石棉致癌与癌基因的研究进展
作者：刘森
单位：100050 北京，中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所
关键词：
中华劳动卫生职业病杂志980526 梁淑容 李德鸿 审校
石棉是一组天然矿物纤维的总称。长期接触石棉可引起肺癌及间皮瘤。自从提出石棉与肺癌的关系以来，人们利用体内和体外实验系统，从石棉纤维的物理特性、化学组成、细胞毒性、遗传毒性、癌基因及抑癌基因等多方面，从机体、细胞、生化、分子等多层次来探讨石棉的致癌机制。本文仅就石棉致癌与癌基因的研究进展作一综述。
癌基因和抑癌基因对细胞增生调控起着重要作用：癌基因促进细胞增生，并且阻止其发生终末分化;抑癌基因促进细胞成熟，向终末分化，最后凋谢死亡。这两类基因保持动态平衡，对正常的细胞增生和死亡精确地调控,一旦两者的关系遭到破坏，必将导致细胞增生调控的紊乱而致细胞恶性变[1]。石棉致癌机制的研究最初集中在石棉的物理与化学特性、细胞毒性、遗传毒性等方面。随着癌基因的发现，它在细胞转化中的重要性逐渐得到重视。80年代后期，人们开始了石棉致癌与癌基因关系的研究。
, 百拇医药
石棉可诱导细胞染色体畸变，当这些畸变累及癌基因或抑癌基因所在的染色体时，常见的如第1、3、4、5、7、9、11、13、17、22号染色体[2，3]，可能会引起癌基因的激活和抑癌基因的失活。
一、石棉致癌与癌基因
石棉相关肿瘤的潜伏期较长，恶性间皮瘤的潜伏期可达40年，提示细胞癌变过程中涉及多基因位点的改变[4]。虽然已发现的癌基因数目众多，但石棉相关肿瘤中研究的癌基因仅集中在ras、c-fos、c-jun、sis等。
石棉致癌与癌基因关系的研究中，对ras基因的研究较早而深入。Annab等[5]对石棉诱导的叙利亚仓鼠肿瘤细胞进行了研究，发现在肿瘤的衍生(derived)细胞系中，大约有50%的H-ras基因活化，而对照组非癌变细胞系中的H-ras基因缺乏活性。将活化的H-ras基因转染正常人间皮细胞系细胞，然后将转染细胞接种裸鼠，可诱发肿瘤，而未经H-ras癌基因转染的细胞不能使裸鼠发生肿瘤[6]。Brandt-Rauf等[7]从1983年开始,对36例石棉肺和10例矽肺病人进行追踪观察，到1991年,发现有18例发展为肿瘤(其中11例肺癌、2例胸膜间皮瘤)。对病人血清中ras基因的蛋白产物p21进行检测，发现有5例肺癌患者和2例间皮瘤患者血清p21水平增高(7/18)；而未发展为肿瘤的28例病人中仅有2例p21水平增高(2/28)，两者差异有显著性(P=0.012)。Vainio等[8]在研究K-ras基因突变频率较高的肺腺癌中石棉与吸烟的影响时，发现K-ras基因突变与患者肺中石棉含量相关。石棉在细胞癌变过程中引起靶细胞的形态转化和永生化，但H-ras基因突变常在细胞癌变后发生。Barrett[9]认为:H-ras基因突变可能不是石棉作用的直接结果。Lamb等[10]从3个人间皮瘤组织中分离出DNA，转染NIH/3T3细胞没有致瘤性。从裸鼠肿瘤中分离出DNA，再次转染，在5周的潜伏期内进行致癌性评价，显示高度阳性。用Southern杂交分析NIH/3T3细胞DNA，结果发现H-ras、K-ras和N-ras基因都是和鼠基因高度同源，即检测不到人的间皮瘤基因。但用Alu重复序列(人类所特有的序列)DNA探针实验确实能够检测出初次及再次转染的DNA中含有人的序列。这些结果显示:人间皮瘤所含有的活化基因可能不属于ras基因家族。Metcalf等[11]用PCR扩增后直接测定基因组序列的方法检查了来自17个个体的20个人间皮瘤细胞K-ras基因第12、13、61密码子单碱基改变的频率，未发现K-ras基因突变。
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美国的Mossman实验室于1993年开始对石棉与靶细胞中c-fos和c-jun的表达进行了深入的研究。c-fos和c-jun是一组早期反应基因家族，在生长因子、肿瘤促进剂等因素的作用下，这组基因首先转录，通过其编码产物启动与细胞分裂有关的其它基因的转录，促使细胞由G1期进入S期，加速细胞增生。表达紊乱可引起细胞异常增生和转化[12]。
