恶性间皮瘤p16蛋白表达的研究
作者：袁素波 杨青 王治明
单位：610041 成都，华西医科大学公共卫生学院(袁素波现在军事医学科学院毒物药物研究所工作)
关键词：恶性间皮瘤；p16蛋白；免疫组化染色
中华劳动卫生职业病杂志980509 【摘要】 目的 研究恶性间皮瘤与p16蛋白表达的关系。 方法 利用微波煮沸脱交联SP法,对34例恶性间皮瘤病理标本进行了p16蛋白表达的研究。 结果 p16蛋白阳性表达率53%(18/34)，47%(16/34)的病例细胞内缺乏p16蛋白的表达。多数存在p16蛋白表达的病例没有发现p53基因的点突变；反之，存在p53基因的点突变的病例多数都没有p16蛋白的表达。p16蛋白表达与p53基因点突变之间呈明显的负相关关系。 结论 恶性间皮瘤可能同时存在p53和p16基因的异常，肿瘤组织细胞内缺乏p16蛋白的表达可能与p16基因的纯合缺失有关。
, http://www.100md.com
A study on p16 protein expression in human malignant mesothelioma Yuan Subo,Yang Qing,Wang Zhiming.Public Hygiene College,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To study the relation between malignant mesothelioma and p16 protein expression.Methods Using immunohistochemical stain by means of microwave oven treatment and streptavidin-peroxidase complex technique,p16 protein expression was detected.Results The positive rate of p16 protein expression was 53%(18/34) and negative rate was 47%(16/34).Most cases with positive p16 protein expression were negative in p53 gene point mutation and most cases existed p53 gene point mutations were negative in p16 protein expression.There was negative correlation between p53 gene point mutation and p16 protein expression.Conclusion Abnormal alteration of p53 and p16 gene may occur simultaneously in malignant mesothelioma.The absence of p16 protein expression in tumor cells may relate to the homozygous deletion of p16 gene.
, 百拇医药
【Key words】 Malignant mesothelioma p16 protein Immunohistochemical stain
p16基因定位于9p21-22[1]，恶性间皮瘤染色体核型分析显示：该区域内存在染色体的同源缺失[2]。据此推测染色体的缺失可能会影响和累及p16基因。p16基因对细胞周期的调控与p53和Rb蛋白密切相关，p53蛋白通过其下游效应蛋白p21参与了细胞周期的调控[3]。Tam等[4]对转化细胞p16表达水平的研究表明：p16过表达的细胞系无一例外的有p53或Rb蛋白的失活，提示:在恶性转化细胞中,两基因可同时出现异常。本室先前对p53基因的研究结果表明：恶性间皮瘤p53基因的点突变率达56%[5]。因此，p53基因的较高突变率和p16蛋白表达之间的关系是本研究所关心的问题。
材料与方法
, 百拇医药
1.标本的来源与收集：见文献[6]。
2.试剂：免疫组化试剂p16多克隆抗体为美国Santa Cruz生物技术公司产品。
3.实验方法：采用微波煮沸脱交联SP(streptavidin-peroxidase)法进行染色：石蜡包埋组织作4 μm厚切片，常规脱蜡水化，3%过氧化氢浸泡10分钟以阻断内源性过氧化物酶，水洗后置切片于0.01 mol/L(pH6.1)柠檬酸缓冲液中，微波煮沸5分钟，取出冷至室温后用TBS洗3次;继之以5%非免疫小牛血清封闭背景30分钟，依次加入一抗,4℃湿盒过夜，生物素化二抗及SP复合物按试剂盒说明加入。实验以TBS代替一抗作阴性对照、以已知p16阳性的乳腺癌标本为系统有效参照。结果判定以胞浆出现棕黄色染色即为阳性，否则为阴性。
结 果
观察结果表明：p16蛋白的阳性着色以胞浆为主，也有位于胞核和细胞膜的，染色情况见图1。已知p16阳性的乳腺癌标本的着色情况与本组病例相同。
, 百拇医药
从表1可见：34例恶性间皮瘤p16蛋白免疫组化染色阳性18例，阳性率53%。间皮瘤不同组织学类型的阳性表达率分别为：上皮型66%(4/6)、混合型53%(8/15)、纤维型46%(6/13)。经χ2检验，各型阳性率间差异无显著性。
