胆红素抗间二硝基苯所致氧化作用的研究
作者：张金华 沈惠麒
单位：100083 北京医科大学劳动卫生学教研室
关键词：间二硝基苯；胆红素；抗氧化作用
中华劳动卫生职业病杂志980302
【摘要】 目的 研究胆红素的抗氧化作用。方法 在间二硝基苯(m-DNB)诱导大鼠氧化损伤模型的基础上，采用正交试验设计方差分析，观察不同时间、不同浓度的胆红素的抗氧化作用。结果 经胆红素预处理后，大鼠肝细胞丙二醛(MDA)含量降低，、.OH的产生量减少，差异有显著性(P0.01)。 结论 胆红素有可能通过抑制脂质过氧化、清除自由基和GSH发生联合抗氧化作用。
, http://www.100md.com
The antioxidative effects of bilirubin on the oxidative damage induced by m-DNB in rat livercells Zhang Jinhua,Shen Huiqi,Beijing Medical University,Beijing 100083
【Abstract】 Objective The antioxidative effect of bilirubin on the rat model of oxidative damage to liver induced by m-DNB was studied. Methods Orthogonal design was used in the study to observe the antioxi dative effects of bilirubin at different exposed doses during different periods. Results The contents of MDA decreased,the level of the productions of superoxide radicals and hydroxy free radicals dropped in rat hepatocytes pretreated with bilirubin,and the differences were significant. Conclusion The study supported that the bilirubin might play a combined antioxidative role with GSH by inhibiting the lipid peroxidation and eliminating the free radicals,and provide a new clue to the prevention of the m-DNB related hazards.
, 百拇医药
【Key words】 m-DNB Bilirubin Antioxidative effects
近期研究表明：胆红素(Bilirubin,BR)具有多方面的抗氧化作用[1，2]。间二硝基苯(m-dinitrobenzene,m-DNB)主要用于染料和塑料工业。本实验目的是在m-DNB所致肝细胞氧化损伤的基础上，探讨BR的抗氧化性，进一步阐明BR的积极意义，为间二硝基苯及类似化合物的中毒防治提供有益的线索。
材料和方法
1.主要试剂：m-DNB为上海试剂三厂产品，经北京医科大学中心实验室提纯，纯度99%；BR、邻苯二醛(OPT)、硫代巴比妥酸(TBA)、细胞色素C、胶原酶Ⅳ均为Sigma产品；5，5-对硫三硝基苯甲酸(DTNB)为Fluka产品；GSH为SERVA产品；GSSG为BDH产品；RPMI-1640培养基为Gibco产品；胰蛋白酶为E.Merck产品。
, http://www.100md.com
2.动物和染毒：健康雄性Wistar大鼠，体重160～180 g，其肝细胞经分离培养后，选用正交试验设计方案，观察不同时间(0.5、2.0和5.0小时)，不同浓度m-DNB(0.01和0.50 mmol/L)染毒以及不同浓度的BR(0、5和10 μmol/L)作用的相互关系。染毒方法为肝细胞培养24小时后，吸弃培养液，换入含不同浓度的BR的培养液，继续培养16小时，与不同浓度的m-DNB染毒液共同孵育，不同时间后进行分析测定。
3.观察指标和方法：丙二醛(MDA)含量测定采用TBA法,GSH、GSSG含量测定用荧光法[3],谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测定用比色法[4]。超氧阴离子自由基()的检测为细胞色素还原法[5],羟基自由基(·OH)检测为电子顺磁自旋捕获(ESR)法。
, 百拇医药