Heintz等[13]用青石棉和温石棉处理大鼠胸膜间皮细胞(RPM)和仓鼠气管上皮细胞(HTE)，研究石棉诱导c-fos和c-jun mRNA表达的情况，结果表明青石棉和温石棉都能引起RPM细胞中c-fos mRNA显著而持久地表达，但在HTE细胞中c-fos mRNA表达水平不显著;而对这两种细胞石棉均能引起c-jun mRNA显著而持久的表达。Timblin等[14]研究发现:石棉和H2O2都能激活AP-1相关基因(c-fos，c-jun)的转录活性，导致细胞过度增生及表型改变。Janssen等[15]的研究表明：石棉能使细胞内巯基水平下降，而细胞内巯基水平能影响c-fos和c-jun的表达，提示调控石棉诱导c-fos和c-jun表达的信号通路中有氧化还原电位敏感元件的存在。还有实验表明:石棉能刺激促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活力，MAPK进入核内，使早期反应基因转录增强[11]。
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在石棉所致的人恶性间皮瘤中可检测到c-sis原癌基因表达增强[16]。c-sis基因的产物与血小板衍生生长因子(PDGF)的B链同源。若该产物持续大量表达，可使具有PDGF受体的细胞接受c-sis基因表达产物的刺激，从而不断生长，导致恶变。c-sis蛋白也可直接激活处于感受态的c-fos和c-jun等原癌基因，对细胞增生起正调控作用。
二、石棉致癌与抑癌基因
抑癌基因在细胞的生长和分化中起负调控作用。已发现的抑癌基因有20多种。石棉相关肿瘤中研究的抑癌基因有p53、Rb、p16、NF2、WT-1等。
p53基因位于染色体17p，编码的p53蛋白是一核内转录因子，可激活某些抑制细胞增生的基因,突变使其丧失抑癌功能。Cote等[17]用Northern杂交和直接测序的方法研究4个恶性间皮瘤细胞株p53基因的改变情况，发现两个细胞株中分别在175和245密码子发生点突变；一个细胞株p53基因不能表达蛋白，成为无效细胞。Metcalf等[11]用同样的方法检测了17例恶性间皮瘤的20个细胞株中p53突变情况，同Cote的研究结果相似,也有两个细胞株发生了点突变，分别在245和278密码子;1个细胞株p53基因不能表达蛋白。Nuorva等[18]用免疫组化的的方法分析了70例原发性肺癌病人p53蛋白异常积累与石棉暴露的关系，结果发现石棉暴露病人p53蛋白异常积累率高于非石棉暴露病人(P=0.027);35%的p53蛋白阳性病人每平方厘米肺组织中有1个以上石棉小体。提示石棉暴露与p53蛋白异常积累有关。作者认为p53基因突变与石棉暴露有关。国内刘秉慈等[19]对10例石棉相关肿瘤p53基因的突变情况进行了研究,10例病例中，PCR-SSCP分析发现有7例(8处,70%)p53基因发生突变;免疫组化观察发现p53基因突变体蛋白有5例阳性(50%),其中有4例在两种方法中均检测为阳性，有较好的一致性。
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在石棉相关间皮瘤中，可发生p16基因丢失或突变，但Rb基因突变不发生或很少发生。p16基因位于人染色体9p21，其编码的p16蛋白是细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)的抑制因子，与细胞周期蛋白cyclin竞争CDK4。p16蛋白失活时，CDK4与cyclinD1形成复合物，CDK4处于激活状态，作用于其底物Rb蛋白,使Rb蛋白磷酸化而失去对细胞周期的调控。因此，p16基因的缺失或突变能产生与Rb基因失活相同的效果[20]。
抑癌基因NF2定位于染色体22q。Bianchi等[21]研究了15个恶性间皮瘤细胞株和7个原发肿瘤的NF2基因突变情况，发现有8个细胞株和6个原发性肿瘤的NF2基因发生突变。表明在恶性间皮瘤中NF2基因存在高频突变，可能对间皮瘤的发生发展起重要作用。
抑癌基因WT-1在间皮细胞中正常表达，而在恶性间皮瘤中可发现其突变[22]。Kleimenova等[23]利用石棉诱发的大鼠间皮瘤模型研究,发现了抑癌基因WT-1出现改变。
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抑癌基因虽然发现较晚，但由于其突变在肿瘤发生中的重要作用而引起人们的关注。在石棉相关肿瘤中，可检测到抑癌基因有p53、p16、NF2、WT-1等的突变。