表1 恶性间皮瘤p16蛋白免疫组化染色结果
Table 1 Results of immunohistochemical stain
for p16 protein in mesotheliomas 类 型
Type
例 数
n
阳性例数
, 百拇医药
Positive number
阳性率
Positivity(%)
上皮型
Epithelial
6
4
66
纤维型
Fibrous
13
6
46
, 百拇医药
混合型
Mixed
15
8
53
总 计
Total
34
18
53
讨 论
p16基因是继p53抑癌基因之后人类发现的又一重要的肿瘤抑制基因,其基因产物p16蛋白功能的实现是通过与细胞周期素依赖激酶4(CDK4)结合，拮抗CDK4的作用,从而阻止细胞周期进程，使细胞增殖受阻[3]。对肿瘤细胞株和肿瘤组织p16基因的研究显示：p16基因的平均纯合缺失率,肿瘤细胞株为46%[7]、恶性间皮瘤细胞株为85%(34/40)、恶性间皮瘤组织为22%(5/23)[8]。我们对恶性间皮瘤病理组织p16蛋白阳性表达率的检测结果显示：阳性率53%(18/34)、阴性率47%(16/34)。文献报道：p16基因在多种肿瘤中的变异情况均以高频缺失和低频突变为特征。结合这次实验结果，我们认为恶性间皮瘤细胞内缺乏p16蛋白表达是基因纯合缺失的标志，免疫组化染色结果可初步提示基因的变异情况，为进一步的分子水平研究提供了重要信息。
, http://www.100md.com
p53和p16基因是目前人类肿瘤发病相关性最强的抑癌基因，在多种肿瘤类型中均已证实了两基因的异常和失活。本室另外的研究结果表明：在34例恶性间皮瘤患者中，携带有p53基因点突变的病例(16例)多同时缺乏p16蛋白表达(11例)，基因突变和蛋白表达之间呈负相关关系，相关系数r=-0.741 8,P<0.01，相关具有显著意义。提示p53基因点突变可能和p16基因纯合缺失并存。相反，13例具有p16蛋白表达的病例其p53基因点突变为阴性，这部分病例既没有发生p53基因的点突变,也不存在p16基因的纯合缺失[5]。Tam[4]在转化细胞p16与p53、RB的相关关系研究中也发现：p16过表达的细胞系无一例外的有p53或RB蛋白的失活。此次实验结果初步提示：恶性间皮瘤的癌变过程中可能同时涉及了p53和p16基因的异常，两者之间存在某种关联，但这种关联的本质尚需更多的研究资料来证实。
, http://www.100md.com
图1 恶性间皮瘤p16蛋白免疫组化染色阳性(a:SP×200; b:SP×400)
Fig 1 Malignant mesothelioma,positive immunohistochemical stain for p16 protein(a:SP×200; b:SP×400)
本研究受国家自然科学基金和美国中华医学基金会资助参考文献
1 Kamb A,Gruis NA,Weavet FW,et al.A cell cycle regular potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994,264:436～439.
2 Tiainen M,Tammilehto L,Mattson K,et al.Non-random chromosomal abnormalities in malignant pleural mesothelioma.Cancer Genet Cytogenet,1988,33:251～274.
, 百拇医药
3 Serrano M,Hannon GJ,Beach D.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.Nature,1993,366:704～707.
4 Tam SW,Shay JW,Pagauo M.Differential expression and cell cycle regulation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p16 ink4.Cancer Res,1994,54:5816～5820.
5 袁素波，杨青，翟朝阳，等.p53基因点突变和蛋白表达的研究.中国药理与毒理学杂志,1998,4:1～6.
6 袁素波，杨青，王治明.恶性间皮瘤免疫组化诊断30例.中华劳动卫生与职业病杂志,1998,5:280～282.
, http://www.100md.com
7 Miller DS,Takeuchi CW,Bigner SH,et al.Alteration of CDKN2(p16) in non-small cell lung cancer.Gene Chromosomes Cancer,1995,14:164～170.
8 Cheng JQ,Jhanwar SC,Klein WM,et al.p16 alterations and delection mapping of 9p21-p22 in malignant mesothelioma.Cancer Res,1994,54:5547～5551.
