职业性肺癌中热应激蛋白70、热应激蛋白27与p53表达的相关性研究
作者：张永幸 贺涵贞 邬堂春 海涛 鲁翠荣 张国高
单位：
关键词：职业性肺癌；热应激蛋白；抑癌基因
中华劳动卫生职业病杂志980207 【摘要】 目的 探讨HSPs(heat stress proteins)与抑癌基因在职业性肺癌(occupational lung cancer,OLC)癌变过程中相互关系及其作用机制。方法 采用免疫组化技术，观察了HSP70与p53在OLC中的表达情况。结果 OLC中的HSP70表达较癌旁组织和正常肺组织高，且表达部位有一定特异性；OLC中HSP70与p53有共同表达，显示两者在OLC中的癌变过程中有联合作用。结论 在OLC的发生发展过程中HSP70与抑癌基因有着密切的内在联系。
Study on the expression of HSP70,HSP27 and p53 in occupational lung cancer Zhang Yongxing,He Hanzhen,Wu Tangchun,et al.Institute of Occupational Medicine,Tongji Medical University 430030
, 百拇医药
Abstract This study is to investigate the molecular changes of occupational lung cancer(OLC).Heat stress protein70,27 and antioncogene p53 in occupational lung cancer and normal lung tissue were measured by immuno-histochemistry.The results showed:the expression of HSPs in OLC was higher than in normal lung tissue,and there was specificity of their distribution in OLC.The coexpression of HSPs and p53 in OLC suggested that HSPs and p53 may have combined effect.It is concluded that there is internal relation between HSPs and antioncogene in the carcinogenesis of OLC.
, 百拇医药
Key words Occupational lung cancer Heat stress proteins Antioncogene
近年来国内外学者发现:HSPs(主要为HSP70，HSP27)可通过与癌基因、抑癌基因及其产物的相互作用，调节细胞增殖[1]，在一些肿瘤如肺癌、胰腺癌等癌组织中有不同程度的表达。对HSPs与癌基因、抑癌基因进行相关性研究，不仅使人们对环境和职业性肺癌的病因及发病机制有更深入的认识，而且在其早期诊断、预后判断和治疗等方面有着广泛的应用前景。
材料与方法
一、实验材料
从广西铜坑、长坡、巴里、栗木4个锡矿1975～1995年间诊断的职业性肺癌(OLC)103例中挑选出20例有完整职业史、生活史以及临床、病理资料和有手术标本的存档蜡块的病例，所有患者术前未经任何治疗。20例均为非小细胞肺癌(以下简称NSCLC)，其中鳞癌10例，腺癌5例，腺鳞癌4例，支气管肺泡癌1例，患者均为男性，年龄为40～62岁。全部病例均进行临床信访，其中5例有信访结果。20例存档蜡块按常规切片(4～5 μm)、捞片于涂有APES(一种新型玻片粘贴剂)防脱片胶的干净载玻片上，50℃温和烤片1小时，置切片盒内备用。
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二、实验方法
1.主要试剂有鼠抗人p53单克隆抗体(Dako)，兔抗人HSP27、HSP70抗体(由加拿大拉瓦尔大学遗传学研究所与本实验室共同研制)。使用的每种一抗在参照说明书的基础上均首先作预备试验，测定其最适反应浓度。染色方法均为SABC法。即用型SABC试剂盒为博士德公司产品。SABC法与传统的ABC.PAP法比较具有染色时间短、特异性强、背景更清晰、节省抗体、成本低等优点。每次实验均以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性组织作阳性对照。
2.观察标准和结果判定：“-”为没有着色细胞；“±”为可见浅褐色，但×400放大5个视野内见不到颗粒；“+”为1个/5×400视野可见到稀疏颗粒；“++”为2～4个以上视野可见到颗粒；+++”为每个视野均可见到迷漫性颗粒。为更客观评价染色结果，均用富士彩色翻转片拍成幻灯片，两人共同评价。“±”亦视为阴性，“+、++、+++”均为阳性。
3.统计学处理：分别对其阳性率采用两两比较的四格表的确切概率法检验。