三、小结
在肿瘤的发生发展过程中，必然涉及多个原癌基因的激活和抑癌基因的失活。在石棉致癌过程中，石棉诱发活性氧自由基，后者介导的遗传损伤及石棉纤维与靶细胞直接作用，引起染色体数目和结构的畸变，导致原癌基因的激活和抑癌基因的失活(可能包括尚未发现或未明确作用的基因)。在石棉相关肿瘤中，ras基因突变的检测结果很不一致，但ras基因表达产物p21蛋白量与人肺中石棉含量相关，提示石棉纤维可能通过某种机制，间接促进ras基因的表达。石棉纤维可通过多种途径诱导靶细胞c-fos和c-jun基因表达增强，通过其编码产物启动与细胞分裂有关的其它基因的转录，促进细胞增生。在石棉纤维所致间皮瘤细胞中可检测到c-sis的表达增强，其编码产物的大量表达促进细胞增生。野生型p53基因对细胞增生起负调作用。石棉所致间皮瘤中发生p53基因突变，使其丧失抑癌功能。另一个抑癌基因Rb不发生或很少发生突变，但p16基因的突变可产生与Rb基因突变相同的效果。在石棉所致间皮瘤中，可检测到抑癌基因NF2、WT-1的改变。
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总之，石棉纤维在其致癌的过程中，通过引起多种癌基因的激活和抑癌基因的失活，使细胞增生调控发生紊乱，促进细胞增生；在细胞增生过程中，增加基因突变的机会，从而使靶细胞表型改变，细胞恶性变，最终发展为肿瘤。
四、问题与展望
石棉致癌机制的研究已进行了多年，但其致癌的分子机制的研究则处于起步阶段，许多问题有待于深入研究和探讨,如石棉致癌与其它癌基因和抑癌基因(那些尚未发现或未明确作用的基因)的关系、各种癌基因激活和抑癌基因失活的协同关系、石棉相关肿瘤与一般肿瘤中癌基因表达的异同等。间皮瘤的长潜伏期说明癌变过程中涉及多基因位点的改变。要在100多个癌基因或抑癌基因中找出那些在石棉致癌中发挥作用的基因，阐明石棉致癌发生发展的分子机制，尚需许多艰巨的工作，但这毕竟为致癌机制的研究开辟了一条道路，为揭示石棉致癌的机制带来希望。
参考文献
, 百拇医药
1 陈诗书主编.医学细胞和分子生物学.上海：上海医科大学出版社，1995.498.
2 Funaki K,Everitt J,Bermundez E,et al.Trisomy of rat chromosome Ⅰ associated with mesothelial cell transformation.Cancer Res,1991,51:4059～4066.
3 Mossman BT.Mechanisms of asbestos carcinogenesis and toxicity:the amphothesis revisited.Br J Ind Med,1993,50:673～676.
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7 Brandt-Rauf PW,Smith S,Hemmiki K,et al.Serum oncoprtoteins and growth factors in asbestosis and silicosis patients.Int J Cancer,1992,50:881～885.
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8 Vainio H,Husgafvel-Pursiainen K,Anttila S,et al.Interaction between smoking and asbestos in human lung adenocarcinoma:role of K-ras mutations.Environ Health Perspect,1993,101(Suppl 3):189～192.
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10 Lamb P,Wiseman R,Ozawa N,et al.Detection of transforming genes on human mesotheliomas.Proc Am Assoc Cancer Res,1988,29:565.
