间二硝基苯对大鼠肝脏氧化损伤的研究
作者：沈惠麒 张金华
单位：100083 北京医科大学劳动卫生学教研室
关键词：间二硝基苯；脂质过氧化；自由基
中华劳动卫生职业病杂志980301
【摘要】目的 研究间二硝基苯(m-DNB)对肝脏的损伤并探讨其中毒机制。方法采用整体与离体实验相结合的方式对大鼠进行m-DNB染毒,观察大鼠肝脏脂质过氧化情况。结果 随染毒剂量的增加和染毒时间的延长，染毒组大鼠肝脏丙二醛(MDA)含量明显增加，呈良好的剂量-效应关系和时间-效应关系；低剂量、短时间染毒时,谷胱甘肽(GSH)含量增加，大剂量、长时间染毒时,其含量降低;氧化型谷胱甘肽(GSSG)及GSSG/GSH比值均随染毒剂量和时间的增加而增加；肝细胞的超氧阴离子自由基()、羟自由基(·OH)的产生量明显增加。结论 诱发脂质过氧化及产生自由基是mDNB的主要中毒机制之一。
, http://www.100md.com
The study on the oxidative damage induced by m-DNB to rat hepatocyte Shen Huiqi,Zhang Jinhua,Beijing Medical University,Beijing 100083
【Abstract】Objective The study was designed to examine the damage induced by m-DNB to hepatocytes. Methods Two ways of exposure to m-DNB were carried out：(1)rats were administered in vivo with different doses of m-DNB；(2)cultured rat hepatocytes were exposed to different concentrations of m-DNB.Then the changes of indices in lipid peroxidation were observed. Results The contents of MDA increased significantly in a manner dependent on exposure time and concentration of m-DNB；
, 百拇医药
the contents of GSH increased as a response to a stress for short period of exposure and at lower doses,but decreased for longer period of exposure and at higher doses;the contents of GSSG and especially the ratio of GSSG/GSH increased with the rise of doses;the production of hydroxy free radicals and superoxide radicals were elevated obviously. Conclusion The study demonstrated that the lipid peroxidation might play an important role in mDNB toxicity.
【Key words】 m-DNB Lipid peroxidation Free radicals
, http://www.100md.com
间二硝基苯(m-dinitrobenzene,m-DNB)主要用于染料和塑料工业，与TNT同属苯的硝基化合物，它们不仅结构相似，毒性表现也相近。江泉观等[1]已证实：硝基还原活化是引起TNT毒性的主要机制。为了证实m-DNB所致肝细胞氧化损伤的机制，并为m-DNB中毒防治提供有益的线索，我们进行了本实验。
材料与方法
1.主要试剂：m-DNB为上海试剂三厂产品，经北京医科大学中心实验室提纯，纯度99%；邻苯二醛(OPT)、硫代巴比妥酸(TBA)、细胞色素C、胶原酶Ⅳ均为Sigma产品；5，5-对硫二硝基苯甲酸(DTNB)为Fluka产品；谷胱甘肽(GSH)为SERVA产品；氧化型谷胱甘肽(GSSG)为BDH产品。
2.动物和染毒：(1)整体实验选雄性健康Wistar大鼠，体重170～180 g，由北京医科大学实验动物部提供。实验随机分为4组，即对照组及m-DNB 5mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg染毒组。m-DNB为经口染毒，每日1次，每周6次，大鼠于染毒后2周和4周分别断头处死6只，取肝脏制备匀浆。(2)离体实验为大鼠肝细胞经分离和培养后，调至所需细胞浓度，同时观察存活率。取1 ml肝细胞混悬液加入不同浓度的mDNB，其终浓度为0.00、0.01、0.10、0.25、0.50、1.00和2.00 mmol/L，染毒时间为0.5、1.0、2.0和5.0小时。
