ApoE基因multi-ARMS快速分型法
作者：郑芳 周新 叶光明 贺小玲 刘芳 陈谦
单位：湖北医科大学附二医院基因诊断中心，武汉 430071
关键词：载脂蛋白E基因型；等位基因特异性PCR；多重PCR
基础医学与临床000634 摘要：建立一种简单快速的ApoE基因分型法。以外周血白细胞DNA为模板，设计了4个等位基因特异性寡核苷酸引物和一个公共引物，采用等位基因特异性多重PCR技术(Multiplex Amplification Refractory Mutation System PCR, multi-ARMS PCR)，检测了85例个体的6种常见ApoE基因型。6种常见ApoE基因型的频率为: ε2/2(0.012), ε3/3(0.705), ε4/4(0.012), ε3/2(0.118),ε4/3(0.141)和ε4/2(0.012).本方法简便、可靠，很有推广应用价值。
, 百拇医药
中图分类号：R349.82 文献标识码：A
文章编号：1001-6325(2000)06-0088-03
Idenitify apolipoprotein genotypes in 85 subjects by the multiplex
amplification refractory mutation system PCR
ZHENG Fang ZHOU Xin YE Guang-ming et al
(The Genetic Diagnosis Center, The Sencond Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430071,China)
, 百拇医药
Abstract： To idenitify apolipoprotein (ApoE) genotypes.Six genotypes of ApoE genetic polymorphism ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε3/2、ε4/3 and ε4/2 were identified respectivly by the multiplex amplification refractory mutation system PCR (multi-AMRS) using four allele-specific oligonucleotide primers and one common primer in 85 subjects.The frequencies of ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε3/2、ε4/3 and ε4/2 were 0.012,0.705,0.012 respectively,0.118,0.141,0.012.The method is fast, reliable and can easily be implemented into a minimally equipped laboratory.
, 百拇医药
Key words： genotype；ApoE gene；the multiplex amplification refractory mutation system PCR.
载脂蛋白E(Apolipoprotein E, ApoE)是人体十几种载脂蛋白之一，具有明显而丰富的多态性，一直以来都是脂代谢研究中的热点[1]。ApoE具有3种常见的异构体E2、E3、E4，它们的区别在于112位和158位氨基酸残基不同。编码这三种异构体的等位基因分别为ε2、ε3、ε4，从而产生六种不同的基因型(表型)ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε3/2、ε4/3和ε4/2(E2/2、E3/3、E4/4、E3/2、E4/3和E4/2)。
ApoE基因多态性和三型高脂血症(Ⅲ HLP)、老年性痴呆(AD)之间有密切的关系，携带ε4等位基因的个体其血脂水平偏高，且易患AD；携带ε2等位基因的个体其血脂水平偏低，对动脉硬化性心脑血管疾病如冠心病(CHD)、动脉硬化性脑梗塞(ABI)具有一定的抵抗性。虽然仅凭判定ApoE基因型不足以诊断以上疾病，但是ApoE基因型的判定作为一种辅助手段对诊断以上疾病是很有价值的。故而一种快速而简便的ApoE基因分型法对任何一个参与ApoE临床研究的实验室而言都是必需的。
, 百拇医药
1 材料
1.1 对象
湖北地区健康汉族人85例，年龄34±12岁，男46例，女39例。
1.2 试剂和仪器
Taq酶, dNTP,pUC19DNA/MspⅠMarker(上海复华)，DNA扩增仪(PE2400)。
2 方法
2.1 模板DNA的制备
在1mL的去离子双蒸水(ddH2O)中加入抗凝的外周血5μL，室温静置30min。10,000r/min离心5min，去上清，加1mL ddH2O，10,000r/min再离心5min。去上清，加入Chelex-100 200μL，置56℃保温20min，震荡5-10s。置100℃加热8min，震荡5-10s。5,000r/min离心3s，置4℃保存待用。
, 百拇医药
2.2 multi-ARMS PCR
2.2.1 引物设计：按Donohoe等[2]报道的方法，设计引物序列如下：
P1：5’-atg ccg atg acc tgc aga att-3’(Cys158),P2：5’-atg ccg atg acc tgc aga atc-3’(Arg158),分别检测158位的半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)；
