γ射线诱导HL-60和K562细胞凋亡和G2期阴滞的关系
作者：赵卫红 陈家佩 从玉文 郑胡镛
单位：赵卫红(北京放射医学研究所，北京100850)；陈家佩(北京放射医学研究所，北京100850)；从玉文(北京放射医学研究所，北京100850)；郑胡镛(北京儿童医院，北京100045 )
关键词：细胞凋亡；G2期阻滞；辐射敏感性
基础医学与临床000220
摘要 ：应用形态学、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪等方法观察g射线诱导辐射敏感细胞HL-60和辐射耐受细胞K562细胞凋亡和细胞周期改变的关系。结果：HL-60细胞受照后出现G2期阻滞，12h达高峰，凋亡细胞比例随作用时间和照射剂量的增加而增加，凋亡特有的梯状图谱分别在1、5、10Gy照后72、24、12h 出现。K562细胞受照后也出现G2期阻滞，5、10、20Gy 组分别在24、48、72h达高峰，未观察到细胞凋亡的发生。表明：细胞的辐射敏感性与致凋亡的敏感性一致，辐射敏感细胞的凋亡与从G2期阻滞的退出有关。
, 百拇医药
中图分类号：Q255 文献标识码：A
文章编号：1001-6325(2000)02-0071-03
Regulatory effcts of madopar and SCH23390 on baby temperature
of rats in heat environment
LI Peng-hao2， ZHAO Yong-qi1， WANG Lu-ming1，et al
(1. Institute of Basic Medical Sciences，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850;
2. Shenzhen Red-Cross Hospital，Shenzhen 518029， China)
, 百拇医药
Abstract ：The effects of Madopar and SCH23390 on rats' thermoregulation were observed.Rats were put into the hot environment after been treated with Madopar or SCH23390， and the raise rate of rat body temperature were analyzed.At the same time，the Kd and Bmax of D1 dopamine receptor in rat striatum were identified with radioligand binding assay.The concentration of cAMP and the content of CaM were respectively examined by radio-competitive binding reaction and FACS.The results showed that Madopar accelerated the body temperature raise of rat suffering heat stress;the antagonist SCH23390 ，however ，blocked the raise rate.The different effects of these drugs on thermoregulation may be induced by D1R and D2 R and have different molecule mechanism.
, 百拇医药
Key words：z
电离辐射既可引起细胞周期阻滞，也可诱导细胞凋亡。近年来，有关G1期阻滞和凋亡的关系研究较多[1]，对G2期阻滞和凋亡的研究较少，而肿瘤细胞受照后多发生G2期阻滞。因此，本文以辐射敏感的HL-60细胞和辐射耐受的K562细胞为对象，对g射线诱导细胞凋亡及G2期阻滞的关系进行了研究。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
HL-60 细胞和K562细胞按常规培养，受照后继续培养6、12、24、48、72h。
1.2 照射条件
60Co-g射线照射，HL-60细胞照射剂量为1、5、10Gy，K562细胞为5、10、20Gy，剂量率451.2cGy/min。
, 百拇医药
1.3 形态学观察
将细胞悬液涂片，甲醇固定5min，苏木精染色1min，1%盐酸分化10s，自来水冲洗，晾干，油镜下观察，计数400个细胞中凋亡细胞所占比例。
1.4 DNA琼脂糖凝胶电泳
取5×106细胞，参考Ray等[2]的方法提取细胞DNA，进行电泳，观察凋亡特异的梯状图谱的出现。电泳条件：琼脂糖浓度1.8%，电泳缓冲液0.5×TBE，电压2V/cm，电泳时间：2h。