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15 Janssen YWM,Heintz NH,Mossman BT.Induction of c-fos and c-jun proto-oncogene expression by asbestos is ameliorated by N-Acetyl-L-Cysteine in mesothelial cells.Cancer Res,1995,55:2085～2089.
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19 刘秉慈，付德臣，缪庆，等.石棉相关肿瘤p53基因突变的免疫组化及PCR-SSCP研究.中华劳动卫生职业病杂志，1997，15：150～153.
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21 Bianchi AB,Mitsunaga SI,Cheng JQ,et al.High frequency of inactivating mutations in the neurofibromatosis type 2 gene(NF2) in primary malignant mesotheliomas.Proc Natl Acad Sci USA,1995,92:10854～10858.
22 Park S,Schalling M,Bernard A,et al.The wilms tumor gene WT-1 is expressed on murine mesodern-derived tissues and mutated in a human mesothelioma.Nat Genet,1993,4:415～420.
23 Kleimenova E,Yuan X,Labate M,et al.Site-specific methylation of the WT-1 tumor suppressor gene in asbestos induced mesotheliomas.Proc An Assoc Cancer Res,1996,37:3671.
(收稿：1997-08-28 修回：1997-12-10), 百拇医药
单位：100050 北京，中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所
关键词：
中华劳动卫生职业病杂志980526 梁淑容 李德鸿 审校
石棉是一组天然矿物纤维的总称。长期接触石棉可引起肺癌及间皮瘤。自从提出石棉与肺癌的关系以来，人们利用体内和体外实验系统，从石棉纤维的物理特性、化学组成、细胞毒性、遗传毒性、癌基因及抑癌基因等多方面，从机体、细胞、生化、分子等多层次来探讨石棉的致癌机制。本文仅就石棉致癌与癌基因的研究进展作一综述。
癌基因和抑癌基因对细胞增生调控起着重要作用：癌基因促进细胞增生，并且阻止其发生终末分化;抑癌基因促进细胞成熟，向终末分化，最后凋谢死亡。这两类基因保持动态平衡，对正常的细胞增生和死亡精确地调控,一旦两者的关系遭到破坏，必将导致细胞增生调控的紊乱而致细胞恶性变[1]。石棉致癌机制的研究最初集中在石棉的物理与化学特性、细胞毒性、遗传毒性等方面。随着癌基因的发现，它在细胞转化中的重要性逐渐得到重视。80年代后期，人们开始了石棉致癌与癌基因关系的研究。
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石棉可诱导细胞染色体畸变，当这些畸变累及癌基因或抑癌基因所在的染色体时，常见的如第1、3、4、5、7、9、11、13、17、22号染色体[2，3]，可能会引起癌基因的激活和抑癌基因的失活。
一、石棉致癌与癌基因
石棉相关肿瘤的潜伏期较长，恶性间皮瘤的潜伏期可达40年，提示细胞癌变过程中涉及多基因位点的改变[4]。虽然已发现的癌基因数目众多，但石棉相关肿瘤中研究的癌基因仅集中在ras、c-fos、c-jun、sis等。
