镉对心肌细胞动作电位的影响及硒的保护作用
作者：彭双清 刘世杰
单位：100850北京,军事医学科学院毒物药物研究所(彭双清);北京医科大学公共卫生学院(刘世杰)
关键词：镉；亚硒酸钠；硒代蛋氨酸；心肌细胞；动作电位
中华劳动卫生职业病杂志/980110Effect of Cadmium on Action Potentials of Cultured Myocardiocytes
and Protective Effects of Selenium
Peng Shuangqing,Liu Shijie
摘要 目的 探讨镉(Cd)对心肌的毒性作用机制及硒的保护效应。方法 在培养的Wistar大鼠乳鼠心肌细胞上观察了镉对膜电位活动的影响及亚硒酸钠和硒代蛋氨酸的保护作用。结果 镉使心肌细胞动作电位幅值(APA)、超射(OS)、阈电位(TP)、最大舒张电位(MDP)及最大除极速率(Vmax)显著降低;复极化时程(APD)明显缩短;动作电位发放频率(APF)明显加快。硒与镉按等摩尔浓度加入(10μmol/L),亚硒酸钠和硒代蛋氨酸均可减轻镉对心肌细胞动作电位参数APA、TP、MDP、Vmax等的影响,但两种硒化合物对动作电位复极化时程的影响表现不一致,前者延长APD,后者未能改变镉对APD的影响。结论 镉能抑制心肌细胞的跨膜电位;亚硒酸钠和硒代蛋氨酸均可不同程度地减轻镉对心肌细胞动作电位的影响。
, 百拇医药
Effect of cadmium on action potentials of cultured myocardiocytes and protective effects of selenium Peng Shuangqing*,Liu Shijie.*Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology,Beijing 100850
Abstract The effect of sodium selenite and selenomethionine on cadmium-induced inhibition of the action potentials was investigated by using ventricular myocardiocytes of Wistar rats in a culture system.It was revealed that cadmium could decrease the action potential parameters such as action potential amplitude(APA),overshoot(OS), threshold potential(TP),maximum diastolic potential(MDP) and maximum rate of depolarization(Vmax),shorten the action potential duration of repolarization(APD) and accelerate the action potential frequency(APF).When Se and Cd were added in equal molarity(10mol/L) simultaneously,both of them significantly decreased APA,TP,MDP,Vmax.However,the effects of these two selenium compounds on APD were different.Sodium selenite prolonged APD whereas selenomethionine failed to prevent the change of APD by cadmium.
, 百拇医药
Key words Cadmium Sodium selenite Selenomethionine Cardiac cell Action potential
体内、外实验均表明:镉(Cd)能引起多种细胞结构和功能的损伤。镉对动物和人的心脏毒性作用已早被确认,但其毒性作用的细胞机制则尚未阐明[1]。本实验在培养的心肌细胞上观察了镉对膜电位的影响,同时观察了亚硒酸钠与硒代蛋氨酸的保护作用,为阐明镉的细胞毒性及硒的保护机制提供初步依据。
材料与方法
1.药品与试剂:CdCl2·2H2O、D,L-硒代蛋氨酸(SeMet)购自美国Sigma公司；亚硒酸钠(Na2SeO3)为上海化学试剂供应厂产品。药品用DMEM培养液稀释至实验所需浓度。