, 百拇医药
3.观察指标和方法：丙二醛(MDA)含量的测定用TBA法；GSH、GSSG含量的测定用荧光法[2]；谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活力的测定为比色法；超氧阴离子自由基()的检测为细胞色素还原法;羟基阴离子自由基(·OH)的检测为电子顺磁自旋捕获(ESR)法。
4.统计方法：t检验、方差分析。
结 果
1.m-DNB染毒对大鼠肝脏MDA含量的影响：大鼠m-DNB染毒不同时间后，各组肝脏MDA的含量均比相应的对照组明显增加;同一剂量染毒组，染毒4周肝脏MDA含量较染毒2周也增加明显，差异均有非常显著意义(P<0.01)，见表1。从表2可见:随染毒剂量的增加，各染毒组与对照组相比,MDA的含量均有不同程度的增加；同时可见随染毒时间的延长，各染毒组MDA含量与0.5小时染毒组MDA的含量相比，均显著增加。
, 百拇医药
表1不同剂量、不同时间m-DNB染毒对大鼠肝脏MDA含量的影响(±s,n=6)
Table 1 Effect ofdifferent doses and time of exposure to m-DNB on MDA content inrat liver(
±s,n=6)
组别
Group
MDA(nmol/g liver tessue)
2 weeks
4 weeks
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染毒 Exposure
5mg/kg
113.58±9.66**
144.67±3.43**##
10mg/kg
127.00±11.63**
178.08±1.95**##
20mg/kg
129.59±11.46**
194.00±9.19**##
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对照 Control
70.42±7.60
82.33±5.31
与对照组比，**P<0.01；与同剂量染毒2周比，##P<0.01
**P<0.01vs.control；##P<0.01vs.2 weeks
2.m-DNB染毒后对大鼠肝脏GSH、GSSG含量、GSSG/GSH比值的影响：m-DNB染毒2周时，10 mg/kg染毒组大鼠肝脏GSH含量比对照组明显增高，20 mg/kg组与对照组比含量下降，差异均有显著性(P<0.01)；10和20 mg/kg染毒组GSSG含量与对照组比均明显增高(P<0.01)；GSSG/GSH比值仅20 mg/kg组比对照组增高明显(P<0.01)。染毒4周时，5mg/kg组大鼠肝脏GSH含量明显增加(P<0.01),10及20 mg/kg组则明显降低(P<0.01)；各剂量组GSSG含量、GSSG/GSH比值与对照组比均显著增加，并呈剂量-效应关系(r=0.94)。染毒4周与2周比，5 mg/kg组肝脏GSH含量增加，10和20 mg/kg组明显降低(P<0.01)；GSSG含量、GSSG/GSH比值则为显著增加(P<0.01)，见表3。
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3.m-DNB不同剂量与孵育时间对大鼠肝细胞GSH的含量影响见表4。
随剂量和时间增加，各剂量组的GSSG的含量与相应的对照组或同剂量的0.5小时比，含量均有明显增加(P<0.01)。GSSG/GSH比值：短时间降低,5.0小时高剂量组比值显著升高(P<0.01)。
m-DNB染毒对大鼠肝细胞GSH-Px活力的影响：m-DNB染毒短时间、高剂量及长时间、低剂量时,肝细胞GSH-Px酶活力与对照组或与0.5小时组比，均明显降低(P<0.01)。
表2 m-DNB不同剂量与孵育时间对大鼠肝细胞MDA含量的影响(±s,n=6)
Table 2 Effect ofdifferent doses of m-DNB and different incubation time on MDAcontents
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in rat liver cells(±s,n=6)
组别
Group
MDA(nmol/L(106cell))
0.5h
1.0h
2.0h
5.0h
染毒
Exposure
0.01 mmol/L
, http://www.100md.com
0.62±0.08
0.83±0.08#
1.22±0.08*##
1.43±0.13##
0.10 mmol/L
0.70±0.08
0.88±0.08*#
1.39±0.09**##
1.52±0.08##
0.25 mmol/L
, 百拇医药
0.83±0.08*
1.09±0.08**#
1.60±0.08**##
2.25±0.20**##
0.50 mmol/L
1.05±0.13**
1.37±0.07**#
1.95±0.13**##
2.64±0.08**##