4.统计方法：t检验、方差分析。
结 果
1.BR预处理对m-DNB所诱发大鼠肝细胞MDA含量的影响：由表1可知，随着染毒时间的延长和剂量的增加，染毒的大鼠肝细胞MDA含量增高，加入BR后，MDA含量下降。方差分析得F0.01(2,18)=6.01，P<0.01。显然m-DNB染毒剂量、时间和BR三因素均与MDA的含量具有高度统计学意义。
表1 胆红素预处理对间二硝基苯诱发大鼠肝细胞MDA含量的影响(±s,n=3)
Table 1 Theeffect of m-DNB on the content of MDA in rat cells pretreatedwith bilirubin(BR)(
±s,n=3)
, http://www.100md.com
时间
Time(h)
间二硝基苯
m-DNB
(mmol/L)
胆红素
BR
(μmol/L)
丙二醛
MDA
(nmol/L×106 cell)
0.5
, http://www.100md.com
0.0
0
0.62±0.08
0.1
5
0.70±0.08
0.5
10
0.83±0.08
2.0
0.0
5
0.75±0.13
, 百拇医药
0.1
10
0.92±0.13
0.5
0
2.08±0.13
5.0
0.0
10
0.96±0.08
0.1
0
7.52±0.08
, http://www.100md.com
0.5
5
1.34±0.08
表1的方差分析结果:变异来源——时间、m-DNB、BR的F值分别为29.67, 31.33和 24.00。
2.BR预处理对m-DNB染毒大鼠肝细胞GSH、GSSG含量及GSH-Px活力的影响：由图1可知：m-DNB染毒2小时，GSH含量最高；至染毒5小时，GSH含量有所下降。随着染毒剂量的增加，GSH的含量升高，经方差分析，F0.01(2,18)=6.01，P<0.01。显然，m-DNB染毒剂量、时间和BR三因素均与GSH的含量具有高度统计学意义。
m-DNB：间二硝基苯; BR：胆红素
, 百拇医药
图1 各因素与大鼠肝细胞GSH含量的关系
Fig 1 The relationship between the exposed factors and the content of GSH in rat hepatocytes
GSSG含量测定结果表明：随着m-DNB染毒剂量的增加和时间的延长，GSSG含量增加；加入BR后，GSSG含量有下降趋势。GSH-Px活力随着m-DNB染毒剂量的增加和时间的延长而下降，加入BR后无明显改变。
3.BR预处理对m-DNB与大鼠肝细胞孵育系统中
含量的影响：由表2可知，10 μmol/LBR预处理后，含0.25～2.0 mmol/L m-DNB与肝细胞孵育系统中,含量均比未经预处理组降低。
, http://www.100md.com
4.BR对m-DNB与大鼠肝细胞孵育系统·OH含量的影响：在m-DNB与大鼠肝细胞孵育系统中，加入10 μmol/L BR后，可见·OH含量明显降低，见表3。
表2 胆红素对间二硝基苯与大鼠肝细胞孵育系统中含量的影响(±s,n=3)
Table 2 Theeffect of m-DNB on the content of in ratliver cells pretreated with bilirubin(±s,n=3)
, 百拇医药
组别
Group(nmol/L/106 cell)
间二硝基苯
m-DNB
胆红素+间二硝基苯
BR+m-DNB
染毒 Exposure
0.01 mmol/L
2.38±0.48
0.26±0.28
, 百拇医药
0.10 mmol/L
3.49±0.28**
3.02±0.27
0.25 mmol/L
5.08±0.28**
3.17±0.27*##
0.50 mmol/L
6.35±0.28**
3.65±0.28**##
1.00 mmol/L
, 百拇医药
9.20±0.55**
5.55±0.27**##
2.00 mmol/L
10.95±0.44**
6.67±0.48**#
对照 Control
1.74±0.27
1.74±0.27
与对照组比，*P<0.05,**P<0.01；同剂量m-DNB比，#P<0.05,##P<0.01
, 百拇医药
*P<0.05,**P<0.01vs.control group； # P<0.05,## P<0.01 vs.corresponding m-DNB
表3 胆红素对m-DNB与大鼠肝细胞孵育系统中·OH含量的影响(±s,n=3)
Table 3 Theeffect of m-DNB on the content of ·OHin rat liver cellspretreated with bilirubin(±s,n=3)
