HyTK/ACV对大鼠颈动脉内皮剥脱后内膜增生的抑制作用
作者：张英谦 张洪义 田时雨 吴小兵
单位：张英谦(空军总医院神经科，北京 100036)；张洪义 田时雨 吴小兵(第一军医大学珠江医院，广州 510282)
关键词：
基础医学与临床000627
文章编号：1001-6325(2000)06-0019-01
本实验应用重组逆转录病毒(LNCX)为载体，将潮霉素B磷酸转移酶基因与Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的融合基因(HyTK)导入大鼠颈动脉壁细胞中，配合应用无环鸟苷(ACV)，观察对内皮细胞(EC)剥脱后血管平滑肌细胞(SMC)增生的抑制作用。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 动物：国产SD大鼠，雄性300～400g。
1.2 材料：LNCHyTK病毒上清，滴度2×105CFU/mL，LNCX为空载逆病毒载体，DMEM Gibco公司出品，ACV湖北潜江制药厂生产，批号960304。
1.3 转基因：应用“空气吹干法”造成颈动脉EC脱落，1周后进行动脉壁基因转染。每组3只，实验组：转染HyTK，给ACV(HyTK/+ACV)，对照组：转染HyTK，不给ACV(HyTK/-ACV)，及用LNCX和DMEM代替LNCHyTK，给ACV(LNCX/+ACV及DMEM/+ACV)。转染时血管内孵育两次，每次20min，间隔5min。
1.4 ACV治疗：于转基因后第2d开始，1.5～2mg/100g，每8h，腹腔内注射，无ACV鼠给予等量注射用水。
1.5 观察分析：ACV治疗14d主动脉灌注固定，取出颈总动脉，常规包埋、切片、染色，Q520显微图像分析仪检测动脉内膜(I)、中膜(M)厚度，计算I/M的比值。光镜观察脑、心、肾的反应。
, 百拇医药
1.6 HyTK和可复制逆转录病毒(RCR)的PCR检测：引物P1、P2检测HyTK，ENV1、ENV3检测RCR。用酚-氯仿法提取组织中DNA，PCR总反应体积25μL，待测DNA1μL，P1、P2及ENV1、ENV3各1μL(25pmol/L)，2mmol/L dNTP 1μL，10×Buffer2.5μL，模板DNA1μL，Taq酶2u。94℃、60℃、73℃各45s，最后一个循环73℃ 5min，共30个循环。
2 结果
光镜发现LNCHyTK/+ACV 14d大鼠颈动脉壁增厚较轻，各组I/M为: HyTK/+ACV 0.250，HyTK/-ACV 0.550，LNCX/+ACV 0.614，DMEM/+ACV 0.586，各组动物心、脑、肾组织结构正常，无炎性反应改变。PCR扩增结果：P1、P2 LNCHyTK/+、-ACV两组为阳性(395bp)，LNCX、DMEM/+ACV两组为阴性；ENV1、ENV3各组动脉壁及脑均为阴性。
, 百拇医药
3 讨论
本实验采用in vivo方法，用LNCHyTK直接转染血管壁细胞，经PCR证明HyTK转移成功，动脉壁及远端脑组织中不含RCR。观察HyTK/+ACV大鼠多个脏器均未发现明显异常，提示LNCHyTK/+ACV方法是安全的。HyTK/+ACV治疗14d动脉壁I/M较对照组有明显减少，提示HyTK/+ACV能够抑制新生内膜的增生。此结果与Barbee的不同，比较两者适当延长病毒上清与血管壁接触时间，短时间内重复转染，可能有助于提高转染效率。人的颈动脉内膜切除术后2-3年出现的早期再狭窄，主要表现为新生内膜中的纤维肌性增生及糖蛋白沉积；晚期再狭窄则主要由动脉粥样硬化成份组成，其间夹杂有局灶性的内膜纤维肌性增生。因此SMC的增殖的影响贯穿再狭窄发生的始终。抑制SMC的早期增生，其意义不仅仅在于减少管壁的细胞数，还可影响到随后出现的间质沉积、SMC的泡沫化、粥样斑块形成和钙化。以往认为受损的动脉壁为新生EC覆盖后，内膜中SMC的增殖即停止。我们观察到至损伤后2～3周，HyTK/+ACV鼠的动脉腔面仍无EC覆盖，推测可能是HyTK/+ACV抑制了它的修复。与SMC相比，EC的再生能力十分低下，而LNCHyTK/+ACV对具有活跃增殖能力的细胞有选择性。在同样条件下，EC被LNCHyTK转染并被ACV杀死的可能性远远小于增殖活跃SMC。有实验表明TK/+Gcyclovir治疗结束后，EC的再生可以恢复。因此HyTK/+ACV可能只是暂时影响EC修复。
收稿日期：1999-06-03