, 百拇医药
1.00 mmol/L
1.22±0.08**
1.55±0.13**#
2.08±0.13**##
3.37±0.13**##
2.00 mmol/L
1.39±0.07
1.91±0.08**##
2.60±0.13**##
4.05±0.08**##
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对照
Contron
0.57±0.08
0.70±0.07
0.96±0.08
1.35±0.07##
与对照组比，*P<0.05,**P<0.01；与同剂量0.5 h比，#P<0.05，##P<0.01
*P<0.05，**P<0.01vs.control group；#P<0.05，##P<0.01vs.0.5 h
, 百拇医药
表3 不同剂量、时间m-DNB染毒对大鼠肝脏GSH、GSSH含量及GSSG/GSH比值的影响(±s,n=6)
Table 3 Effect ofdifferent doses and time of exposure to m-DNB on the contents ofGSH,GSSH and GSSG/GSH in rat liver(±s,n=6)
组别
Group
GSH(μg/g liver tissue)
GSSG(μg/g liver tissue)
, 百拇医药
GSSG/GSH
2 weeks
4 weeks
2 weeks
4 weeks
2 weeks
4 weeks
染毒
Exposere
5 mg/kg
473.33±45.02
520.65±23.62**#
, 百拇医药
73.80±4.19
161.35±17.46**##
0.16±0.02
0.31±0.04**##
10 mg/kg
572.00±30.33**
285.22±12.83**##
97.18±7.86**
197.79±8.30**##
, 百拇医药 0.17±0.02
0.70±0.03**##
20 mg/kg
333.33±27.33**
252.68±11.80**##
160.97±16.93**
211.96±0.06**##
0.48±0.06**
0.8431±0.01**##
, 百拇医药
对照
Control
430.00±2.76
420.90±13.36
72.78±7.54
95.89±5.32
0.18±0.03
0.2331±0.02
与对照组比，*P<0.05,**P<0.01；与染毒2周比，#P<0.05，##P<0.01
*P<0.05，**P<0.01vs.control；#P<0.05，##P<0.01vs.2 weeks
, 百拇医药
表4 m-DNB不同剂量与孵育时间对大鼠肝细胞GSH含量的影响(±s,n=3)
Table 4 Effect ofdifferent doses of m-DNB and incubation time on GSH in rat liver cells(±s,n=3)
组别
Group
GSH(nmol/L(106cell))
0.5h
1.0h
, 百拇医药
2.0h
5.0h
染毒
Exposure
0.01 mmol/L
2.93±0.44
2.92±0.59
4.27±0.23**##
3.40±0.93
0.10 mmol/L
3.50±0.37*
, 百拇医药
4.04±0.63*
5.21±0.68**#
3.15±0.68
0.25 mmol/L
3.58±0.36*
4.65±0.48**#
4.90±0.42**#
4.23±1.05
0.50 mmol/L
4.32±0.55**
, http://www.100md.com
5.05±0.63**
11.69±0.52**##
5.41±0.85**
1.00 mmol/L
3.92±0.80*
5.80±0.65**#
10.29±1.35**##
1.77±0.46#
2.00 mmol/L
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4.77±0.92*
6.80±1.32**
8.23±2.75**
1.22±0.01**##
对照
Contron
2.47±0.21
2.69±0.45
2.63±0.36
2.58±0.27##
, 百拇医药
与对照组比，*P<0.05,**P<0.01；与同剂量0.5 h比，#P<0.05，##P<0.01
*P<0.05，**P<0.01 vs.control group；#P<0.05，##P<0.01 vs.0.5 h
4.m-DNB对大鼠肝细胞中o2含量的影响：m-DNB染毒2小时，0.1～2.0 mmol/L染毒各组与对照组比，大鼠肝细胞o2的含量均明显增加，呈剂量-效应关系(r=0.94)，见图1。
图1 m-DNB染毒2小时大鼠肝细胞中o2含量
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Fig 1 The contents of 02 in rat liver cells after incubated 2h with m-DNB