, 百拇医药
组别
Group
·OH 峰高 ·OH Peak(mm)
间二硝基苯
m-DNB
间二硝基苯+胆红素
m-DNB+BR
染毒 Exposure
0.01 mmol/L
31.27±0.97**
21.73±0.59*#
, 百拇医药
0.50 mmol/L
45.50±0.53**
27.87±0.40**##
1.00 mmol/L
52.87±0.71**
32.87±0.71**##
对照 Control
13.07±0.67
13.07±0.67
与对照组比，*P<0.05,**P<0.01； 与m-DNB组比，#P<0.05,##P<0.01
, http://www.100md.com
*P<0.05,**P<0.01 vs.control；#P<0.05,##P<0.01 vs. corresponding m-DNB
讨 论
本实验将大鼠肝细胞用一定浓度(属生理浓度)BR预处理后，与m-DNB共同孵育，观察脂质过氧化及自由基水平的改变，以探讨BR的抗氧化作用。
1.BR对脂质过氧化的抑制作用：Wolfram等[5]实验证实，含还原型辅酶Ⅱ(NADPH)和十二烷基磺酸钠(SDS)的大鼠肝脏微粒体孵育系统中可以产生脂质过氧化产物MDA，而加入一定量的BR预处理，可以有效地防止MDA的产生。Stocker等[2]报道:自由基启动剂二甲基戊腈(AMVN)可以使膜上的亚油酸(LH)发生脂质过氧化。如事先加入20 μmol/L的BR，可以有效地抑制200 μmol/L的亚油酸氢过氧化物的生成。而在此过程中，仅仅消耗了6μmol/L的BR。作者认为:此时的BR有可能与亚油酸竞争性地结合LOO·，部分地抑制自由基链式反应。本实验可见:与m-DNB共同孵育的大鼠肝细胞经BR预处理后，脂质过氧化产物MDA的含量明显低于未处理组，与Stocker等实验结果相符。证明：在体外，BR确实能够保护质膜免受脂质过氧化损伤。
, 百拇医药
2.BR与m-DNB同时加入大鼠肝细胞孵育系统对GSH、GSSG及GSH-Px的影响：从GSH解毒机制可知，GSH可抑制脂质过氧化、清除自由基[6]。本实验对大鼠肝细胞以m-DNB染毒，观察GSH、GSSG及GSH-Px的变化，并观察BR对其影响。结果显示：GSH含量随m-DNB染毒时间的延长先有升高继而降低；随m-DNB剂量的增加而升高；但经BR预处理后与对照组无明显差异。可见，GSH的升高是应激性反应，BR可抑制这种变化。但GSSG的含量仅有下降趋势，对GSH-Px的活力无明显影响。结合前述BR对MDA的抑制作用，可认为BR确实存在抗氧化作用。BR可能是通过与GSH的联合抗氧化作用，保护了GSH，减少了其在抗氧化过程中的消耗。
3.BR对自由基的清除作用：有实验证实胆汁中的BR可以直接清除。刘湘陶等[7]也指出:BR是清除剂。Stocker[2]等认为：BR能强烈地阻断.OH和介导的氧化损伤，直接清除。本实验中，加入10 μmol/L的BR后，大鼠肝细胞由m-DNB所诱发的和·OH的含量明显降低，与上述观点相符。
, 百拇医药
综上所述，在生理浓度下的BR确能抑制脂质过氧化、清除自由基，并可能与GSH有协同作用。
本课题受高等学校博士学科点专项科研基金资助
参 考 文 献
1 Hidalgo FJ,Zamora R,Dillard CJ,et al.Can bilirubin be an index of in vivo oxidative stress?Med Hypothes, 1990,33:207~211.
2 Stocker R,Yamanoto Y,McDonagh AF,et al.Bilirubin is as antioxidant of possible physiological importance. Science,1987,235:1043~1046.
, 百拇医药
3 沈惠麒，赵利英，曲青山.组织中谷胱甘肽的荧光测定法.中华劳动卫生职业病杂志，1988，6：103～105.
4 Greenwald RA.Handbook of methods for oxygen radical research.Boca Raton Florida:CRC Press Inc, 1985.120~147.
5 Wolfram I,Vegh M,Howath I.Bile pigments inhibit microsomal lipid peroxidation.Acta Biochem Biophys Hung，1986,4:307~311.
6 程元恺.谷胱甘肽的解毒作用与毒性代谢物.生物化学与生物物理进展，1994，21：395～399.