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结 果
HSP70、HSP27在癌组织中的表达阳性率分别为70%(14/20)、85%(17/20)。HSP70、HSP27阳性颗粒主要位于癌细胞之胞浆内，其阳性强度：鳞癌(+)，腺鳞癌(++)，腺癌、支气管肺泡癌(+++)。HSP70在腺癌、支气管肺泡癌中既有胞浆又有胞核内的阳性表达(图1)；HSP27在正常肺组织中表达与HSP70一致，即仅存在于细支气管纤毛柱状上皮之胞浆内(图2)；但在肺癌组织中阳性颗粒仅存在于胞浆中，无核内表达(图3)，在正常肺泡上皮、间质中未见HSP70、HSP27表达。p53主要定位于癌细胞胞核内(图4)，在鳞状细胞癌、腺鳞癌、腺癌中阳性强度无明显改变，均为(++)。正常肺组织未见阳性表达。在同一肺癌标本切片上，往往可见既有HSP70、HSP27又有p53的阳性表达，且三者的表达有密切的联系。
图1 职业性支气管肺泡癌之癌细胞胞浆和胞核内均可见有HSP70阳性表达(棕色颗粒↑) SABC×20 图2 正常细支气管纤毛上皮胞浆内见有HSP70阳性表达(棕色颗粒↑) SABC×20 图3 OLC鳞状细胞癌之癌细胞仅是胞浆内有HSP27阳性表达(棕色颗粒↑) SABC×20 图4 职业性支气管肺泡癌之癌细胞胞核内见有p53阳性表达(棕色颗粒↑) SABC×20
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Fig 1 The positive expression of HSP70 (the brown particles ↑) in both cytoplasm and nucleus of the cells of occupational bronchioalveolus cancer SABC×20 Fig 2 The positive expression (the brown particles ↑) in cytoplasm of normal bronchiole ciliated epithelial cells SABC×20 Fig 3 The positive expression of (the brown particles ↑) HSP27 in cytoplasm of the cell of occupational squamous-cell carcinoma SABC×20 Fig 4 The positive expression (the brown particles ↑) of p53 in nucleus of the cells of occupational bronchio alveolus cancer SABC×20
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讨 论
p53基因突变是至今已知的与人类癌症相关的最普遍的基因异常，p53基因的功能是抑制细胞生长，从而具有抑制肿瘤发生的作用。如果p53发生突变，其抑制细胞生长的功能就会丧失，同时突变的p53还会刺激或促进癌细胞生长。人类癌症中约有50%表现出p53基因的失活与突变。因此，p53基因异常是人类癌症的最常见的分子变化，也是目前肿瘤研究的焦点。近年来国外学者发现：HSPs可通过与癌基因、抑癌基因及其产物的相互作用，调节细胞增殖[2]。HSP70蛋白可以选择性地和突变型p53形成复合物[3，4]，HSP70在突变型p53转变为野生型p53的表型调节方面起一定作用。如果p53发生突变，编码的突变型p53结构发生改变，便不能激活HSP70内在的ATPase活力。有实验表明：HSP70可与突变型p53形成稳定复合物，其结合比例约为1∶3.5。p53蛋白羧基末端的28个氨基酸以及保守Ⅰ区的17个氨基酸是HSP70的结合位点[5，6]。
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澳大利亚Lee对42例胰腺癌活检标本进行了免疫组化研究，对照为慢性胰腺炎组织和正常胰腺组织，结果发现大多数胰腺癌组织(57%)共同表达HSP70和p53蛋白，慢性胰腺炎仅2%有HSP70和p53共同表达，正常胰腺组织仅1%表现为核内有p53蛋白，胞浆中有HSP70，即不存在共同的部位。在胰腺癌中HSP70和p53的共存率高说明这种肿瘤的p53突变率高，可作为癌的诊断指标。
我们应用免疫组化对正常肺组织、非职业相关性肺癌和职业相关性肺癌组织(包括有癌旁、支气管不典型增生、原位癌、浸润癌)进行了HSP70、HSP27、p53多基因表达的同步检测，结果表明突变的p53蛋白常与HSP70以复合物的形式存在于癌细胞核内，两者在正常、癌旁以及不典型增生和浸润癌的表达呈递增形式；而且观察到HSP70在正常肺组织中主要定位于支气管和细支气管上皮细胞胞浆内，其意义可能与此类细胞更接近外界致癌因子或对外界致癌因子较敏感有关。然而以上研究均只检测了基因有无表达，尚不能确定基因突变的位点和性质，下一步我室将在国内外 对p53和HSP70研究的最新成果基础上，应用PCRSSCP技术、DNA测序以及荧光原位分子杂交(FISH)技术来检测p53和HSP70基因在职业相关性肺癌癌变过程中的定性、定量动态变化，以探索p53和HSP70作为对接触致癌因子的厂矿职工进行健康监护的指标，为职业相关性肺癌的早期发现、早期诊断提供新手段。