P3：5’-cgc gga cat gga cgt ttt-3’(Cys112)
P4：5’-cgc gga cat gga cgt ttc-3’(Arg112)
分别检测112位的半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)；
, 百拇医药
P5：5’-gtt cag tga ttg tcg ctg ggc a-3’为公共引物
3’端的划线碱基为故意错配的碱基，用以提高引物的特异性，P1与P5、P2与P5间扩增片段大小为451bp，P3与P5、P4与P5间扩增片段大小为588bp。另设计一对引物用于扩增低密度脂蛋白受体基因外显子13片段，作为内参照，序列如下：
P7：5’-aac aac tga ccc cgc tgg cg-3’
P8：5’-atg gcg ctg agg ccg cgc tc-3’
其扩增片段大小为228bp。
2.2.2 PCR反应体系(25μL)：A管和B管均加入10×buffer 2.5μL(含15mmol/L MgCl2),DMSO2.5μL,10mmol/L dNTP 0.5μL, P5 20pmol, Taq DNA 聚合酶4u(0.5 u/μL),DNA 3μL,P7,P8各26pmol,ddH2O 0.5μL。A管加入 P1 18 pmol,P3 12 pmol；B管加入 P2 18 pmol，P4 12 pmol。
, 百拇医药
2.2.3 PCR反应条件：95℃预变性5min，然后按96℃ 45s，66℃ 45s，72℃ 1min，循环35次，末次循环后72℃延伸5min，产物经含EB的2% 的琼脂糖电泳。P1与P5、P2与P5间扩增产物带为451bp，P3与P5、P4与P5间扩增产物带为588bp，P7与P8间扩增产物带为228bp。
3 结果
基因型的判定见图1。ε3/3型模板，在112位为Cys,在158位为Arg,因此在A体系中,引物P1/Cys158(451bp)不能和模板结合，P3/Cys112(588bp)可以和模板结合，仅得到588bp的带。在B体系中,引物P4/Arg112(588bp)不能和模板结合，P2/Arg158(451bp)可以和模板结合，仅得到451bp的带。同理，可推知ε2/2、ε4/4型模板的扩增结果，见表1。ε4/2型模板由于含ε4等位基因和ε2等位基因，前者扩增结果相当于ε4/4型模板；后者扩增结果相当于ε2/2型模板，故其扩增结果为两者的综合，在A体系中含588bp和451bp的带，在B体系中也含588bp和451bp的带。同理，可推知ε3/2、ε4/3型模板的扩增结果，见表1。
, 百拇医药
表1 六种ApoE常见基因型A、B体系扩增产物
Table 1 Amplification products of the six commom
ApoE genotypes in A or B mixtrue
PCR production(bp)
A system
Bsystem
ε2/2
588
451
-
, 百拇医药
ε3/3
588
451
ε4/4
-
588
451
ε3/2
588
451
451
ε4/3
588
, http://www.100md.com
588
451
ε4/2
588
451
588
451
D:＼fang＼基因快速分型法3.doc
图1 六种ApoE常见基因型ARMS法扩增产物琼脂糖电泳图
Fig 1 Amplification products of the six commom ApoE genotypes in A or B mixtrue with modified ARMS on agarose gel
, 百拇医药
Mixture A contains the ARMS diagnostic primers P1/Cys112(588 bp)and P2/Cys158(451bp).Similarly, mixture B contains the P3/Arg112(588bp)and P4/Arg158 (451 bp)ARMS diagnostic primers, Both mixtures contain the same common ARMS primer(P5) as well as a set of internal control primers(P7,P8) that amplify a 228-bp segment of the LDL-R gene.Lane 1, pUC19/MspⅠladder;lanes 2 and 3, patient ε2/2 (Cys112 positive,Cys158 positive, Arg112 negative, Arg158 negative);lanes 4 and 5,patient ε3/3 (Cys112 postive, Cys158 negative,Arg112 negative, Arg158 positive);lanes 6 and 7, patient ε4/4 (cys112 negative,Cys158 negative;Arg112 positive, Arg158 positve);lanes 8 and 9, patient ε3/2(Cys112 positive , Cys158 positive; Arg112 negative, Arg158 positive); ε4/3(Cys112 positive, Cys158 negative;Arg112 positive,Arg158 positive );lanes 10 and 11, patient ε4/2 (cys112 positive, Cys158 positive ;Arg112 positive , Arg158 positive).