, 百拇医药
2.心肌细胞培养: 新生1~2日龄Wistar大鼠,取心室肌,用含0.1%胰蛋白酶的Hanks液消化分离心肌细胞。将获得的心肌细胞接种于聚苯乙烯培养瓶(德国Greiner Labortechnik Inc)内,培养基为80%DMEM(Dulbecoo＇s Modified Eagle Midium,Life Technologies Inc,美国)与20%小牛血清(军事医学科学院放射医学研究所产品),于37℃、5%CO2的二氧化碳孵箱内进行培养。
3.细胞染毒与加硒处理方法:培养后第4天,引导心肌细胞动作电位为实验前对照后,向培养基中加入不同剂量镉(CdCl2,镉含量为5、10、20 μmol/L)染毒。
加硒保护组:为观察两种不同硒化合物对镉致膜电位抑制的保护效应,硒代蛋氨酸与亚硒酸钠分别与CdCl2按等摩尔浓度同时加入培养瓶中,5分钟后测定心肌细胞动作电位。
, 百拇医药
4.动作电位记录: 培养后第4天,将培养瓶倒置于显微镜(Olympus,日本)的恒温套内,保持pH7.2、36.5℃的细胞外环境,测定心肌细胞动作电位。方法如下:用微推进器(Narishige,日本)将微电极(直径〈0.5 μm,用3 mol/L KCl充灌)插入胞内,将电信号输入计算机进行实时分析处理。分析以下电参数:动作电位波幅(APA)、超射(OS)、最大舒张电位(MDP)、阈电位(TP)、最大除极速度(Vmax)、复极(10%、50%、90%)动作电位时程(APD10、APD50、APD90)及动作电位发放频率(APF)。
5.统计学处理: 多组均数之间的比较用方差分析。
结 果
1.镉对心肌细胞膜电位的影响:镉呈现对心肌细胞跨膜电位的抑制,使标志动作电位特征的各项参数一致减小,而且其抑制效应有明显的剂量依赖性(表1)。
, http://www.100md.com
2.硒对镉致膜电位改变的保护作用：Na2SeO3能降低镉引起心肌膜电位变化的部分参数,APA已基本保持在对照组水平;MDP、Vmax、TP的变化明显小于镉作用所引起的改变,但没有保持在正常对照组水平;动作电位APD,不但没有出现镉引起的减小,还较正常对照组延长。SeMet也能减轻镉对细胞膜电位部分参数的影响,但其效应与Na2SeO3不太一致,它能明显减轻镉对APA、MDP、OS、TP的影响,除Vmax保持在对照组水平外,其它参数均仍小于对照组,但未能改变镉对APD的影响,而且APF还更增高(表2)。
表1 镉对培养心肌细胞膜电位参数的影响(
±s)
Table 1 Effect of cadmium on potentials of cultured myocardiocytes(±s) 组别
, http://www.100md.com
Groups
APA
(mv)
MDP
(mv)
Vmax
(v/s)
OS
(mv)
TP
(mv)
APD10
(ms)
, 百拇医药
APD50
(ms)
APD90
(ms)
APF
(bpm)
Cd(μmol/L)
5.0
(n=22)
60.5±6.7b
41.8±4.7b
, http://www.100md.com 27.1±7.1b
18.7±2.1b
34.9±3.8a
19.8±3.8ab
72.5±1.4b
225.5±127.6b
318±80b
10.0
(n=22)
50.0±2.3c
, 百拇医药
15.8±0.5c
9.8±0.9c
34.2±2.0c
5.7±1.3b
15.6±0.7b
43.3±0.8c
60.6±1.0c
382±8c
20.0
(n=22)
, http://www.100md.com
25.2±3.3d
18.8±2.5d
3.4±0.9d
6.4±1.0d
12.6±2.2c
14.5±4.2b
63.0±5.5d
95.4±7.2ac
321±16b
, 百拇医药 对照组
Control
(n=30)
74.4±4.6a
54.7±5.6a
15.3±1.6a
38.3±3.3a
36.1±3.0a
21.7±11.0a
117.6±8.1a
, http://www.100md.com
140.2±12.4a
146±97a
a、b、c、d: 同一指标不同组间平均数标注不同字母P<0.05、相同字母者差异无显著性
a,b,c,d:Each group with different letter superscript indicates that the means are at 5% level of significance;while with the same letter,not significantly different