7 刘湘陶，孙福禄，赵正文，等.活性氧自由基诱发的胆红素聚合、聚集及稳定自由基的形成. 生物化学杂志，1990，6：437～443.
收稿：1997-01-16 修回：1997-08-18, http://www.100md.com
单位：100083 北京医科大学劳动卫生学教研室
关键词：间二硝基苯；胆红素；抗氧化作用
中华劳动卫生职业病杂志980302
【摘要】 目的 研究胆红素的抗氧化作用。方法 在间二硝基苯(m-DNB)诱导大鼠氧化损伤模型的基础上，采用正交试验设计方差分析，观察不同时间、不同浓度的胆红素的抗氧化作用。结果 经胆红素预处理后，大鼠肝细胞丙二醛(MDA)含量降低，
, http://www.100md.com
The antioxidative effects of bilirubin on the oxidative damage induced by m-DNB in rat livercells Zhang Jinhua,Shen Huiqi,Beijing Medical University,Beijing 100083
【Abstract】 Objective The antioxidative effect of bilirubin on the rat model of oxidative damage to liver induced by m-DNB was studied. Methods Orthogonal design was used in the study to observe the antioxi dative effects of bilirubin at different exposed doses during different periods. Results The contents of MDA decreased,the level of the productions of superoxide radicals and hydroxy free radicals dropped in rat hepatocytes pretreated with bilirubin,and the differences were significant. Conclusion The study supported that the bilirubin might play a combined antioxidative role with GSH by inhibiting the lipid peroxidation and eliminating the free radicals,and provide a new clue to the prevention of the m-DNB related hazards.
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【Key words】 m-DNB Bilirubin Antioxidative effects
近期研究表明：胆红素(Bilirubin,BR)具有多方面的抗氧化作用[1，2]。间二硝基苯(m-dinitrobenzene,m-DNB)主要用于染料和塑料工业。本实验目的是在m-DNB所致肝细胞氧化损伤的基础上，探讨BR的抗氧化性，进一步阐明BR的积极意义，为间二硝基苯及类似化合物的中毒防治提供有益的线索。
材料和方法
1.主要试剂：m-DNB为上海试剂三厂产品，经北京医科大学中心实验室提纯，纯度99%；BR、邻苯二醛(OPT)、硫代巴比妥酸(TBA)、细胞色素C、胶原酶Ⅳ均为Sigma产品；5，5-对硫三硝基苯甲酸(DTNB)为Fluka产品；GSH为SERVA产品；GSSG为BDH产品；RPMI-1640培养基为Gibco产品；胰蛋白酶为E.Merck产品。
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2.动物和染毒：健康雄性Wistar大鼠，体重160～180 g，其肝细胞经分离培养后，选用正交试验设计方案，观察不同时间(0.5、2.0和5.0小时)，不同浓度m-DNB(0.01和0.50 mmol/L)染毒以及不同浓度的BR(0、5和10 μmol/L)作用的相互关系。染毒方法为肝细胞培养24小时后，吸弃培养液，换入含不同浓度的BR的培养液，继续培养16小时，与不同浓度的m-DNB染毒液共同孵育，不同时间后进行分析测定。
3.观察指标和方法：丙二醛(MDA)含量测定采用TBA法,GSH、GSSG含量测定用荧光法[3],谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力测定用比色法[4]。超氧阴离子自由基(
, 百拇医药
4.统计方法：t检验、方差分析。