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4 讨论
近来多种ApoE基因分型的方法相继被报道，如单链构象多态性(SSCP)分析法、等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法、HhaⅠ或AflⅢ/HaeⅢ酶切分型法或等位基因特异性PCR法(ARMS)。ARMS这一方法和其它方法比较有简便、快速、无放射性污染，无需标记的特点。它既不象SSCP技术需放射性探针；又不象限制性酶切技术，需使用限制性内切酶消化；也不象等位基因寡核苷酸探针杂交法需要探针标记。其扩增片段大小介于228bp～588bp之间，扩增片段间的大小差距大，可在琼脂糖上得到快速有效的分离。整个检测过程仅需几个小时。
ARMS ApoE 分型法由Wehan等[3]首先报道，但这一方法需要4个不同的PCR反应体系来完成一个标本的基因型判定。通过将这一方法和多重PCR技术融合，我们设计出4个G+C含量相近，彼此无互补序列的等位基因特异性引物，将反应体系减少为2个。从而，成功地建立了一种新的仅需2个PCR反应体系的ApoE AMRS 分型法。本法简便、快速，准确、可靠，在普通临床实验室很有推广应用前景，对与ApoE基因多态性有关的疾病的临床基础研究有重大价值，并可发展为检验科常规检测项目。然而，PCR扩增技术上的失败，可能会导致ApoE错误的分型，为此设立了内对照，以区分扩增的失败与阴性的结果。我们初步用此法检测了85个研究对象，得到ApoE基因型频率如下：ε2/2(0.012),ε3/3(0.705),ε4/4(0.012),ε3/2(0.118),ε4/3(0.141),ε4/2(0.012)。
, 百拇医药
基金项目：湖北教委重点课题(SG-2)
参考文献：
[1] 周新,郑芳.载脂蛋白E[A].周新.动脉粥样硬化与生物化学诊断[C].武汉:湖北科技出版社，1997.37-41.
[2] Gerard GD, Ann S, Terho L,et al.Rapid identification of Apolipoprotein E genotypes by multiplex amplification refractory mutation system PCR and capilliary gel electrophoresis[J]. Clin Chem, 1999,45:143-145.
[3] Wehan PR, Newton CR, Price WH.Analysis of apolipoprotein E genotypes by the amplification refractory mutation system[J]. Clin Chem,1991,37:241-246.
收稿日期：1999-10-11
修回日期：2000-02-14, 百拇医药
单位：湖北医科大学附二医院基因诊断中心，武汉 430071
关键词：载脂蛋白E基因型；等位基因特异性PCR；多重PCR
基础医学与临床000634 摘要：建立一种简单快速的ApoE基因分型法。以外周血白细胞DNA为模板，设计了4个等位基因特异性寡核苷酸引物和一个公共引物，采用等位基因特异性多重PCR技术(Multiplex Amplification Refractory Mutation System PCR, multi-ARMS PCR)，检测了85例个体的6种常见ApoE基因型。6种常见ApoE基因型的频率为: ε2/2(0.012), ε3/3(0.705), ε4/4(0.012), ε3/2(0.118),ε4/3(0.141)和ε4/2(0.012).本方法简便、可靠，很有推广应用价值。
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中图分类号：R349.82 文献标识码：A
文章编号：1001-6325(2000)06-0088-03
Idenitify apolipoprotein genotypes in 85 subjects by the multiplex
amplification refractory mutation system PCR
ZHENG Fang ZHOU Xin YE Guang-ming et al
(The Genetic Diagnosis Center, The Sencond Affiliated Hospital of Hubei Medical University, Wuhan 430071,China)
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Abstract： To idenitify apolipoprotein (ApoE) genotypes.Six genotypes of ApoE genetic polymorphism ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε3/2、ε4/3 and ε4/2 were identified respectivly by the multiplex amplification refractory mutation system PCR (multi-AMRS) using four allele-specific oligonucleotide primers and one common primer in 85 subjects.The frequencies of ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε3/2、ε4/3 and ε4/2 were 0.012,0.705,0.012 respectively,0.118,0.141,0.012.The method is fast, reliable and can easily be implemented into a minimally equipped laboratory.
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Key words： genotype；ApoE gene；the multiplex amplification refractory mutation system PCR.