, 百拇医药
表2 硒代蛋氨酸与亚硒酸钠对镉致膜电位改变的保护作用(±s)
Table 2 Protective effect of selenium on the changes of action potentials of cultured myocardiocytes induced by cadmium(±s) 组别
Groups
APA
(mv)
MDP
, 百拇医药
(mv)
Vmax
(v/s)
OS
(mv)
TP
(mv)
APD10
(ms)
APD50
(ms)
APD90
, http://www.100md.com
(ms)
APF
(bpm)
Cd(10 μmol/L)+Se(10 μmol/L)
Na2SeO3
(n=31)
78.4±6.4a
40.2±17.6c
11.9±3.5c
29.7±3.5c
, 百拇医药
28.4±15.9c
27.3±8.1c
145.0±43.4c
221.7±66.0c
162±58a
SeMet
(n=20)
63.3±5.8c
44.2±3.9c
15.7±4.4a
, http://www.100md.com
21.2±4.4d
33.5±2.5dc
14.0±6.4b
47.7±22.6b
70.9±32.0b
468±155c
Cd
(10μmol/L)
(n=22)
50.0±2.3b
, 百拇医药
15.8±0.5b
9.8±0.9b
34.2±2.0b
5.7±1.3b
15.6±0.7b
43.3±0.8b
60.6±1.0b
382±8b
对照组
Control
, 百拇医药
(n=30)
74.4±4.6a
54.7±5.6a
15.3±1.6a
38.3±3.3a
36.1±3.0ad
21.7±11.0a
117.6±8.1a
140.2±12.4a
146±97a
, 百拇医药
a、b、c、d: 同一指标不同组间平均数标注不同字母P<0.05、相同字母者差异无显著性
a,b,c,d: Each group with different letter superscript indicates that the means are at 5% level of significance;while with the same letter,not significantly different
讨 论
本实验在培养心肌细胞上观察了镉对膜电位的影响。结果表明：镉呈现对心肌细胞跨膜电位的抑制,使标志动作电位特征的各项参数一致减小,而且其抑制效应有明显的剂量依赖性。心室肌细胞在培养过程中,已由快反应非自律细胞转化为慢反应自律细胞,其零期去极的离子电流不是INa+,而是ICa2+[2] 。因此,镉对培养心肌细胞动作电位的抑制表明:镉具有Ca2+通道的阻滞作用。
, http://www.100md.com
本实验在培养心肌细胞中表明：硒可减轻镉对心肌膜电位的影响。硒拮抗镉的毒性作用机制目前尚未阐明,但主要有4种不同的认识：(1)硒有很强的与重金属形成复合物的能力,硒对镉毒性的拮抗作用是由于硒与镉在体内形成复合物;(2)硒发挥抗氧化作用,减轻镉的毒性;(3)硒能促进镉从体内排泄;(4)硒可诱导金属硫蛋白的产生,与镉形成低毒性复合物[3] 。本实验比较了两种硒化合物对镉致心肌膜电位影响的保护作用,结果显示:两种硒化合物均能减轻镉对膜电位的影响。因本实验是直接在心肌细胞上观察硒、镉同时加入后的效应,由此可以初步排除硒通过促进镉的排泄、诱导产生金属硫蛋白等机制而发挥效应。此两种硒化合物虽均能减轻镉对膜电位的影响,但均未能完全拮抗镉的毒性,而且两种硒化合物的作用还不一致,即亚硒酸钠能减轻镉对心肌细胞膜电位参数APA、MDP、TP、Vmax的影响,动作电位发放频率也基本在对照组水平；但对复极化时程的影响,镉单独作用时引起APD缩短,而与亚硒酸钠联合作用时,其APD明显延长;硒代蛋氨酸也能减轻镉对心肌细胞膜电位参数APA、MDP、TP、Vmax的影响,但硒代蛋氨酸和镉联合作用与镉单独作用比较,对APD的改变并无影响,动作电位发放频率也仍然维持在较高水平。亚硒酸钠和代蛋氨酸的这种效应差异的机制有待进一步探讨。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助
参 考 文 献
1 Kisling GM,Kopp SJ,Paulson DJ,et al.Cadmium-induced attenuation of coronary blood flow in the perfused rat heart.Toxicol Appl Pharmacol,1993,118:58~64.