5.m-DNB对大鼠肝细胞·OH含量的影响：m-DNB染毒10分钟后，·OH信号明显增强。由表5可知，随染毒剂量增加，各染毒组·OH含量均比对照组显著增加(P<0.01)。
表5 m-DNB对大鼠肝细胞·OH含量的影响(x±s,n=3)
Table 5Effect of mDNB on the contents of ·OHinrat liver cells(x±s,n=3)
m-DNB染毒剂量
Dose of m-DNB
, 百拇医药
(mmol/L)
峰高
Peak (mm)
0
013.07±0.67
0.1
0.131.27±0.97**
0.5
0.545.50±0.53**
1.0
1.052.87±0.71**
与对照组比，**P<0.01 **P<0.01 vs. control
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讨 论
Mason等[3]首先用ESR方法观察到某些硝基苯类化合物在鼠肝线粒体还原活化过程中能形成硝基阴离子自由基。此后，Moreno等[4]在硝基杂环化合物中进一步证实了类似反应的存在。Zitting[5]及江泉观等[1]均已证实：诱发脂质过氧化及产生自由基是TNT的主要中毒机制。接触m-DNB后是否也符合此规律，迄今尚未见报道。
1.m-DNB染毒大鼠肝脏脂质过氧化水平：本实验结果显示,不同剂量m-DNB染毒后肝脏MDA含量明显增高，与对照组比差异有显著性，并呈剂量-效应关系及时间-效应关系；当剂量≥0.25 mmol/L，肝细胞的MDA含量与对照组相比明显增加，并随染毒时间的延长，MDA的含量也增加。因此可认为:m-DNB不论在体内还是体外均可诱发MDA含量增高，导致脂质过氧化。
2.m-DNB染毒后大鼠肝脏GSH及GSH-Px的变化：GSH具有多方面的重要生理功能，可作为抗氧化剂,保护细胞膜的巯基蛋白质和巯基酶不被氧化，并可与其它抗氧化剂协同作用[6]。本实验结果为：短时间、低剂量染毒时，GSH含量升高，长时间、大剂量染毒时，GSH含量降低。而GSSG则表现为随着染毒剂量的增加和时间的延长，含量逐渐增加。从GSSG/GSH的比值更清楚地看出：随染毒剂量增加及时间的延长，比值升高。GSH-Px活力表现出低剂量时活力增加，而高剂量时活力抑制的趋势。以上体内外实验均证实m-DNB确与TNT类似[7]，能影响机体的氧化还原体系，即符合氧化应激的规律。
, 百拇医药
3.m-DNB染毒后大鼠肝细胞孵育系统自由基含量的变化：硝基苯类化合物可在硝基还原酶催化下,经单电子还原形成硝基阴离子自由基，在有氧条件下进一步反应生成、.OH等一系列氧自由基，导致膜的损伤[8]。染毒剂量≥0.1 mmol/L的染毒各组与对照组相比，含量均明显增加，差异有显著性，且呈剂量-效应关系(r=0.94)。各染毒剂量组所产生的.OH与对照组相比，含量均明显增加(P<0.01)。
众所周知，引起脂质过氧化的机制主要有两种可能，一是引起氧自由基的产生，二是、抑制抗氧化防御系统。本实验数据提示：m-DNB的中毒机制与目前公认的硝基苯类化合物氧化损伤机制主要倾向于自由基与脂质过氧化学说是符合的。
, http://www.100md.com 本课题受高等学校博士学科点专项科研基金资助
参 考 文 献
1 江泉观，崔京伟.*****在脑、肾、肝脏和睾丸的还原活化.卫生毒理学杂志，1987， 1：37～39.
2 沈惠麒，赵利英，曲青山.组织中谷胱甘肽的荧光测定法.中华劳动卫生职业病杂志，1988， 6：103～105.
3 Mason RP,Holtzman JL.The mechanism of microsomal and mitochondrial nitroaromatic free radical intermediates.Biochem J,1975,14:1626～1632.
4 Moreno SNJ,Mason RP,Docampo R.Reduction of nifurtimox and nitrofurantion to free radical metabolites by rat liver mitochondria.J Biol Chem,1984,259:6298～6302.
, http://www.100md.com
5 Zitting A,Szumanska G,Nickels J.Acute toxic effects of trinitrotoluene on rat brain,liver and kidney:Role of radical production.ArchToxicol,1982,51:53~64.
6 程元恺.谷胱甘肽的解毒作用与毒性代谢物.生物化学与生物物理进展，1994，21：395～399.
7 沈惠麒，郝炳华，陶敏.禁食对*****染毒大鼠肝脏谷胱甘肽及有关酶的影响.卫生 毒理学杂志，1989，3：102～104.