载脂蛋白E(Apolipoprotein E, ApoE)是人体十几种载脂蛋白之一，具有明显而丰富的多态性，一直以来都是脂代谢研究中的热点[1]。ApoE具有3种常见的异构体E2、E3、E4，它们的区别在于112位和158位氨基酸残基不同。编码这三种异构体的等位基因分别为ε2、ε3、ε4，从而产生六种不同的基因型(表型)ε2/2、ε3/3、ε4/4、ε3/2、ε4/3和ε4/2(E2/2、E3/3、E4/4、E3/2、E4/3和E4/2)。
ApoE基因多态性和三型高脂血症(Ⅲ HLP)、老年性痴呆(AD)之间有密切的关系，携带ε4等位基因的个体其血脂水平偏高，且易患AD；携带ε2等位基因的个体其血脂水平偏低，对动脉硬化性心脑血管疾病如冠心病(CHD)、动脉硬化性脑梗塞(ABI)具有一定的抵抗性。虽然仅凭判定ApoE基因型不足以诊断以上疾病，但是ApoE基因型的判定作为一种辅助手段对诊断以上疾病是很有价值的。故而一种快速而简便的ApoE基因分型法对任何一个参与ApoE临床研究的实验室而言都是必需的。
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1 材料
1.1 对象
湖北地区健康汉族人85例，年龄34±12岁，男46例，女39例。
1.2 试剂和仪器
Taq酶, dNTP,pUC19DNA/MspⅠMarker(上海复华)，DNA扩增仪(PE2400)。
2 方法
2.1 模板DNA的制备
在1mL的去离子双蒸水(ddH2O)中加入抗凝的外周血5μL，室温静置30min。10,000r/min离心5min，去上清，加1mL ddH2O，10,000r/min再离心5min。去上清，加入Chelex-100 200μL，置56℃保温20min，震荡5-10s。置100℃加热8min，震荡5-10s。5,000r/min离心3s，置4℃保存待用。
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2.2 multi-ARMS PCR
2.2.1 引物设计：按Donohoe等[2]报道的方法，设计引物序列如下：
P1：5’-atg ccg atg acc tgc aga att-3’(Cys158),P2：5’-atg ccg atg acc tgc aga atc-3’(Arg158),分别检测158位的半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)；
P3：5’-cgc gga cat gga cgt ttt-3’(Cys112)
P4：5’-cgc gga cat gga cgt ttc-3’(Arg112)
分别检测112位的半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)；
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P5：5’-gtt cag tga ttg tcg ctg ggc a-3’为公共引物
3’端的划线碱基为故意错配的碱基，用以提高引物的特异性，P1与P5、P2与P5间扩增片段大小为451bp，P3与P5、P4与P5间扩增片段大小为588bp。另设计一对引物用于扩增低密度脂蛋白受体基因外显子13片段，作为内参照，序列如下：
P7：5’-aac aac tga ccc cgc tgg cg-3’
P8：5’-atg gcg ctg agg ccg cgc tc-3’
其扩增片段大小为228bp。
2.2.2 PCR反应体系(25μL)：A管和B管均加入10×buffer 2.5μL(含15mmol/L MgCl2),DMSO2.5μL,10mmol/L dNTP 0.5μL, P5 20pmol, Taq DNA 聚合酶4u(0.5 u/μL),DNA 3μL,P7,P8各26pmol,ddH2O 0.5μL。A管加入 P1 18 pmol,P3 12 pmol；B管加入 P2 18 pmol，P4 12 pmol。
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2.2.3 PCR反应条件：95℃预变性5min，然后按96℃ 45s，66℃ 45s，72℃ 1min，循环35次，末次循环后72℃延伸5min，产物经含EB的2% 的琼脂糖电泳。P1与P5、P2与P5间扩增产物带为451bp，P3与P5、P4与P5间扩增产物带为588bp，P7与P8间扩增产物带为228bp。
3 结果
基因型的判定见图1。ε3/3型模板，在112位为Cys,在158位为Arg,因此在A体系中,引物P1/Cys158(451bp)不能和模板结合，P3/Cys112(588bp)可以和模板结合，仅得到588bp的带。在B体系中,引物P4/Arg112(588bp)不能和模板结合，P2/Arg158(451bp)可以和模板结合，仅得到451bp的带。同理，可推知ε2/2、ε4/4型模板的扩增结果，见表1。ε4/2型模板由于含ε4等位基因和ε2等位基因，前者扩增结果相当于ε4/4型模板；后者扩增结果相当于ε2/2型模板，故其扩增结果为两者的综合，在A体系中含588bp和451bp的带，在B体系中也含588bp和451bp的带。同理，可推知ε3/2、ε4/3型模板的扩增结果，见表1。
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表1 六种ApoE常见基因型A、B体系扩增产物
Table 1 Amplification products of the six commom
ApoE genotypes in A or B mixtrue
PCR production(bp)
A system
Bsystem
ε2/2
588
451
-
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ε3/3
588
451
ε4/4
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588