1.5 流式细胞仪检测
取1×106细胞，70%乙醇 4 ℃固定过夜，加入RNA酶(100mg/mL)和溴化乙啶(50mg/mL)，室温放置30min以上，上机检测细胞周期。
, 百拇医药
表1 照射后HL-60细胞发生凋亡的比例
Table 1 The percentage of apoptotic cells after irradiation(%，
±s) Dose(Gy)
Time after irradiation(h)
6
12
24
48
72
0
, 百拇医药 0.33±0.58
1.50±0.87
2.67±0.08
2.33±2.31
3.00±2.00
1
6.00±2.00
8.67±0.29
8.67±0.58
9.40±1.64
19.07±6.99
5
, 百拇医药
10.17±3.88
13.33±2.068
24.17±2.36
35.70±16.75
/
10
15.83±10.05
25.83±9.93
36.17±10.25
/
/
2 结果
, 百拇医药
2.1 g射线诱导HL-60细胞凋亡
γ射线照射HL-60细胞后6～72h，形态学观察到有不同比例的凋亡细胞出现，表现为细胞染色质凝聚，核固缩断裂，胞膜仍完整，并且有凋亡小体的生成(图1A)。5Gy照后72h和10Gy照后48～72h，大部分细胞变成凋亡小体，故未计数(表1)。琼脂糖凝胶电泳分别在1、5、10Gy照射后48、24、12h出现凋亡特有的“梯状”(ladder)图谱(图1B)。
2.2 γ射线引起的HL-60细胞G2期阻滞
HL-60细胞受照后出现G2期阻滞，12h最明显，1、5、10Gy组G2期比例分别达22.50%±1.34%、80.00%±0.41%和62.00%±2.69%。此后G2期比例降低，1、5Gy组分别在24、48h阻滞完全解除，10Gy组照后48h，大部分细胞变成凋亡小体或碎片，不能显示细胞周期变化 。
, 百拇医药
2.3 g射线不能诱导K562细胞凋亡
K562细胞受照后6～72h，形态学仅观察到细胞体积稍增大，染色质呈细颗粒状，未见典型的凋亡细胞出现。琼脂糖凝胶电泳也可见一条或数条大分子条带，而无明显的ladder。
2.4 g射线引起K562细胞G2期阻滞
照后K562细胞也出现G2期阻滞。5、10、20Gy组分别在照后24、48、72h阻滞达高峰，G2期比例分别为67.50%±5.37%、75.40%±9.26%和81.70%±4.10%，5Gy组照后72h阻滞完全解除，10、20Gy组照后72h仍未解除。
3 讨论
HL-60细胞是辐射敏感细胞株，K562细胞是辐射耐受细胞株。本文结果显示：1～10Gy g射线可诱导HL-60细胞凋亡。5～20Gy g射线照射K562细胞后，形态学和电泳未显示凋亡特有的改变，仅流式细胞仪出现亚二倍体峰(sub-G1)，且比例低于同剂量的HL-60。表明细胞对辐射的敏感性和对凋亡的敏感性是一致的。Schwartz等[3]观察了来源相同、辐射敏感性不同的两株淋巴细胞TK6和W1-L2-NS。TK6细胞对g射线敏感，照后24h发生凋亡；W1-L2-NS 细胞对g射线耐受，相同剂量照后30h仍未发生凋亡，在更晚期才出现凋亡，且比例低于TK6细胞，与我们的结果一致。
, http://www.100md.com
HL-60细胞和K562细胞受照后都发生G2期阻滞，但HL-60细胞发生G2阻滞的高峰不随剂量变化，阻滞时间随剂量增加而增加；K562细胞发生G2期阻滞的高峰和阻滞时间都随剂量增加而增加 ；相同剂量照射下，K562细胞G2期阻滞的持续时间较HL-60细胞长。HL-60细胞在G2期阻滞解除的过程中凋亡比例明显增加，提示凋亡与细胞从G2期的退出有关，凋亡似乎是G2期阻滞进一步发展的结果。K562细胞阻滞解除后不发生凋亡，继续进入下一个增殖周期。文献报道，G2期阻滞也是细胞DNA损伤修复的过程[4，5]。同p53引起的G1期阻滞类似，辐射引起G2期阻滞，以便修复损伤的DNA，如果细胞DNA损伤得以修复，则进入下一个细胞周期，否则就发生凋亡，退出细胞周期。这可能是细胞辐射敏感性不同的机制之一，而且改变G2期阻滞的时间就可能调控凋亡。在这方面的深入研究对提高肿瘤的放疗效果具有重要意义。
, 百拇医药
图1 10Gy g射线诱导H60细胞凋亡的形态学改变(A)和电泳表现(B)
Fig 1 Morphology(A) and agarose gel electrophoresis(B) of 10Gy gammma rays-induced apoptosis in HL-60 cells.C:control. M:marker
[1]Mirkoric N，Meyn RE，Hunter NR，et al.Radiation-induced apoptosis in a murine lymphoma in vivo[J].Radiother Oncol，1994，33:11-16.