石棉致癌与癌基因关系的研究中，对ras基因的研究较早而深入。Annab等[5]对石棉诱导的叙利亚仓鼠肿瘤细胞进行了研究，发现在肿瘤的衍生(derived)细胞系中，大约有50%的H-ras基因活化，而对照组非癌变细胞系中的H-ras基因缺乏活性。将活化的H-ras基因转染正常人间皮细胞系细胞，然后将转染细胞接种裸鼠，可诱发肿瘤，而未经H-ras癌基因转染的细胞不能使裸鼠发生肿瘤[6]。Brandt-Rauf等[7]从1983年开始,对36例石棉肺和10例矽肺病人进行追踪观察，到1991年,发现有18例发展为肿瘤(其中11例肺癌、2例胸膜间皮瘤)。对病人血清中ras基因的蛋白产物p21进行检测，发现有5例肺癌患者和2例间皮瘤患者血清p21水平增高(7/18)；而未发展为肿瘤的28例病人中仅有2例p21水平增高(2/28)，两者差异有显著性(P=0.012)。Vainio等[8]在研究K-ras基因突变频率较高的肺腺癌中石棉与吸烟的影响时，发现K-ras基因突变与患者肺中石棉含量相关。石棉在细胞癌变过程中引起靶细胞的形态转化和永生化，但H-ras基因突变常在细胞癌变后发生。Barrett[9]认为:H-ras基因突变可能不是石棉作用的直接结果。Lamb等[10]从3个人间皮瘤组织中分离出DNA，转染NIH/3T3细胞没有致瘤性。从裸鼠肿瘤中分离出DNA，再次转染，在5周的潜伏期内进行致癌性评价，显示高度阳性。用Southern杂交分析NIH/3T3细胞DNA，结果发现H-ras、K-ras和N-ras基因都是和鼠基因高度同源，即检测不到人的间皮瘤基因。但用Alu重复序列(人类所特有的序列)DNA探针实验确实能够检测出初次及再次转染的DNA中含有人的序列。这些结果显示:人间皮瘤所含有的活化基因可能不属于ras基因家族。Metcalf等[11]用PCR扩增后直接测定基因组序列的方法检查了来自17个个体的20个人间皮瘤细胞K-ras基因第12、13、61密码子单碱基改变的频率，未发现K-ras基因突变。
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美国的Mossman实验室于1993年开始对石棉与靶细胞中c-fos和c-jun的表达进行了深入的研究。c-fos和c-jun是一组早期反应基因家族，在生长因子、肿瘤促进剂等因素的作用下，这组基因首先转录，通过其编码产物启动与细胞分裂有关的其它基因的转录，促使细胞由G1期进入S期，加速细胞增生。表达紊乱可引起细胞异常增生和转化[12]。
Heintz等[13]用青石棉和温石棉处理大鼠胸膜间皮细胞(RPM)和仓鼠气管上皮细胞(HTE)，研究石棉诱导c-fos和c-jun mRNA表达的情况，结果表明青石棉和温石棉都能引起RPM细胞中c-fos mRNA显著而持久地表达，但在HTE细胞中c-fos mRNA表达水平不显著;而对这两种细胞石棉均能引起c-jun mRNA显著而持久的表达。Timblin等[14]研究发现:石棉和H2O2都能激活AP-1相关基因(c-fos，c-jun)的转录活性，导致细胞过度增生及表型改变。Janssen等[15]的研究表明：石棉能使细胞内巯基水平下降，而细胞内巯基水平能影响c-fos和c-jun的表达，提示调控石棉诱导c-fos和c-jun表达的信号通路中有氧化还原电位敏感元件的存在。还有实验表明:石棉能刺激促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的活力，MAPK进入核内，使早期反应基因转录增强[11]。
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在石棉所致的人恶性间皮瘤中可检测到c-sis原癌基因表达增强[16]。c-sis基因的产物与血小板衍生生长因子(PDGF)的B链同源。若该产物持续大量表达，可使具有PDGF受体的细胞接受c-sis基因表达产物的刺激，从而不断生长，导致恶变。c-sis蛋白也可直接激活处于感受态的c-fos和c-jun等原癌基因，对细胞增生起正调控作用。
二、石棉致癌与抑癌基因
抑癌基因在细胞的生长和分化中起负调控作用。已发现的抑癌基因有20多种。石棉相关肿瘤中研究的抑癌基因有p53、Rb、p16、NF2、WT-1等。