8 Sies H,Akerboom TPM.Glutathione disulfide (GSSG) efflux from cells and tissues.Methods Enzymol, 1984,105:445～451.
(收稿：1997-01-16修回：1997-08-18), 百拇医药
单位：100083 北京医科大学劳动卫生学教研室
关键词：间二硝基苯；脂质过氧化；自由基
中华劳动卫生职业病杂志980301
【摘要】目的 研究间二硝基苯(m-DNB)对肝脏的损伤并探讨其中毒机制。方法采用整体与离体实验相结合的方式对大鼠进行m-DNB染毒,观察大鼠肝脏脂质过氧化情况。结果 随染毒剂量的增加和染毒时间的延长，染毒组大鼠肝脏丙二醛(MDA)含量明显增加，呈良好的剂量-效应关系和时间-效应关系；低剂量、短时间染毒时,谷胱甘肽(GSH)含量增加，大剂量、长时间染毒时,其含量降低;氧化型谷胱甘肽(GSSG)及GSSG/GSH比值均随染毒剂量和时间的增加而增加；肝细胞的超氧阴离子自由基(
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The study on the oxidative damage induced by m-DNB to rat hepatocyte Shen Huiqi,Zhang Jinhua,Beijing Medical University,Beijing 100083
【Abstract】Objective The study was designed to examine the damage induced by m-DNB to hepatocytes. Methods Two ways of exposure to m-DNB were carried out：(1)rats were administered in vivo with different doses of m-DNB；(2)cultured rat hepatocytes were exposed to different concentrations of m-DNB.Then the changes of indices in lipid peroxidation were observed. Results The contents of MDA increased significantly in a manner dependent on exposure time and concentration of m-DNB；
, 百拇医药
the contents of GSH increased as a response to a stress for short period of exposure and at lower doses,but decreased for longer period of exposure and at higher doses;the contents of GSSG and especially the ratio of GSSG/GSH increased with the rise of doses;the production of hydroxy free radicals and superoxide radicals were elevated obviously. Conclusion The study demonstrated that the lipid peroxidation might play an important role in mDNB toxicity.
【Key words】 m-DNB Lipid peroxidation Free radicals
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间二硝基苯(m-dinitrobenzene,m-DNB)主要用于染料和塑料工业，与TNT同属苯的硝基化合物，它们不仅结构相似，毒性表现也相近。江泉观等[1]已证实：硝基还原活化是引起TNT毒性的主要机制。为了证实m-DNB所致肝细胞氧化损伤的机制，并为m-DNB中毒防治提供有益的线索，我们进行了本实验。
材料与方法
1.主要试剂：m-DNB为上海试剂三厂产品，经北京医科大学中心实验室提纯，纯度99%；邻苯二醛(OPT)、硫代巴比妥酸(TBA)、细胞色素C、胶原酶Ⅳ均为Sigma产品；5，5-对硫二硝基苯甲酸(DTNB)为Fluka产品；谷胱甘肽(GSH)为SERVA产品；氧化型谷胱甘肽(GSSG)为BDH产品。