[2]Ray S，Ponnatpur V，Huang Y， et al.1-b-D-arabinofuranos-ylcytosine-，mitoxantrone-and paclitaxel-induced apoptosis in HL-60 cells ：improved method for detection of internucleosomal DNA fragmention[J].Cancer Chemother Pharmacol，1994，34 ：365-371.
, http://www.100md.com
[3]Schwartz JL，Jordan R，Sedita BA，et al.Different sensitivity to cell killing and chromosome mutation induction by gamma rays in two human lymphoblastoid cell lines derived from a single donor: possible role of apoptosis[J].Mutagenesis，1995，10(3):227-233.
[4]Maity A，Mckenna WG & Muschel RJ.The molecular basis for cell cycle delays following ionizing radiation:a review[J].Radiother Oncol，1994，31:1-13.
[5]Palayoor ST，Macklis RM，Bump EA，et al.Modulation of radiation-induced apoptosis and G2/M block in murine T-lymphoma cells[J].Radiat Res，1995，141:235-243.
收稿日期：1998-04-27；修订日期：1998-07-01, 百拇医药
单位：赵卫红(北京放射医学研究所，北京100850)；陈家佩(北京放射医学研究所，北京100850)；从玉文(北京放射医学研究所，北京100850)；郑胡镛(北京儿童医院，北京100045 )
关键词：细胞凋亡；G2期阻滞；辐射敏感性
基础医学与临床000220
摘要 ：应用形态学、琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪等方法观察g射线诱导辐射敏感细胞HL-60和辐射耐受细胞K562细胞凋亡和细胞周期改变的关系。结果：HL-60细胞受照后出现G2期阻滞，12h达高峰，凋亡细胞比例随作用时间和照射剂量的增加而增加，凋亡特有的梯状图谱分别在1、5、10Gy照后72、24、12h 出现。K562细胞受照后也出现G2期阻滞，5、10、20Gy 组分别在24、48、72h达高峰，未观察到细胞凋亡的发生。表明：细胞的辐射敏感性与致凋亡的敏感性一致，辐射敏感细胞的凋亡与从G2期阻滞的退出有关。
, 百拇医药
中图分类号：Q255 文献标识码：A
文章编号：1001-6325(2000)02-0071-03
Regulatory effcts of madopar and SCH23390 on baby temperature
of rats in heat environment
LI Peng-hao2， ZHAO Yong-qi1， WANG Lu-ming1，et al
(1. Institute of Basic Medical Sciences，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850;
2. Shenzhen Red-Cross Hospital，Shenzhen 518029， China)
, 百拇医药
Abstract ：The effects of Madopar and SCH23390 on rats' thermoregulation were observed.Rats were put into the hot environment after been treated with Madopar or SCH23390， and the raise rate of rat body temperature were analyzed.At the same time，the Kd and Bmax of D1 dopamine receptor in rat striatum were identified with radioligand binding assay.The concentration of cAMP and the content of CaM were respectively examined by radio-competitive binding reaction and FACS.The results showed that Madopar accelerated the body temperature raise of rat suffering heat stress;the antagonist SCH23390 ，however ，blocked the raise rate.The different effects of these drugs on thermoregulation may be induced by D1R and D2 R and have different molecule mechanism.