结 果
1.BR预处理对m-DNB所诱发大鼠肝细胞MDA含量的影响：由表1可知，随着染毒时间的延长和剂量的增加，染毒的大鼠肝细胞MDA含量增高，加入BR后，MDA含量下降。方差分析得F0.01(2,18)=6.01，P<0.01。显然m-DNB染毒剂量、时间和BR三因素均与MDA的含量具有高度统计学意义。
表1 胆红素预处理对间二硝基苯诱发大鼠肝细胞MDA含量的影响(
Table 1 Theeffect of m-DNB on the content of MDA in rat cells pretreatedwith bilirubin(BR)(
±s,n=3), http://www.100md.com
时间
Time(h)
间二硝基苯
m-DNB
(mmol/L)
胆红素
BR
(μmol/L)
丙二醛
MDA
(nmol/L×106 cell)
0.5
, http://www.100md.com
0.0
0
0.62±0.08
0.1
5
0.70±0.08
0.5
10
0.83±0.08
2.0
0.0
5
0.75±0.13
, 百拇医药
0.1
10
0.92±0.13
0.5
0
2.08±0.13
5.0
0.0
10
0.96±0.08
0.1
0
7.52±0.08
, http://www.100md.com
0.5
5
1.34±0.08
表1的方差分析结果:变异来源——时间、m-DNB、BR的F值分别为29.67, 31.33和 24.00。
2.BR预处理对m-DNB染毒大鼠肝细胞GSH、GSSG含量及GSH-Px活力的影响：由图1可知：m-DNB染毒2小时，GSH含量最高；至染毒5小时，GSH含量有所下降。随着染毒剂量的增加，GSH的含量升高，经方差分析，F0.01(2,18)=6.01，P<0.01。显然，m-DNB染毒剂量、时间和BR三因素均与GSH的含量具有高度统计学意义。
m-DNB：间二硝基苯; BR：胆红素
, 百拇医药
图1 各因素与大鼠肝细胞GSH含量的关系
Fig 1 The relationship between the exposed factors and the content of GSH in rat hepatocytes
GSSG含量测定结果表明：随着m-DNB染毒剂量的增加和时间的延长，GSSG含量增加；加入BR后，GSSG含量有下降趋势。GSH-Px活力随着m-DNB染毒剂量的增加和时间的延长而下降，加入BR后无明显改变。
3.BR预处理对m-DNB与大鼠肝细胞孵育系统中
含量的影响：由表2可知，10 μmol/LBR预处理后，含0.25～2.0 mmol/L m-DNB与肝细胞孵育系统中,含量均比未经预处理组降低。, http://www.100md.com
4.BR对m-DNB与大鼠肝细胞孵育系统·OH含量的影响：在m-DNB与大鼠肝细胞孵育系统中，加入10 μmol/L BR后，可见·OH含量明显降低，见表3。
表2 胆红素对间二硝基苯与大鼠肝细胞孵育系统中
含量的影响(Table 2 Theeffect of m-DNB on the content of
in ratliver cells pretreated with bilirubin(, 百拇医药
组别
Group
(nmol/L/106 cell)间二硝基苯
m-DNB
胆红素+间二硝基苯
BR+m-DNB
染毒 Exposure
0.01 mmol/L
2.38±0.48
0.26±0.28
, 百拇医药
0.10 mmol/L
3.49±0.28**
3.02±0.27
0.25 mmol/L
5.08±0.28**
3.17±0.27*##
0.50 mmol/L
6.35±0.28**
3.65±0.28**##
1.00 mmol/L
, 百拇医药
9.20±0.55**
5.55±0.27**##
2.00 mmol/L
10.95±0.44**
6.67±0.48**#
对照 Control
1.74±0.27
1.74±0.27
与对照组比，*P<0.05,**P<0.01；同剂量m-DNB比，#P<0.05,##P<0.01
, 百拇医药
*P<0.05,**P<0.01vs.control group； # P<0.05,## P<0.01 vs.corresponding m-DNB
表3 胆红素对m-DNB与大鼠肝细胞孵育系统中·OH含量的影响(
±s,n=3)Table 3 Theeffect of m-DNB on the content of ·OHin rat liver cellspretreated with bilirubin(
±s,n=3), 百拇医药
组别
Group
·OH 峰高 ·OH Peak(mm)
间二硝基苯
m-DNB
间二硝基苯+胆红素