2.动物和染毒：(1)整体实验选雄性健康Wistar大鼠，体重170～180 g，由北京医科大学实验动物部提供。实验随机分为4组，即对照组及m-DNB 5mg/kg、10 mg/kg和20 mg/kg染毒组。m-DNB为经口染毒，每日1次，每周6次，大鼠于染毒后2周和4周分别断头处死6只，取肝脏制备匀浆。(2)离体实验为大鼠肝细胞经分离和培养后，调至所需细胞浓度，同时观察存活率。取1 ml肝细胞混悬液加入不同浓度的mDNB，其终浓度为0.00、0.01、0.10、0.25、0.50、1.00和2.00 mmol/L，染毒时间为0.5、1.0、2.0和5.0小时。
, 百拇医药
3.观察指标和方法：丙二醛(MDA)含量的测定用TBA法；GSH、GSSG含量的测定用荧光法[2]；谷胱甘肽过氧化酶(GSH-Px)活力的测定为比色法；超氧阴离子自由基(
4.统计方法：t检验、方差分析。
结 果
1.m-DNB染毒对大鼠肝脏MDA含量的影响：大鼠m-DNB染毒不同时间后，各组肝脏MDA的含量均比相应的对照组明显增加;同一剂量染毒组，染毒4周肝脏MDA含量较染毒2周也增加明显，差异均有非常显著意义(P<0.01)，见表1。从表2可见:随染毒剂量的增加，各染毒组与对照组相比,MDA的含量均有不同程度的增加；同时可见随染毒时间的延长，各染毒组MDA含量与0.5小时染毒组MDA的含量相比，均显著增加。
, 百拇医药
表1不同剂量、不同时间m-DNB染毒对大鼠肝脏MDA含量的影响(
Table 1 Effect ofdifferent doses and time of exposure to m-DNB on MDA content inrat liver(
±s,n=6)组别
Group
MDA(nmol/g liver tessue)
2 weeks
4 weeks
, http://www.100md.com
染毒 Exposure
5mg/kg
113.58±9.66**
144.67±3.43**##
10mg/kg
127.00±11.63**
178.08±1.95**##
20mg/kg
129.59±11.46**
194.00±9.19**##
, http://www.100md.com
对照 Control
70.42±7.60
82.33±5.31
与对照组比，**P<0.01；与同剂量染毒2周比，##P<0.01
**P<0.01vs.control；##P<0.01vs.2 weeks
2.m-DNB染毒后对大鼠肝脏GSH、GSSG含量、GSSG/GSH比值的影响：m-DNB染毒2周时，10 mg/kg染毒组大鼠肝脏GSH含量比对照组明显增高，20 mg/kg组与对照组比含量下降，差异均有显著性(P<0.01)；10和20 mg/kg染毒组GSSG含量与对照组比均明显增高(P<0.01)；GSSG/GSH比值仅20 mg/kg组比对照组增高明显(P<0.01)。染毒4周时，5mg/kg组大鼠肝脏GSH含量明显增加(P<0.01),10及20 mg/kg组则明显降低(P<0.01)；各剂量组GSSG含量、GSSG/GSH比值与对照组比均显著增加，并呈剂量-效应关系(r=0.94)。染毒4周与2周比，5 mg/kg组肝脏GSH含量增加，10和20 mg/kg组明显降低(P<0.01)；GSSG含量、GSSG/GSH比值则为显著增加(P<0.01)，见表3。
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3.m-DNB不同剂量与孵育时间对大鼠肝细胞GSH的含量影响见表4。
随剂量和时间增加，各剂量组的GSSG的含量与相应的对照组或同剂量的0.5小时比，含量均有明显增加(P<0.01)。GSSG/GSH比值：短时间降低,5.0小时高剂量组比值显著升高(P<0.01)。
m-DNB染毒对大鼠肝细胞GSH-Px活力的影响：m-DNB染毒短时间、高剂量及长时间、低剂量时,肝细胞GSH-Px酶活力与对照组或与0.5小时组比，均明显降低(P<0.01)。
表2 m-DNB不同剂量与孵育时间对大鼠肝细胞MDA含量的影响(
Table 2 Effect ofdifferent doses of m-DNB and different incubation time on MDAcontents
, http://www.100md.com
in rat liver cells(
组别
Group
MDA(nmol/L(106cell))
0.5h
1.0h
2.0h
5.0h
染毒
Exposure
0.01 mmol/L
, http://www.100md.com
0.62±0.08
0.83±0.08#
1.22±0.08*##
1.43±0.13##
0.10 mmol/L
0.70±0.08
0.88±0.08*#
1.39±0.09**##
1.52±0.08##
0.25 mmol/L
, 百拇医药
0.83±0.08*
1.09±0.08**#
1.60±0.08**##
2.25±0.20**##
0.50 mmol/L
1.05±0.13**
1.37±0.07**#
1.95±0.13**##
2.64±0.08**##
, 百拇医药
1.00 mmol/L