修回日期：1999-10-21, 百拇医药
单位：张英谦(空军总医院神经科，北京 100036)；张洪义 田时雨 吴小兵(第一军医大学珠江医院，广州 510282)
关键词：
基础医学与临床000627
文章编号：1001-6325(2000)06-0019-01
本实验应用重组逆转录病毒(LNCX)为载体，将潮霉素B磷酸转移酶基因与Ⅰ型单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的融合基因(HyTK)导入大鼠颈动脉壁细胞中，配合应用无环鸟苷(ACV)，观察对内皮细胞(EC)剥脱后血管平滑肌细胞(SMC)增生的抑制作用。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 动物：国产SD大鼠，雄性300～400g。
1.2 材料：LNCHyTK病毒上清，滴度2×105CFU/mL，LNCX为空载逆病毒载体，DMEM Gibco公司出品，ACV湖北潜江制药厂生产，批号960304。
1.3 转基因：应用“空气吹干法”造成颈动脉EC脱落，1周后进行动脉壁基因转染。每组3只，实验组：转染HyTK，给ACV(HyTK/+ACV)，对照组：转染HyTK，不给ACV(HyTK/-ACV)，及用LNCX和DMEM代替LNCHyTK，给ACV(LNCX/+ACV及DMEM/+ACV)。转染时血管内孵育两次，每次20min，间隔5min。
1.4 ACV治疗：于转基因后第2d开始，1.5～2mg/100g，每8h，腹腔内注射，无ACV鼠给予等量注射用水。
1.5 观察分析：ACV治疗14d主动脉灌注固定，取出颈总动脉，常规包埋、切片、染色，Q520显微图像分析仪检测动脉内膜(I)、中膜(M)厚度，计算I/M的比值。光镜观察脑、心、肾的反应。
, 百拇医药
1.6 HyTK和可复制逆转录病毒(RCR)的PCR检测：引物P1、P2检测HyTK，ENV1、ENV3检测RCR。用酚-氯仿法提取组织中DNA，PCR总反应体积25μL，待测DNA1μL，P1、P2及ENV1、ENV3各1μL(25pmol/L)，2mmol/L dNTP 1μL，10×Buffer2.5μL，模板DNA1μL，Taq酶2u。94℃、60℃、73℃各45s，最后一个循环73℃ 5min，共30个循环。
2 结果
光镜发现LNCHyTK/+ACV 14d大鼠颈动脉壁增厚较轻，各组I/M为: HyTK/+ACV 0.250，HyTK/-ACV 0.550，LNCX/+ACV 0.614，DMEM/+ACV 0.586，各组动物心、脑、肾组织结构正常，无炎性反应改变。PCR扩增结果：P1、P2 LNCHyTK/+、-ACV两组为阳性(395bp)，LNCX、DMEM/+ACV两组为阴性；ENV1、ENV3各组动脉壁及脑均为阴性。
, 百拇医药
3 讨论
本实验采用in vivo方法，用LNCHyTK直接转染血管壁细胞，经PCR证明HyTK转移成功，动脉壁及远端脑组织中不含RCR。观察HyTK/+ACV大鼠多个脏器均未发现明显异常，提示LNCHyTK/+ACV方法是安全的。HyTK/+ACV治疗14d动脉壁I/M较对照组有明显减少，提示HyTK/+ACV能够抑制新生内膜的增生。此结果与Barbee的不同，比较两者适当延长病毒上清与血管壁接触时间，短时间内重复转染，可能有助于提高转染效率。人的颈动脉内膜切除术后2-3年出现的早期再狭窄，主要表现为新生内膜中的纤维肌性增生及糖蛋白沉积；晚期再狭窄则主要由动脉粥样硬化成份组成，其间夹杂有局灶性的内膜纤维肌性增生。因此SMC的增殖的影响贯穿再狭窄发生的始终。抑制SMC的早期增生，其意义不仅仅在于减少管壁的细胞数，还可影响到随后出现的间质沉积、SMC的泡沫化、粥样斑块形成和钙化。以往认为受损的动脉壁为新生EC覆盖后，内膜中SMC的增殖即停止。我们观察到至损伤后2～3周，HyTK/+ACV鼠的动脉腔面仍无EC覆盖，推测可能是HyTK/+ACV抑制了它的修复。与SMC相比，EC的再生能力十分低下，而LNCHyTK/+ACV对具有活跃增殖能力的细胞有选择性。在同样条件下，EC被LNCHyTK转染并被ACV杀死的可能性远远小于增殖活跃SMC。有实验表明TK/+Gcyclovir治疗结束后，EC的再生可以恢复。因此HyTK/+ACV可能只是暂时影响EC修复。
收稿日期：1999-06-03
修回日期：1999-10-21, 百拇医药