2 Schanne OF,Bkaily G.Explanted cardiac cells:a model to study drug action? Can J Physiol Pharmacol,1981,59:443~467.
3 Wahba ZZ,Coogan TP,Rhodes ST,et al.Protective effects of selenium on cadmium toxicity in rats:role of altered toxicokinetics and metallothionein.J Toxicol Environ Health,1993,38:171~182。
(收稿：1997-07-02 修回：1997-12-14), http://www.100md.com
单位：100850北京,军事医学科学院毒物药物研究所(彭双清);北京医科大学公共卫生学院(刘世杰)
关键词：镉；亚硒酸钠；硒代蛋氨酸；心肌细胞；动作电位
中华劳动卫生职业病杂志/980110Effect of Cadmium on Action Potentials of Cultured Myocardiocytes
and Protective Effects of Selenium
Peng Shuangqing,Liu Shijie
摘要 目的 探讨镉(Cd)对心肌的毒性作用机制及硒的保护效应。方法 在培养的Wistar大鼠乳鼠心肌细胞上观察了镉对膜电位活动的影响及亚硒酸钠和硒代蛋氨酸的保护作用。结果 镉使心肌细胞动作电位幅值(APA)、超射(OS)、阈电位(TP)、最大舒张电位(MDP)及最大除极速率(Vmax)显著降低;复极化时程(APD)明显缩短;动作电位发放频率(APF)明显加快。硒与镉按等摩尔浓度加入(10μmol/L),亚硒酸钠和硒代蛋氨酸均可减轻镉对心肌细胞动作电位参数APA、TP、MDP、Vmax等的影响,但两种硒化合物对动作电位复极化时程的影响表现不一致,前者延长APD,后者未能改变镉对APD的影响。结论 镉能抑制心肌细胞的跨膜电位;亚硒酸钠和硒代蛋氨酸均可不同程度地减轻镉对心肌细胞动作电位的影响。
, 百拇医药
Effect of cadmium on action potentials of cultured myocardiocytes and protective effects of selenium Peng Shuangqing*,Liu Shijie.*Beijing Institute of Pharmacology and Toxicology,Beijing 100850
Abstract The effect of sodium selenite and selenomethionine on cadmium-induced inhibition of the action potentials was investigated by using ventricular myocardiocytes of Wistar rats in a culture system.It was revealed that cadmium could decrease the action potential parameters such as action potential amplitude(APA),overshoot(OS), threshold potential(TP),maximum diastolic potential(MDP) and maximum rate of depolarization(Vmax),shorten the action potential duration of repolarization(APD) and accelerate the action potential frequency(APF).When Se and Cd were added in equal molarity(10mol/L) simultaneously,both of them significantly decreased APA,TP,MDP,Vmax.However,the effects of these two selenium compounds on APD were different.Sodium selenite prolonged APD whereas selenomethionine failed to prevent the change of APD by cadmium.
, 百拇医药
Key words Cadmium Sodium selenite Selenomethionine Cardiac cell Action potential
体内、外实验均表明:镉(Cd)能引起多种细胞结构和功能的损伤。镉对动物和人的心脏毒性作用已早被确认,但其毒性作用的细胞机制则尚未阐明[1]。本实验在培养的心肌细胞上观察了镉对膜电位的影响,同时观察了亚硒酸钠与硒代蛋氨酸的保护作用,为阐明镉的细胞毒性及硒的保护机制提供初步依据。
材料与方法