(收稿：1997-08-19 修回：1998-01-05), 百拇医药
单位：610041 成都，华西医科大学公共卫生学院(袁素波现在军事医学科学院毒物药物研究所工作)
关键词：恶性间皮瘤；p16蛋白；免疫组化染色
中华劳动卫生职业病杂志980509 【摘要】 目的 研究恶性间皮瘤与p16蛋白表达的关系。 方法 利用微波煮沸脱交联SP法,对34例恶性间皮瘤病理标本进行了p16蛋白表达的研究。 结果 p16蛋白阳性表达率53%(18/34)，47%(16/34)的病例细胞内缺乏p16蛋白的表达。多数存在p16蛋白表达的病例没有发现p53基因的点突变；反之，存在p53基因的点突变的病例多数都没有p16蛋白的表达。p16蛋白表达与p53基因点突变之间呈明显的负相关关系。 结论 恶性间皮瘤可能同时存在p53和p16基因的异常，肿瘤组织细胞内缺乏p16蛋白的表达可能与p16基因的纯合缺失有关。
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A study on p16 protein expression in human malignant mesothelioma Yuan Subo,Yang Qing,Wang Zhiming.Public Hygiene College,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041
【Abstract】 Objective To study the relation between malignant mesothelioma and p16 protein expression.Methods Using immunohistochemical stain by means of microwave oven treatment and streptavidin-peroxidase complex technique,p16 protein expression was detected.Results The positive rate of p16 protein expression was 53%(18/34) and negative rate was 47%(16/34).Most cases with positive p16 protein expression were negative in p53 gene point mutation and most cases existed p53 gene point mutations were negative in p16 protein expression.There was negative correlation between p53 gene point mutation and p16 protein expression.Conclusion Abnormal alteration of p53 and p16 gene may occur simultaneously in malignant mesothelioma.The absence of p16 protein expression in tumor cells may relate to the homozygous deletion of p16 gene.
, 百拇医药
【Key words】 Malignant mesothelioma p16 protein Immunohistochemical stain
p16基因定位于9p21-22[1]，恶性间皮瘤染色体核型分析显示：该区域内存在染色体的同源缺失[2]。据此推测染色体的缺失可能会影响和累及p16基因。p16基因对细胞周期的调控与p53和Rb蛋白密切相关，p53蛋白通过其下游效应蛋白p21参与了细胞周期的调控[3]。Tam等[4]对转化细胞p16表达水平的研究表明：p16过表达的细胞系无一例外的有p53或Rb蛋白的失活，提示:在恶性转化细胞中,两基因可同时出现异常。本室先前对p53基因的研究结果表明：恶性间皮瘤p53基因的点突变率达56%[5]。因此，p53基因的较高突变率和p16蛋白表达之间的关系是本研究所关心的问题。
材料与方法
, 百拇医药
1.标本的来源与收集：见文献[6]。
2.试剂：免疫组化试剂p16多克隆抗体为美国Santa Cruz生物技术公司产品。
3.实验方法：采用微波煮沸脱交联SP(streptavidin-peroxidase)法进行染色：石蜡包埋组织作4 μm厚切片，常规脱蜡水化，3%过氧化氢浸泡10分钟以阻断内源性过氧化物酶，水洗后置切片于0.01 mol/L(pH6.1)柠檬酸缓冲液中，微波煮沸5分钟，取出冷至室温后用TBS洗3次;继之以5%非免疫小牛血清封闭背景30分钟，依次加入一抗,4℃湿盒过夜，生物素化二抗及SP复合物按试剂盒说明加入。实验以TBS代替一抗作阴性对照、以已知p16阳性的乳腺癌标本为系统有效参照。结果判定以胞浆出现棕黄色染色即为阳性，否则为阴性。
结 果
观察结果表明：p16蛋白的阳性着色以胞浆为主，也有位于胞核和细胞膜的，染色情况见图1。已知p16阳性的乳腺癌标本的着色情况与本组病例相同。
, 百拇医药
从表1可见：34例恶性间皮瘤p16蛋白免疫组化染色阳性18例，阳性率53%。间皮瘤不同组织学类型的阳性表达率分别为：上皮型66%(4/6)、混合型53%(8/15)、纤维型46%(6/13)。经χ2检验，各型阳性率间差异无显著性。