1.22±0.08**
1.55±0.13**#
2.08±0.13**##
3.37±0.13**##
2.00 mmol/L
1.39±0.07
1.91±0.08**##
2.60±0.13**##
4.05±0.08**##
, http://www.100md.com
对照
Contron
0.57±0.08
0.70±0.07
0.96±0.08
1.35±0.07##
与对照组比，*P<0.05,**P<0.01；与同剂量0.5 h比，#P<0.05，##P<0.01
*P<0.05，**P<0.01vs.control group；#P<0.05，##P<0.01vs.0.5 h
, 百拇医药
表3 不同剂量、时间m-DNB染毒对大鼠肝脏GSH、GSSH含量及GSSG/GSH比值的影响(
Table 3 Effect ofdifferent doses and time of exposure to m-DNB on the contents ofGSH,GSSH and GSSG/GSH in rat liver(
±s,n=6)组别
Group
GSH(μg/g liver tissue)
GSSG(μg/g liver tissue)
, 百拇医药
GSSG/GSH
2 weeks
4 weeks
2 weeks
4 weeks
2 weeks
4 weeks
染毒
Exposere
5 mg/kg
473.33±45.02
520.65±23.62**#
, 百拇医药
73.80±4.19
161.35±17.46**##
0.16±0.02
0.31±0.04**##
10 mg/kg
572.00±30.33**
285.22±12.83**##
97.18±7.86**
197.79±8.30**##
, 百拇医药 0.17±0.02
0.70±0.03**##
20 mg/kg
333.33±27.33**
252.68±11.80**##
160.97±16.93**
211.96±0.06**##
0.48±0.06**
0.8431±0.01**##
, 百拇医药
对照
Control
430.00±2.76
420.90±13.36
72.78±7.54
95.89±5.32
0.18±0.03
0.2331±0.02
与对照组比，*P<0.05,**P<0.01；与染毒2周比，#P<0.05，##P<0.01
*P<0.05，**P<0.01vs.control；#P<0.05，##P<0.01vs.2 weeks
, 百拇医药
表4 m-DNB不同剂量与孵育时间对大鼠肝细胞GSH含量的影响(
Table 4 Effect ofdifferent doses of m-DNB and incubation time on GSH in rat liver cells(
组别
Group
GSH(nmol/L(106cell))
0.5h
1.0h
, 百拇医药
2.0h
5.0h
染毒
Exposure
0.01 mmol/L
2.93±0.44
2.92±0.59
4.27±0.23**##
3.40±0.93
0.10 mmol/L
3.50±0.37*
, 百拇医药
4.04±0.63*
5.21±0.68**#
3.15±0.68
0.25 mmol/L
3.58±0.36*
4.65±0.48**#
4.90±0.42**#
4.23±1.05
0.50 mmol/L
4.32±0.55**
, http://www.100md.com
5.05±0.63**
11.69±0.52**##
5.41±0.85**
1.00 mmol/L
3.92±0.80*
5.80±0.65**#
10.29±1.35**##
1.77±0.46#
2.00 mmol/L
, http://www.100md.com
4.77±0.92*
6.80±1.32**
8.23±2.75**
1.22±0.01**##
对照
Contron
2.47±0.21
2.69±0.45
2.63±0.36
2.58±0.27##
, 百拇医药
与对照组比，*P<0.05,**P<0.01；与同剂量0.5 h比，#P<0.05，##P<0.01
*P<0.05，**P<0.01 vs.control group；#P<0.05，##P<0.01 vs.0.5 h
4.m-DNB对大鼠肝细胞中o2含量的影响：m-DNB染毒2小时，0.1～2.0 mmol/L染毒各组与对照组比，大鼠肝细胞o2的含量均明显增加，呈剂量-效应关系(r=0.94)，见图1。
图1 m-DNB染毒2小时大鼠肝细胞中o2含量
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Fig 1 The contents of 02 in rat liver cells after incubated 2h with m-DNB