, 百拇医药
Key words：z
电离辐射既可引起细胞周期阻滞，也可诱导细胞凋亡。近年来，有关G1期阻滞和凋亡的关系研究较多[1]，对G2期阻滞和凋亡的研究较少，而肿瘤细胞受照后多发生G2期阻滞。因此，本文以辐射敏感的HL-60细胞和辐射耐受的K562细胞为对象，对g射线诱导细胞凋亡及G2期阻滞的关系进行了研究。
1 材料与方法
1.1 细胞培养
HL-60 细胞和K562细胞按常规培养，受照后继续培养6、12、24、48、72h。
1.2 照射条件
60Co-g射线照射，HL-60细胞照射剂量为1、5、10Gy，K562细胞为5、10、20Gy，剂量率451.2cGy/min。
, 百拇医药
1.3 形态学观察
将细胞悬液涂片，甲醇固定5min，苏木精染色1min，1%盐酸分化10s，自来水冲洗，晾干，油镜下观察，计数400个细胞中凋亡细胞所占比例。
1.4 DNA琼脂糖凝胶电泳
取5×106细胞，参考Ray等[2]的方法提取细胞DNA，进行电泳，观察凋亡特异的梯状图谱的出现。电泳条件：琼脂糖浓度1.8%，电泳缓冲液0.5×TBE，电压2V/cm，电泳时间：2h。
1.5 流式细胞仪检测
取1×106细胞，70%乙醇 4 ℃固定过夜，加入RNA酶(100mg/mL)和溴化乙啶(50mg/mL)，室温放置30min以上，上机检测细胞周期。
, 百拇医药
表1 照射后HL-60细胞发生凋亡的比例
Table 1 The percentage of apoptotic cells after irradiation(%，
±s) Dose(Gy)Time after irradiation(h)
6
12
24
48
72
0
, 百拇医药 0.33±0.58
1.50±0.87
2.67±0.08
2.33±2.31
3.00±2.00
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6.00±2.00
8.67±0.29
8.67±0.58
9.40±1.64
19.07±6.99
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, 百拇医药
10.17±3.88
13.33±2.068
24.17±2.36
35.70±16.75
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15.83±10.05
25.83±9.93
36.17±10.25
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2 结果
, 百拇医药
2.1 g射线诱导HL-60细胞凋亡
γ射线照射HL-60细胞后6～72h，形态学观察到有不同比例的凋亡细胞出现，表现为细胞染色质凝聚，核固缩断裂，胞膜仍完整，并且有凋亡小体的生成(图1A)。5Gy照后72h和10Gy照后48～72h，大部分细胞变成凋亡小体，故未计数(表1)。琼脂糖凝胶电泳分别在1、5、10Gy照射后48、24、12h出现凋亡特有的“梯状”(ladder)图谱(图1B)。
2.2 γ射线引起的HL-60细胞G2期阻滞
HL-60细胞受照后出现G2期阻滞，12h最明显，1、5、10Gy组G2期比例分别达22.50%±1.34%、80.00%±0.41%和62.00%±2.69%。此后G2期比例降低，1、5Gy组分别在24、48h阻滞完全解除，10Gy组照后48h，大部分细胞变成凋亡小体或碎片，不能显示细胞周期变化 。
, 百拇医药
2.3 g射线不能诱导K562细胞凋亡
K562细胞受照后6～72h，形态学仅观察到细胞体积稍增大，染色质呈细颗粒状，未见典型的凋亡细胞出现。琼脂糖凝胶电泳也可见一条或数条大分子条带，而无明显的ladder。
2.4 g射线引起K562细胞G2期阻滞
照后K562细胞也出现G2期阻滞。5、10、20Gy组分别在照后24、48、72h阻滞达高峰，G2期比例分别为67.50%±5.37%、75.40%±9.26%和81.70%±4.10%，5Gy组照后72h阻滞完全解除，10、20Gy组照后72h仍未解除。
3 讨论