表1 恶性间皮瘤p16蛋白免疫组化染色结果
Table 1 Results of immunohistochemical stain
for p16 protein in mesotheliomas 类 型
Type
例 数
n
阳性例数
, 百拇医药
Positive number
阳性率
Positivity(%)
上皮型
Epithelial
6
4
66
纤维型
Fibrous
13
6
46
, 百拇医药
混合型
Mixed
15
8
53
总 计
Total
34
18
53
讨 论
p16基因是继p53抑癌基因之后人类发现的又一重要的肿瘤抑制基因,其基因产物p16蛋白功能的实现是通过与细胞周期素依赖激酶4(CDK4)结合，拮抗CDK4的作用,从而阻止细胞周期进程，使细胞增殖受阻[3]。对肿瘤细胞株和肿瘤组织p16基因的研究显示：p16基因的平均纯合缺失率,肿瘤细胞株为46%[7]、恶性间皮瘤细胞株为85%(34/40)、恶性间皮瘤组织为22%(5/23)[8]。我们对恶性间皮瘤病理组织p16蛋白阳性表达率的检测结果显示：阳性率53%(18/34)、阴性率47%(16/34)。文献报道：p16基因在多种肿瘤中的变异情况均以高频缺失和低频突变为特征。结合这次实验结果，我们认为恶性间皮瘤细胞内缺乏p16蛋白表达是基因纯合缺失的标志，免疫组化染色结果可初步提示基因的变异情况，为进一步的分子水平研究提供了重要信息。
, http://www.100md.com
p53和p16基因是目前人类肿瘤发病相关性最强的抑癌基因，在多种肿瘤类型中均已证实了两基因的异常和失活。本室另外的研究结果表明：在34例恶性间皮瘤患者中，携带有p53基因点突变的病例(16例)多同时缺乏p16蛋白表达(11例)，基因突变和蛋白表达之间呈负相关关系，相关系数r=-0.741 8,P<0.01，相关具有显著意义。提示p53基因点突变可能和p16基因纯合缺失并存。相反，13例具有p16蛋白表达的病例其p53基因点突变为阴性，这部分病例既没有发生p53基因的点突变,也不存在p16基因的纯合缺失[5]。Tam[4]在转化细胞p16与p53、RB的相关关系研究中也发现：p16过表达的细胞系无一例外的有p53或RB蛋白的失活。此次实验结果初步提示：恶性间皮瘤的癌变过程中可能同时涉及了p53和p16基因的异常，两者之间存在某种关联，但这种关联的本质尚需更多的研究资料来证实。
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图1 恶性间皮瘤p16蛋白免疫组化染色阳性(a:SP×200; b:SP×400)
Fig 1 Malignant mesothelioma,positive immunohistochemical stain for p16 protein(a:SP×200; b:SP×400)
本研究受国家自然科学基金和美国中华医学基金会资助参考文献
1 Kamb A,Gruis NA,Weavet FW,et al.A cell cycle regular potentially involved in genesis of many tumor types.Science,1994,264:436～439.
2 Tiainen M,Tammilehto L,Mattson K,et al.Non-random chromosomal abnormalities in malignant pleural mesothelioma.Cancer Genet Cytogenet,1988,33:251～274.
, 百拇医药
3 Serrano M,Hannon GJ,Beach D.A new regulatory motif in cell-cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.Nature,1993,366:704～707.
4 Tam SW,Shay JW,Pagauo M.Differential expression and cell cycle regulation of the cyclin-dependent kinase inhibitor p16 ink4.Cancer Res,1994,54:5816～5820.
5 袁素波，杨青，翟朝阳，等.p53基因点突变和蛋白表达的研究.中国药理与毒理学杂志,1998,4:1～6.
6 袁素波，杨青，王治明.恶性间皮瘤免疫组化诊断30例.中华劳动卫生与职业病杂志,1998,5:280～282.
, http://www.100md.com
7 Miller DS,Takeuchi CW,Bigner SH,et al.Alteration of CDKN2(p16) in non-small cell lung cancer.Gene Chromosomes Cancer,1995,14:164～170.
8 Cheng JQ,Jhanwar SC,Klein WM,et al.p16 alterations and delection mapping of 9p21-p22 in malignant mesothelioma.Cancer Res,1994,54:5547～5551.
(收稿：1997-08-19 修回：1998-01-05), 百拇医药