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参 考 文 献
1 张国高，贺涵贞，吴扬，等.职业卫生中热休克蛋白的研究.基础医学与临床，1995，15(2)：7～10.
2 Thmos MC,Friederike MP,Christoph W,et al.Differential expression of HSPs in pancreatic carcinoma.Cancer Res,1994,54:547～549.
3 Agoff SN.Regulation of human HSP70 promoter by p53.Science,1994,259:84～91.
4 Elledge RM,Clark GM.p53 protein accumulative detected by five different antibodies:relationship to progress and HSP70 in breast cancer.Cancer Res,1994,54:3752.
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5 Orit PK,Dan M.Specific interaction between the p53 cellular tumour antigen and major heat shock proteins.Nature,1986,320:182～185.
6 Finlay CA,Hinds PW,Tan TH.Activating mutations for transformation by p53 produce a gene product that forms an HSP70-p53 complex with an altered half-life.Mol Cell Biol,1988,8:531～539.
(收稿：1997-05-08 修回：1998-01-26), 百拇医药
单位：
关键词：职业性肺癌；热应激蛋白；抑癌基因
中华劳动卫生职业病杂志980207 【摘要】 目的 探讨HSPs(heat stress proteins)与抑癌基因在职业性肺癌(occupational lung cancer,OLC)癌变过程中相互关系及其作用机制。方法 采用免疫组化技术，观察了HSP70与p53在OLC中的表达情况。结果 OLC中的HSP70表达较癌旁组织和正常肺组织高，且表达部位有一定特异性；OLC中HSP70与p53有共同表达，显示两者在OLC中的癌变过程中有联合作用。结论 在OLC的发生发展过程中HSP70与抑癌基因有着密切的内在联系。
Study on the expression of HSP70,HSP27 and p53 in occupational lung cancer Zhang Yongxing,He Hanzhen,Wu Tangchun,et al.Institute of Occupational Medicine,Tongji Medical University 430030
, 百拇医药
Abstract This study is to investigate the molecular changes of occupational lung cancer(OLC).Heat stress protein70,27 and antioncogene p53 in occupational lung cancer and normal lung tissue were measured by immuno-histochemistry.The results showed:the expression of HSPs in OLC was higher than in normal lung tissue,and there was specificity of their distribution in OLC.The coexpression of HSPs and p53 in OLC suggested that HSPs and p53 may have combined effect.It is concluded that there is internal relation between HSPs and antioncogene in the carcinogenesis of OLC.
