膜内Ca2+浓度增加, 致膜硬度增高, 红细胞变形能力降低。 同时, 红细胞内Ca2+浓度增加, 增强了Calpain的活性, 又加速了Ca2+-ATP酶和骨架蛋白的破坏[9], 导致红细胞变形能力进一步降低。
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总之, 老化红细胞膜Calpain活性的增高, 导致了红细胞膜骨架蛋白的溶解和破坏, 从而引起红细胞变形能力降低, 参与了某些疾病和细胞老化及红细胞寿命缩短的发生与发展过程。 通过对老化红细胞膜Calpain活性和骨架蛋白的改变与红细胞变形能力变化的关系的探讨, 本实验为延缓细胞功能衰退、 改善老年健康等方面的研究提供了一条值得深入探讨的途径。
参考文献
1.Bosch FH, Werre JM, Schipper L, et al. Determination of red blood cell deformability in relation to cell age. Eur J Haematol, 1994, 52(1):35.
2.Hayashi M, Saito Y, Kawashima S, et al. Calpain activation is essential for membrane fusion of erythrocytes in the presence of exogenous Ca. Biochem Biophys Res Commun, 1992, 182:939.
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3.Salamio F, Sparator B, Melloni E, et al. The plasma membrane capcium pump is the preferred calpain substrate within the erythrocyte. Cell Calcium, 1994, 15(1):28.
4.Nakai TH. Separation of human red cells by ultracentifugation in a discontinous density grandient and lipid peroxidation. Acta Hematol Japan, 1984, 47:1 230.
5.Murachi T, Tanaka K, Hatanaka M, et al. Intracellular Ca2+-dependent proteas(calpain) and its high-molecular weight endogenous inhibitor(calpastatin). Adv Enzyme Regul, 1980, 19:407.
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6.Shalevo O, Lavi V, Hebbel RP, et al. Erythrocyte Ca2+-Mg2+-ATPase activity: increased sensitivity to oxidative in glucose-6-phosphidehydrogenase deficiency. Am J Homatol, 1985, 31:245.
7.Kiefer CR, Trainor JF, McKenney JB, et al. Hemoglobin spectrin complex: interference with spectrin tetramer assembly as a mechanism for compartmentalization of band 1 and band 2 complex. Blood, 1995, 86(1):366.
8.Gaczynska M. Changes in proteolytic susceptibility of human erythrocyte membrane proteins during red blood cell aging. Cytobios, 1992, 72(290～291):197.
, 百拇医药
9.Schwarz-Benmeir N, Glaser T, Barrog S, et al. Calpastatin in erythrocytes of young and old individuals. Biochem J, 1994, 304(2):365.
10.Maeda N, Nakajima T, Izamida T, et al. Decreased deformability of red cells in refractory anemia and the abnormality of the membrane skeleton. Biorheology, 1994, 31(4):395.
收稿日期：本文1998-09-20收到,1998-12-17接受, 百拇医药(刘成玉* 谭润鸾*)