1.药品与试剂:CdCl2·2H2O、D,L-硒代蛋氨酸(SeMet)购自美国Sigma公司；亚硒酸钠(Na2SeO3)为上海化学试剂供应厂产品。药品用DMEM培养液稀释至实验所需浓度。
, 百拇医药
2.心肌细胞培养: 新生1~2日龄Wistar大鼠,取心室肌,用含0.1%胰蛋白酶的Hanks液消化分离心肌细胞。将获得的心肌细胞接种于聚苯乙烯培养瓶(德国Greiner Labortechnik Inc)内,培养基为80%DMEM(Dulbecoo＇s Modified Eagle Midium,Life Technologies Inc,美国)与20%小牛血清(军事医学科学院放射医学研究所产品),于37℃、5%CO2的二氧化碳孵箱内进行培养。
3.细胞染毒与加硒处理方法:培养后第4天,引导心肌细胞动作电位为实验前对照后,向培养基中加入不同剂量镉(CdCl2,镉含量为5、10、20 μmol/L)染毒。
加硒保护组:为观察两种不同硒化合物对镉致膜电位抑制的保护效应,硒代蛋氨酸与亚硒酸钠分别与CdCl2按等摩尔浓度同时加入培养瓶中,5分钟后测定心肌细胞动作电位。
, 百拇医药
4.动作电位记录: 培养后第4天,将培养瓶倒置于显微镜(Olympus,日本)的恒温套内,保持pH7.2、36.5℃的细胞外环境,测定心肌细胞动作电位。方法如下:用微推进器(Narishige,日本)将微电极(直径〈0.5 μm,用3 mol/L KCl充灌)插入胞内,将电信号输入计算机进行实时分析处理。分析以下电参数:动作电位波幅(APA)、超射(OS)、最大舒张电位(MDP)、阈电位(TP)、最大除极速度(Vmax)、复极(10%、50%、90%)动作电位时程(APD10、APD50、APD90)及动作电位发放频率(APF)。
5.统计学处理: 多组均数之间的比较用方差分析。
结 果
1.镉对心肌细胞膜电位的影响:镉呈现对心肌细胞跨膜电位的抑制,使标志动作电位特征的各项参数一致减小,而且其抑制效应有明显的剂量依赖性(表1)。
, http://www.100md.com
2.硒对镉致膜电位改变的保护作用：Na2SeO3能降低镉引起心肌膜电位变化的部分参数,APA已基本保持在对照组水平;MDP、Vmax、TP的变化明显小于镉作用所引起的改变,但没有保持在正常对照组水平;动作电位APD,不但没有出现镉引起的减小,还较正常对照组延长。SeMet也能减轻镉对细胞膜电位部分参数的影响,但其效应与Na2SeO3不太一致,它能明显减轻镉对APA、MDP、OS、TP的影响,除Vmax保持在对照组水平外,其它参数均仍小于对照组,但未能改变镉对APD的影响,而且APF还更增高(表2)。
表1 镉对培养心肌细胞膜电位参数的影响(
±s)Table 1 Effect of cadmium on potentials of cultured myocardiocytes(
±s) 组别, http://www.100md.com
Groups
APA
(mv)
MDP
(mv)
Vmax
(v/s)
OS
(mv)
TP
(mv)
APD10
(ms)
, 百拇医药
APD50
(ms)
APD90
(ms)
APF
(bpm)
Cd(μmol/L)
5.0
(n=22)
60.5±6.7b
41.8±4.7b
, http://www.100md.com 27.1±7.1b
18.7±2.1b
34.9±3.8a
19.8±3.8ab
72.5±1.4b
225.5±127.6b
318±80b
10.0
(n=22)
50.0±2.3c
, 百拇医药
15.8±0.5c
9.8±0.9c
34.2±2.0c
5.7±1.3b
15.6±0.7b
43.3±0.8c
60.6±1.0c
382±8c
20.0
(n=22)
, http://www.100md.com
25.2±3.3d
18.8±2.5d
3.4±0.9d
6.4±1.0d
12.6±2.2c
14.5±4.2b
63.0±5.5d
95.4±7.2ac
321±16b
, 百拇医药 对照组
Control
(n=30)
74.4±4.6a
54.7±5.6a
15.3±1.6a
38.3±3.3a
36.1±3.0a
21.7±11.0a
117.6±8.1a
, http://www.100md.com
140.2±12.4a
146±97a
a、b、c、d: 同一指标不同组间平均数标注不同字母P<0.05、相同字母者差异无显著性
a,b,c,d:Each group with different letter superscript indicates that the means are at 5% level of significance;while with the same letter,not significantly different
, 百拇医药
表2 硒代蛋氨酸与亚硒酸钠对镉致膜电位改变的保护作用(
±s)Table 2 Protective effect of selenium on the changes of action potentials of cultured myocardiocytes induced by cadmium(