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Key words Occupational lung cancer Heat stress proteins Antioncogene
近年来国内外学者发现:HSPs(主要为HSP70，HSP27)可通过与癌基因、抑癌基因及其产物的相互作用，调节细胞增殖[1]，在一些肿瘤如肺癌、胰腺癌等癌组织中有不同程度的表达。对HSPs与癌基因、抑癌基因进行相关性研究，不仅使人们对环境和职业性肺癌的病因及发病机制有更深入的认识，而且在其早期诊断、预后判断和治疗等方面有着广泛的应用前景。
材料与方法
一、实验材料
从广西铜坑、长坡、巴里、栗木4个锡矿1975～1995年间诊断的职业性肺癌(OLC)103例中挑选出20例有完整职业史、生活史以及临床、病理资料和有手术标本的存档蜡块的病例，所有患者术前未经任何治疗。20例均为非小细胞肺癌(以下简称NSCLC)，其中鳞癌10例，腺癌5例，腺鳞癌4例，支气管肺泡癌1例，患者均为男性，年龄为40～62岁。全部病例均进行临床信访，其中5例有信访结果。20例存档蜡块按常规切片(4～5 μm)、捞片于涂有APES(一种新型玻片粘贴剂)防脱片胶的干净载玻片上，50℃温和烤片1小时，置切片盒内备用。
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二、实验方法
1.主要试剂有鼠抗人p53单克隆抗体(Dako)，兔抗人HSP27、HSP70抗体(由加拿大拉瓦尔大学遗传学研究所与本实验室共同研制)。使用的每种一抗在参照说明书的基础上均首先作预备试验，测定其最适反应浓度。染色方法均为SABC法。即用型SABC试剂盒为博士德公司产品。SABC法与传统的ABC.PAP法比较具有染色时间短、特异性强、背景更清晰、节省抗体、成本低等优点。每次实验均以PBS代替一抗作阴性对照，用已知阳性组织作阳性对照。
2.观察标准和结果判定：“-”为没有着色细胞；“±”为可见浅褐色，但×400放大5个视野内见不到颗粒；“+”为1个/5×400视野可见到稀疏颗粒；“++”为2～4个以上视野可见到颗粒；+++”为每个视野均可见到迷漫性颗粒。为更客观评价染色结果，均用富士彩色翻转片拍成幻灯片，两人共同评价。“±”亦视为阴性，“+、++、+++”均为阳性。
3.统计学处理：分别对其阳性率采用两两比较的四格表的确切概率法检验。
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结 果
HSP70、HSP27在癌组织中的表达阳性率分别为70%(14/20)、85%(17/20)。HSP70、HSP27阳性颗粒主要位于癌细胞之胞浆内，其阳性强度：鳞癌(+)，腺鳞癌(++)，腺癌、支气管肺泡癌(+++)。HSP70在腺癌、支气管肺泡癌中既有胞浆又有胞核内的阳性表达(图1)；HSP27在正常肺组织中表达与HSP70一致，即仅存在于细支气管纤毛柱状上皮之胞浆内(图2)；但在肺癌组织中阳性颗粒仅存在于胞浆中，无核内表达(图3)，在正常肺泡上皮、间质中未见HSP70、HSP27表达。p53主要定位于癌细胞胞核内(图4)，在鳞状细胞癌、腺鳞癌、腺癌中阳性强度无明显改变，均为(++)。正常肺组织未见阳性表达。在同一肺癌标本切片上，往往可见既有HSP70、HSP27又有p53的阳性表达，且三者的表达有密切的联系。
图1 职业性支气管肺泡癌之癌细胞胞浆和胞核内均可见有HSP70阳性表达(棕色颗粒↑) SABC×20 图2 正常细支气管纤毛上皮胞浆内见有HSP70阳性表达(棕色颗粒↑) SABC×20 图3 OLC鳞状细胞癌之癌细胞仅是胞浆内有HSP27阳性表达(棕色颗粒↑) SABC×20 图4 职业性支气管肺泡癌之癌细胞胞核内见有p53阳性表达(棕色颗粒↑) SABC×20
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Fig 1 The positive expression of HSP70 (the brown particles ↑) in both cytoplasm and nucleus of the cells of occupational bronchioalveolus cancer SABC×20 Fig 2 The positive expression (the brown particles ↑) in cytoplasm of normal bronchiole ciliated epithelial cells SABC×20 Fig 3 The positive expression of (the brown particles ↑) HSP27 in cytoplasm of the cell of occupational squamous-cell carcinoma SABC×20 Fig 4 The positive expression (the brown particles ↑) of p53 in nucleus of the cells of occupational bronchio alveolus cancer SABC×20