m-DNB+BR
染毒 Exposure
0.01 mmol/L
31.27±0.97**
21.73±0.59*#
, 百拇医药
0.50 mmol/L
45.50±0.53**
27.87±0.40**##
1.00 mmol/L
52.87±0.71**
32.87±0.71**##
对照 Control
13.07±0.67
13.07±0.67
与对照组比，*P<0.05,**P<0.01； 与m-DNB组比，#P<0.05,##P<0.01
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*P<0.05,**P<0.01 vs.control；#P<0.05,##P<0.01 vs. corresponding m-DNB
讨 论
本实验将大鼠肝细胞用一定浓度(属生理浓度)BR预处理后，与m-DNB共同孵育，观察脂质过氧化及自由基水平的改变，以探讨BR的抗氧化作用。
1.BR对脂质过氧化的抑制作用：Wolfram等[5]实验证实，含还原型辅酶Ⅱ(NADPH)和十二烷基磺酸钠(SDS)的大鼠肝脏微粒体孵育系统中可以产生脂质过氧化产物MDA，而加入一定量的BR预处理，可以有效地防止MDA的产生。Stocker等[2]报道:自由基启动剂二甲基戊腈(AMVN)可以使膜上的亚油酸(LH)发生脂质过氧化。如事先加入20 μmol/L的BR，可以有效地抑制200 μmol/L的亚油酸氢过氧化物的生成。而在此过程中，仅仅消耗了6μmol/L的BR。作者认为:此时的BR有可能与亚油酸竞争性地结合LOO·，部分地抑制自由基链式反应。本实验可见:与m-DNB共同孵育的大鼠肝细胞经BR预处理后，脂质过氧化产物MDA的含量明显低于未处理组，与Stocker等实验结果相符。证明：在体外，BR确实能够保护质膜免受脂质过氧化损伤。
, 百拇医药
2.BR与m-DNB同时加入大鼠肝细胞孵育系统对GSH、GSSG及GSH-Px的影响：从GSH解毒机制可知，GSH可抑制脂质过氧化、清除自由基[6]。本实验对大鼠肝细胞以m-DNB染毒，观察GSH、GSSG及GSH-Px的变化，并观察BR对其影响。结果显示：GSH含量随m-DNB染毒时间的延长先有升高继而降低；随m-DNB剂量的增加而升高；但经BR预处理后与对照组无明显差异。可见，GSH的升高是应激性反应，BR可抑制这种变化。但GSSG的含量仅有下降趋势，对GSH-Px的活力无明显影响。结合前述BR对MDA的抑制作用，可认为BR确实存在抗氧化作用。BR可能是通过与GSH的联合抗氧化作用，保护了GSH，减少了其在抗氧化过程中的消耗。
3.BR对自由基的清除作用：有实验证实胆汁中的BR可以直接清除
。刘湘陶等[7]也指出:BR是清除剂。Stocker[2]等认为：BR能强烈地阻断.OH和介导的氧化损伤，直接清除。本实验中，加入10 μmol/L的BR后，大鼠肝细胞由m-DNB所诱发的和·OH的含量明显降低，与上述观点相符。, 百拇医药
综上所述，在生理浓度下的BR确能抑制脂质过氧化、清除自由基，并可能与GSH有协同作用。
本课题受高等学校博士学科点专项科研基金资助
参 考 文 献
1 Hidalgo FJ,Zamora R,Dillard CJ,et al.Can bilirubin be an index of in vivo oxidative stress?Med Hypothes, 1990,33:207~211.
2 Stocker R,Yamanoto Y,McDonagh AF,et al.Bilirubin is as antioxidant of possible physiological importance. Science,1987,235:1043~1046.
, 百拇医药
3 沈惠麒，赵利英，曲青山.组织中谷胱甘肽的荧光测定法.中华劳动卫生职业病杂志，1988，6：103～105.
4 Greenwald RA.Handbook of methods for oxygen radical research.Boca Raton Florida:CRC Press Inc, 1985.120~147.
5 Wolfram I,Vegh M,Howath I.Bile pigments inhibit microsomal lipid peroxidation.Acta Biochem Biophys Hung，1986,4:307~311.
6 程元恺.谷胱甘肽的解毒作用与毒性代谢物.生物化学与生物物理进展，1994，21：395～399.
7 刘湘陶，孙福禄，赵正文，等.活性氧自由基诱发的胆红素聚合、聚集及稳定自由基的形成. 生物化学杂志，1990，6：437～443.
收稿：1997-01-16 修回：1997-08-18, http://www.100md.com