±s) 组别Groups
APA
(mv)
MDP
, 百拇医药
(mv)
Vmax
(v/s)
OS
(mv)
TP
(mv)
APD10
(ms)
APD50
(ms)
APD90
, http://www.100md.com
(ms)
APF
(bpm)
Cd(10 μmol/L)+Se(10 μmol/L)
Na2SeO3
(n=31)
78.4±6.4a
40.2±17.6c
11.9±3.5c
29.7±3.5c
, 百拇医药
28.4±15.9c
27.3±8.1c
145.0±43.4c
221.7±66.0c
162±58a
SeMet
(n=20)
63.3±5.8c
44.2±3.9c
15.7±4.4a
, http://www.100md.com
21.2±4.4d
33.5±2.5dc
14.0±6.4b
47.7±22.6b
70.9±32.0b
468±155c
Cd
(10μmol/L)
(n=22)
50.0±2.3b
, 百拇医药
15.8±0.5b
9.8±0.9b
34.2±2.0b
5.7±1.3b
15.6±0.7b
43.3±0.8b
60.6±1.0b
382±8b
对照组
Control
, 百拇医药
(n=30)
74.4±4.6a
54.7±5.6a
15.3±1.6a
38.3±3.3a
36.1±3.0ad
21.7±11.0a
117.6±8.1a
140.2±12.4a
146±97a
, 百拇医药
a、b、c、d: 同一指标不同组间平均数标注不同字母P<0.05、相同字母者差异无显著性
a,b,c,d: Each group with different letter superscript indicates that the means are at 5% level of significance;while with the same letter,not significantly different
讨 论
本实验在培养心肌细胞上观察了镉对膜电位的影响。结果表明：镉呈现对心肌细胞跨膜电位的抑制,使标志动作电位特征的各项参数一致减小,而且其抑制效应有明显的剂量依赖性。心室肌细胞在培养过程中,已由快反应非自律细胞转化为慢反应自律细胞,其零期去极的离子电流不是INa+,而是ICa2+[2] 。因此,镉对培养心肌细胞动作电位的抑制表明:镉具有Ca2+通道的阻滞作用。
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本实验在培养心肌细胞中表明：硒可减轻镉对心肌膜电位的影响。硒拮抗镉的毒性作用机制目前尚未阐明,但主要有4种不同的认识：(1)硒有很强的与重金属形成复合物的能力,硒对镉毒性的拮抗作用是由于硒与镉在体内形成复合物;(2)硒发挥抗氧化作用,减轻镉的毒性;(3)硒能促进镉从体内排泄;(4)硒可诱导金属硫蛋白的产生,与镉形成低毒性复合物[3] 。本实验比较了两种硒化合物对镉致心肌膜电位影响的保护作用,结果显示:两种硒化合物均能减轻镉对膜电位的影响。因本实验是直接在心肌细胞上观察硒、镉同时加入后的效应,由此可以初步排除硒通过促进镉的排泄、诱导产生金属硫蛋白等机制而发挥效应。此两种硒化合物虽均能减轻镉对膜电位的影响,但均未能完全拮抗镉的毒性,而且两种硒化合物的作用还不一致,即亚硒酸钠能减轻镉对心肌细胞膜电位参数APA、MDP、TP、Vmax的影响,动作电位发放频率也基本在对照组水平；但对复极化时程的影响,镉单独作用时引起APD缩短,而与亚硒酸钠联合作用时,其APD明显延长;硒代蛋氨酸也能减轻镉对心肌细胞膜电位参数APA、MDP、TP、Vmax的影响,但硒代蛋氨酸和镉联合作用与镉单独作用比较,对APD的改变并无影响,动作电位发放频率也仍然维持在较高水平。亚硒酸钠和代蛋氨酸的这种效应差异的机制有待进一步探讨。
, 百拇医药
本课题受国家自然科学基金资助
参 考 文 献
1 Kisling GM,Kopp SJ,Paulson DJ,et al.Cadmium-induced attenuation of coronary blood flow in the perfused rat heart.Toxicol Appl Pharmacol,1993,118:58~64.
2 Schanne OF,Bkaily G.Explanted cardiac cells:a model to study drug action? Can J Physiol Pharmacol,1981,59:443~467.
3 Wahba ZZ,Coogan TP,Rhodes ST,et al.Protective effects of selenium on cadmium toxicity in rats:role of altered toxicokinetics and metallothionein.J Toxicol Environ Health,1993,38:171~182。
(收稿：1997-07-02 修回：1997-12-14), http://www.100md.com