p53基因位于染色体17p，编码的p53蛋白是一核内转录因子，可激活某些抑制细胞增生的基因,突变使其丧失抑癌功能。Cote等[17]用Northern杂交和直接测序的方法研究4个恶性间皮瘤细胞株p53基因的改变情况，发现两个细胞株中分别在175和245密码子发生点突变；一个细胞株p53基因不能表达蛋白，成为无效细胞。Metcalf等[11]用同样的方法检测了17例恶性间皮瘤的20个细胞株中p53突变情况，同Cote的研究结果相似,也有两个细胞株发生了点突变，分别在245和278密码子;1个细胞株p53基因不能表达蛋白。Nuorva等[18]用免疫组化的的方法分析了70例原发性肺癌病人p53蛋白异常积累与石棉暴露的关系，结果发现石棉暴露病人p53蛋白异常积累率高于非石棉暴露病人(P=0.027);35%的p53蛋白阳性病人每平方厘米肺组织中有1个以上石棉小体。提示石棉暴露与p53蛋白异常积累有关。作者认为p53基因突变与石棉暴露有关。国内刘秉慈等[19]对10例石棉相关肿瘤p53基因的突变情况进行了研究,10例病例中，PCR-SSCP分析发现有7例(8处,70%)p53基因发生突变;免疫组化观察发现p53基因突变体蛋白有5例阳性(50%),其中有4例在两种方法中均检测为阳性，有较好的一致性。
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在石棉相关间皮瘤中，可发生p16基因丢失或突变，但Rb基因突变不发生或很少发生。p16基因位于人染色体9p21，其编码的p16蛋白是细胞周期蛋白依赖激酶4(CDK4)的抑制因子，与细胞周期蛋白cyclin竞争CDK4。p16蛋白失活时，CDK4与cyclinD1形成复合物，CDK4处于激活状态，作用于其底物Rb蛋白,使Rb蛋白磷酸化而失去对细胞周期的调控。因此，p16基因的缺失或突变能产生与Rb基因失活相同的效果[20]。
抑癌基因NF2定位于染色体22q。Bianchi等[21]研究了15个恶性间皮瘤细胞株和7个原发肿瘤的NF2基因突变情况，发现有8个细胞株和6个原发性肿瘤的NF2基因发生突变。表明在恶性间皮瘤中NF2基因存在高频突变，可能对间皮瘤的发生发展起重要作用。
抑癌基因WT-1在间皮细胞中正常表达，而在恶性间皮瘤中可发现其突变[22]。Kleimenova等[23]利用石棉诱发的大鼠间皮瘤模型研究,发现了抑癌基因WT-1出现改变。
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抑癌基因虽然发现较晚，但由于其突变在肿瘤发生中的重要作用而引起人们的关注。在石棉相关肿瘤中，可检测到抑癌基因有p53、p16、NF2、WT-1等的突变。
三、小结
在肿瘤的发生发展过程中，必然涉及多个原癌基因的激活和抑癌基因的失活。在石棉致癌过程中，石棉诱发活性氧自由基，后者介导的遗传损伤及石棉纤维与靶细胞直接作用，引起染色体数目和结构的畸变，导致原癌基因的激活和抑癌基因的失活(可能包括尚未发现或未明确作用的基因)。在石棉相关肿瘤中，ras基因突变的检测结果很不一致，但ras基因表达产物p21蛋白量与人肺中石棉含量相关，提示石棉纤维可能通过某种机制，间接促进ras基因的表达。石棉纤维可通过多种途径诱导靶细胞c-fos和c-jun基因表达增强，通过其编码产物启动与细胞分裂有关的其它基因的转录，促进细胞增生。在石棉纤维所致间皮瘤细胞中可检测到c-sis的表达增强，其编码产物的大量表达促进细胞增生。野生型p53基因对细胞增生起负调作用。石棉所致间皮瘤中发生p53基因突变，使其丧失抑癌功能。另一个抑癌基因Rb不发生或很少发生突变，但p16基因的突变可产生与Rb基因突变相同的效果。在石棉所致间皮瘤中，可检测到抑癌基因NF2、WT-1的改变。
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总之，石棉纤维在其致癌的过程中，通过引起多种癌基因的激活和抑癌基因的失活，使细胞增生调控发生紊乱，促进细胞增生；在细胞增生过程中，增加基因突变的机会，从而使靶细胞表型改变，细胞恶性变，最终发展为肿瘤。
四、问题与展望
石棉致癌机制的研究已进行了多年，但其致癌的分子机制的研究则处于起步阶段，许多问题有待于深入研究和探讨,如石棉致癌与其它癌基因和抑癌基因(那些尚未发现或未明确作用的基因)的关系、各种癌基因激活和抑癌基因失活的协同关系、石棉相关肿瘤与一般肿瘤中癌基因表达的异同等。间皮瘤的长潜伏期说明癌变过程中涉及多基因位点的改变。要在100多个癌基因或抑癌基因中找出那些在石棉致癌中发挥作用的基因，阐明石棉致癌发生发展的分子机制，尚需许多艰巨的工作，但这毕竟为致癌机制的研究开辟了一条道路，为揭示石棉致癌的机制带来希望。
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(收稿：1997-08-28 修回：1997-12-10), 百拇医药