HL-60细胞是辐射敏感细胞株，K562细胞是辐射耐受细胞株。本文结果显示：1～10Gy g射线可诱导HL-60细胞凋亡。5～20Gy g射线照射K562细胞后，形态学和电泳未显示凋亡特有的改变，仅流式细胞仪出现亚二倍体峰(sub-G1)，且比例低于同剂量的HL-60。表明细胞对辐射的敏感性和对凋亡的敏感性是一致的。Schwartz等[3]观察了来源相同、辐射敏感性不同的两株淋巴细胞TK6和W1-L2-NS。TK6细胞对g射线敏感，照后24h发生凋亡；W1-L2-NS 细胞对g射线耐受，相同剂量照后30h仍未发生凋亡，在更晚期才出现凋亡，且比例低于TK6细胞，与我们的结果一致。
, http://www.100md.com
HL-60细胞和K562细胞受照后都发生G2期阻滞，但HL-60细胞发生G2阻滞的高峰不随剂量变化，阻滞时间随剂量增加而增加；K562细胞发生G2期阻滞的高峰和阻滞时间都随剂量增加而增加 ；相同剂量照射下，K562细胞G2期阻滞的持续时间较HL-60细胞长。HL-60细胞在G2期阻滞解除的过程中凋亡比例明显增加，提示凋亡与细胞从G2期的退出有关，凋亡似乎是G2期阻滞进一步发展的结果。K562细胞阻滞解除后不发生凋亡，继续进入下一个增殖周期。文献报道，G2期阻滞也是细胞DNA损伤修复的过程[4，5]。同p53引起的G1期阻滞类似，辐射引起G2期阻滞，以便修复损伤的DNA，如果细胞DNA损伤得以修复，则进入下一个细胞周期，否则就发生凋亡，退出细胞周期。这可能是细胞辐射敏感性不同的机制之一，而且改变G2期阻滞的时间就可能调控凋亡。在这方面的深入研究对提高肿瘤的放疗效果具有重要意义。
, 百拇医药
图1 10Gy g射线诱导H60细胞凋亡的形态学改变(A)和电泳表现(B)
Fig 1 Morphology(A) and agarose gel electrophoresis(B) of 10Gy gammma rays-induced apoptosis in HL-60 cells.C:control. M:marker
[1]Mirkoric N，Meyn RE，Hunter NR，et al.Radiation-induced apoptosis in a murine lymphoma in vivo[J].Radiother Oncol，1994，33:11-16.
[2]Ray S，Ponnatpur V，Huang Y， et al.1-b-D-arabinofuranos-ylcytosine-，mitoxantrone-and paclitaxel-induced apoptosis in HL-60 cells ：improved method for detection of internucleosomal DNA fragmention[J].Cancer Chemother Pharmacol，1994，34 ：365-371.
, http://www.100md.com
[3]Schwartz JL，Jordan R，Sedita BA，et al.Different sensitivity to cell killing and chromosome mutation induction by gamma rays in two human lymphoblastoid cell lines derived from a single donor: possible role of apoptosis[J].Mutagenesis，1995，10(3):227-233.
[4]Maity A，Mckenna WG & Muschel RJ.The molecular basis for cell cycle delays following ionizing radiation:a review[J].Radiother Oncol，1994，31:1-13.
[5]Palayoor ST，Macklis RM，Bump EA，et al.Modulation of radiation-induced apoptosis and G2/M block in murine T-lymphoma cells[J].Radiat Res，1995，141:235-243.
收稿日期：1998-04-27；修订日期：1998-07-01, 百拇医药