451
ε3/2
588
451
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ε4/3
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ε4/2
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451
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D:＼fang＼基因快速分型法3.doc
图1 六种ApoE常见基因型ARMS法扩增产物琼脂糖电泳图
Fig 1 Amplification products of the six commom ApoE genotypes in A or B mixtrue with modified ARMS on agarose gel
, 百拇医药
Mixture A contains the ARMS diagnostic primers P1/Cys112(588 bp)and P2/Cys158(451bp).Similarly, mixture B contains the P3/Arg112(588bp)and P4/Arg158 (451 bp)ARMS diagnostic primers, Both mixtures contain the same common ARMS primer(P5) as well as a set of internal control primers(P7,P8) that amplify a 228-bp segment of the LDL-R gene.Lane 1, pUC19/MspⅠladder;lanes 2 and 3, patient ε2/2 (Cys112 positive,Cys158 positive, Arg112 negative, Arg158 negative);lanes 4 and 5,patient ε3/3 (Cys112 postive, Cys158 negative,Arg112 negative, Arg158 positive);lanes 6 and 7, patient ε4/4 (cys112 negative,Cys158 negative;Arg112 positive, Arg158 positve);lanes 8 and 9, patient ε3/2(Cys112 positive , Cys158 positive; Arg112 negative, Arg158 positive); ε4/3(Cys112 positive, Cys158 negative;Arg112 positive,Arg158 positive );lanes 10 and 11, patient ε4/2 (cys112 positive, Cys158 positive ;Arg112 positive , Arg158 positive).
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近来多种ApoE基因分型的方法相继被报道，如单链构象多态性(SSCP)分析法、等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法、HhaⅠ或AflⅢ/HaeⅢ酶切分型法或等位基因特异性PCR法(ARMS)。ARMS这一方法和其它方法比较有简便、快速、无放射性污染，无需标记的特点。它既不象SSCP技术需放射性探针；又不象限制性酶切技术，需使用限制性内切酶消化；也不象等位基因寡核苷酸探针杂交法需要探针标记。其扩增片段大小介于228bp～588bp之间，扩增片段间的大小差距大，可在琼脂糖上得到快速有效的分离。整个检测过程仅需几个小时。
ARMS ApoE 分型法由Wehan等[3]首先报道，但这一方法需要4个不同的PCR反应体系来完成一个标本的基因型判定。通过将这一方法和多重PCR技术融合，我们设计出4个G+C含量相近，彼此无互补序列的等位基因特异性引物，将反应体系减少为2个。从而，成功地建立了一种新的仅需2个PCR反应体系的ApoE AMRS 分型法。本法简便、快速，准确、可靠，在普通临床实验室很有推广应用前景，对与ApoE基因多态性有关的疾病的临床基础研究有重大价值，并可发展为检验科常规检测项目。然而，PCR扩增技术上的失败，可能会导致ApoE错误的分型，为此设立了内对照，以区分扩增的失败与阴性的结果。我们初步用此法检测了85个研究对象，得到ApoE基因型频率如下：ε2/2(0.012),ε3/3(0.705),ε4/4(0.012),ε3/2(0.118),ε4/3(0.141),ε4/2(0.012)。
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基金项目：湖北教委重点课题(SG-2)
参考文献：
[1] 周新,郑芳.载脂蛋白E[A].周新.动脉粥样硬化与生物化学诊断[C].武汉:湖北科技出版社，1997.37-41.
[2] Gerard GD, Ann S, Terho L,et al.Rapid identification of Apolipoprotein E genotypes by multiplex amplification refractory mutation system PCR and capilliary gel electrophoresis[J]. Clin Chem, 1999,45:143-145.
[3] Wehan PR, Newton CR, Price WH.Analysis of apolipoprotein E genotypes by the amplification refractory mutation system[J]. Clin Chem,1991,37:241-246.
收稿日期：1999-10-11
修回日期：2000-02-14, 百拇医药