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讨 论
p53基因突变是至今已知的与人类癌症相关的最普遍的基因异常，p53基因的功能是抑制细胞生长，从而具有抑制肿瘤发生的作用。如果p53发生突变，其抑制细胞生长的功能就会丧失，同时突变的p53还会刺激或促进癌细胞生长。人类癌症中约有50%表现出p53基因的失活与突变。因此，p53基因异常是人类癌症的最常见的分子变化，也是目前肿瘤研究的焦点。近年来国外学者发现：HSPs可通过与癌基因、抑癌基因及其产物的相互作用，调节细胞增殖[2]。HSP70蛋白可以选择性地和突变型p53形成复合物[3，4]，HSP70在突变型p53转变为野生型p53的表型调节方面起一定作用。如果p53发生突变，编码的突变型p53结构发生改变，便不能激活HSP70内在的ATPase活力。有实验表明：HSP70可与突变型p53形成稳定复合物，其结合比例约为1∶3.5。p53蛋白羧基末端的28个氨基酸以及保守Ⅰ区的17个氨基酸是HSP70的结合位点[5，6]。
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澳大利亚Lee对42例胰腺癌活检标本进行了免疫组化研究，对照为慢性胰腺炎组织和正常胰腺组织，结果发现大多数胰腺癌组织(57%)共同表达HSP70和p53蛋白，慢性胰腺炎仅2%有HSP70和p53共同表达，正常胰腺组织仅1%表现为核内有p53蛋白，胞浆中有HSP70，即不存在共同的部位。在胰腺癌中HSP70和p53的共存率高说明这种肿瘤的p53突变率高，可作为癌的诊断指标。
我们应用免疫组化对正常肺组织、非职业相关性肺癌和职业相关性肺癌组织(包括有癌旁、支气管不典型增生、原位癌、浸润癌)进行了HSP70、HSP27、p53多基因表达的同步检测，结果表明突变的p53蛋白常与HSP70以复合物的形式存在于癌细胞核内，两者在正常、癌旁以及不典型增生和浸润癌的表达呈递增形式；而且观察到HSP70在正常肺组织中主要定位于支气管和细支气管上皮细胞胞浆内，其意义可能与此类细胞更接近外界致癌因子或对外界致癌因子较敏感有关。然而以上研究均只检测了基因有无表达，尚不能确定基因突变的位点和性质，下一步我室将在国内外 对p53和HSP70研究的最新成果基础上，应用PCRSSCP技术、DNA测序以及荧光原位分子杂交(FISH)技术来检测p53和HSP70基因在职业相关性肺癌癌变过程中的定性、定量动态变化，以探索p53和HSP70作为对接触致癌因子的厂矿职工进行健康监护的指标，为职业相关性肺癌的早期发现、早期诊断提供新手段。
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参 考 文 献
1 张国高，贺涵贞，吴扬，等.职业卫生中热休克蛋白的研究.基础医学与临床，1995，15(2)：7～10.
2 Thmos MC,Friederike MP,Christoph W,et al.Differential expression of HSPs in pancreatic carcinoma.Cancer Res,1994,54:547～549.
3 Agoff SN.Regulation of human HSP70 promoter by p53.Science,1994,259:84～91.
4 Elledge RM,Clark GM.p53 protein accumulative detected by five different antibodies:relationship to progress and HSP70 in breast cancer.Cancer Res,1994,54:3752.
, http://www.100md.com
5 Orit PK,Dan M.Specific interaction between the p53 cellular tumour antigen and major heat shock proteins.Nature,1986,320:182～185.
6 Finlay CA,Hinds PW,Tan TH.Activating mutations for transformation by p53 produce a gene product that forms an HSP70-p53 complex with an altered half-life.Mol Cell Biol,1988,8:531～539.
(收稿：1997-05-08 修回：1998-01-26), 百拇医药