5.m-DNB对大鼠肝细胞·OH含量的影响：m-DNB染毒10分钟后，·OH信号明显增强。由表5可知，随染毒剂量增加，各染毒组·OH含量均比对照组显著增加(P<0.01)。
表5 m-DNB对大鼠肝细胞·OH含量的影响(x±s,n=3)
Table 5Effect of mDNB on the contents of ·OHinrat liver cells(x±s,n=3)
m-DNB染毒剂量
Dose of m-DNB
, 百拇医药
(mmol/L)
峰高
Peak (mm)
0
013.07±0.67
0.1
0.131.27±0.97**
0.5
0.545.50±0.53**
1.0
1.052.87±0.71**
与对照组比，**P<0.01 **P<0.01 vs. control
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讨 论
Mason等[3]首先用ESR方法观察到某些硝基苯类化合物在鼠肝线粒体还原活化过程中能形成硝基阴离子自由基。此后，Moreno等[4]在硝基杂环化合物中进一步证实了类似反应的存在。Zitting[5]及江泉观等[1]均已证实：诱发脂质过氧化及产生自由基是TNT的主要中毒机制。接触m-DNB后是否也符合此规律，迄今尚未见报道。
1.m-DNB染毒大鼠肝脏脂质过氧化水平：本实验结果显示,不同剂量m-DNB染毒后肝脏MDA含量明显增高，与对照组比差异有显著性，并呈剂量-效应关系及时间-效应关系；当剂量≥0.25 mmol/L，肝细胞的MDA含量与对照组相比明显增加，并随染毒时间的延长，MDA的含量也增加。因此可认为:m-DNB不论在体内还是体外均可诱发MDA含量增高，导致脂质过氧化。
2.m-DNB染毒后大鼠肝脏GSH及GSH-Px的变化：GSH具有多方面的重要生理功能，可作为抗氧化剂,保护细胞膜的巯基蛋白质和巯基酶不被氧化，并可与其它抗氧化剂协同作用[6]。本实验结果为：短时间、低剂量染毒时，GSH含量升高，长时间、大剂量染毒时，GSH含量降低。而GSSG则表现为随着染毒剂量的增加和时间的延长，含量逐渐增加。从GSSG/GSH的比值更清楚地看出：随染毒剂量增加及时间的延长，比值升高。GSH-Px活力表现出低剂量时活力增加，而高剂量时活力抑制的趋势。以上体内外实验均证实m-DNB确与TNT类似[7]，能影响机体的氧化还原体系，即符合氧化应激的规律。
, 百拇医药
3.m-DNB染毒后大鼠肝细胞孵育系统自由基含量的变化：硝基苯类化合物可在硝基还原酶催化下,经单电子还原形成硝基阴离子自由基，在有氧条件下进一步反应生成
众所周知，引起脂质过氧化的机制主要有两种可能，一是引起氧自由基的产生，二是、抑制抗氧化防御系统。本实验数据提示：m-DNB的中毒机制与目前公认的硝基苯类化合物氧化损伤机制主要倾向于自由基与脂质过氧化学说是符合的。
, http://www.100md.com 本课题受高等学校博士学科点专项科研基金资助
参 考 文 献
1 江泉观，崔京伟.*****在脑、肾、肝脏和睾丸的还原活化.卫生毒理学杂志，1987， 1：37～39.
2 沈惠麒，赵利英，曲青山.组织中谷胱甘肽的荧光测定法.中华劳动卫生职业病杂志，1988， 6：103～105.
3 Mason RP,Holtzman JL.The mechanism of microsomal and mitochondrial nitroaromatic free radical intermediates.Biochem J,1975,14:1626～1632.
4 Moreno SNJ,Mason RP,Docampo R.Reduction of nifurtimox and nitrofurantion to free radical metabolites by rat liver mitochondria.J Biol Chem,1984,259:6298～6302.
, http://www.100md.com
5 Zitting A,Szumanska G,Nickels J.Acute toxic effects of trinitrotoluene on rat brain,liver and kidney:Role of radical production.ArchToxicol,1982,51:53~64.
6 程元恺.谷胱甘肽的解毒作用与毒性代谢物.生物化学与生物物理进展，1994，21：395～399.
7 沈惠麒，郝炳华，陶敏.禁食对*****染毒大鼠肝脏谷胱甘肽及有关酶的影响.卫生 毒理学杂志，1989，3：102～104.
8 Sies H,Akerboom TPM.Glutathione disulfide (GSSG) efflux from cells and tissues.Methods Enzymol, 1984,105:445～451.
(收稿：1997-01-16修回：1997-08-18), 百拇医药