接苯人群生物标志物研究进展
作者：李桂兰 吴春玲 尹松年
单位：100050 北京，中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所
关键词：
中华劳动卫生职业病杂志/990432 生物标志物可以分为四大类：内剂量、生物有效量(DNA、RNA和蛋白质加合物)、早期生物效应和个体易感性标志物。其中内剂量及生物有效量标志物都可作为接触标志物。
一、内剂量标志物
所谓内剂量系指职业接触、环境接触化学物进入机体内的量。内剂量与外剂量、生物有效量及生物效应有直接关联。
苯只有经代谢活化后才能行使其致毒、致癌作用,因此人体接触苯后，通过机体代谢作用生成苯的各种活性代谢产物便成为接触苯后不同的内剂量标志物,样品多来源于血液和尿液。最有希望的代谢产物是反式,反式粘糠酸(trans-trans-muconic acid,t,t-MA)和苯巯基尿酸(S-phenyl morcapturic acid,S-PMA)[1]，可反映不同水平的接触。有报道石油化工区小学生尿液中S-PMA和t,t-MA含量比非职业性苯作业区居民尿中的含量增高。S-PMA是环状羟基化代谢产物，发现在烹调业工人中有剂量-反应关系；汽车修理工人平均接苯水平为1 ppm，S-PMA较t,t-MA有更强的接触-反应关系。化工厂工人接苯几何均数为0.1 ppm，接苯工人并吸烟者尿液排出S-PMA和t,t-MA与对照人群比较有统计学差异,故S-PMA被认为是低苯接触时特异而灵敏的生物标志物。由于食品添加剂(sorbic acid)也可代谢为t,t-MA，故低苯接触时t,t-MA不是特异的。
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二、生物有效量标志物
1.DNA加合物:苯-DNA加合物的研究至今仍停留在动物实验研究阶段，由于方法灵敏度的限制,尚未用于人群。我们在80年代末开始苯-DNA加合物的实验研究，并首次在1993年看到苯在小鼠体内至少可形成2种加合物斑点，且在染苯后可持续存在3周[2]。之后,Bodell等[3]给小鼠注射苯(IP)，1次/d，未见加合物产生,但剂量为440 mg/kg，2次/d，共1～7天时，在骨髓细胞和WBC中均发现1个主要的和2个小的加合物斑点。骨髓细胞与WBC加合物相关系数r=0.95。经7天处理的小鼠骨髓细胞数从1.6×107下降到0.85×107,显示髓性毒性,并与加合物水平平行。
2.蛋白质加合物:苯氧化物(BO)可与血红蛋白(Hb)和血清蛋白(Alb)中的半胱氨酸结合形成蛋白质加合物。在80年代末,只在动物实验中证实苯-蛋白质加合物的存在。1998年Connell等[4]开始了人群的研究，先用三氟乙酰酐和甲基磺酸盐处理蛋白质,再用GC-MS分析BO-Hb和BO-Alb加合物水平，对照组分别为32.0和103 pmol/g，而接触组分别为79.0和1 220 pmol/g。经统计学处理，二者差异均有显著性(P<0.000 1)。若按浓度分为低浓度组(≤31 ppm,21人)和高浓度组(>31 ppm,22人)，则BO-Hb加合物中值在对照组和这两个接触组分别为32.0、46.7和129.0 pmol/g Hb(r=0.67，P<0.000 1)。而Alb-BO加合物中值在这3个组分别为103(n=19)、351(n=7)和2 010(n=12)pmol/g，(r=0.90，P<0.000 1),首次证明人的蛋白加合物与苯接触水平有关。
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三、早期生物效应标志物
1.DNA氧化损伤:苯的酚类代谢物通过髓性过氧化物酶(MPO)进一步氧化为半醌、醌类代谢产物，可直接与大分子结合并产生有氧基团。羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)可反映羟基基团攻击DNA的能力。氢醌(HQ)、苯三醇均可使小鼠体内、体外8-OHdG增高，但苯三醇作用更明显。有报道意大利汽车加油站工人尿液8-OHdG排出增高，与动物实验及体外实验结果一致[5]。以不同代谢产物酚、儿茶酚、HQ联合染毒，也使8-OHdG明显增高，而且酚+HQ的效力最大,说明了多种代谢产物参与了苯的毒性。
8-OHdG的形成能引起突变,特别是G→T和A→C碱基对的替换,若此损伤不被修复则可引起链断裂。DNA的断裂也可由DNA中的组蛋白的损伤而引起DNA的折叠和组装(packaging)所致。
2.DNA链断裂损伤:单个细胞凝胶电泳彗星实验证实苯是染色体损伤、断裂效应的典型化学物。彗星实验可简易筛检DNA氧化损伤引起的链断裂。1997年召开的国际彗星实验研讨会，认为该方法敏感、快速、简便、重复性好，并可直接观察单个细胞的DNA损伤[6]，从而成为近年最流行的DNA损伤检测方法。实验可在中性(双链断裂)和碱性条件下进行。碱性条件可检出脱碱基作用(abasic sites)、其它碱性不稳定区、中性碱基或核苷切除修复。总之，彗星实验可测体内、体外DNA损伤，并可测不同取样时间的DNA修复作用。
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袁野等[7]测定了苯作业工人(苯中毒组,苯接触高、低浓度组)和非苯作业对照组工人的DNA损伤率,结果发现苯中毒组DNA损伤发生率(分级)明显高于对照组(P<0.01)，且损伤程度严重；高浓度组也高于对照组，但差异不显著。倪祖尧等[8]测定了苯、甲苯、二甲苯工人的彗星细胞率，发现苯、甲苯、二甲苯浓度分别为15、20～40、50～150组与20～50、70～256、80～490 mg/m3组的彗星细胞率明显高于对照组，而且证明混苯浓度越高的工厂其工人的彗星细胞百分数越高。
3.体细胞突变:苯及其代谢产物不像其它致癌剂，传统致癌剂在Ames Salmonella Test有很高的阳性突变率，而苯不能。糖蛋白A(GPA)突变法可证实苯致人体骨髂细胞的突变是一种广谱突变，包括点突变、缺失、染色体染色质间的相互反应等。利用外周血红细胞突变的表达可检验骨髓细胞中的干细胞或红细胞前身细胞的突变。GPA可为红细胞表面蛋白编码,在红细胞中存在有M和N两种形式，即MN杂合子，为正常。检验结果表明M型丢失，即NQ型和N型重复性突变为NN型，高接苯组(24人)与正常工人(23人)比较，NN型基因突变细胞频率升高，但两组NQVf值(变异系数)没有显著差异。有趣的是发现这种NN突变细胞频数与职业性终生累积接苯量有明显的剂量-反应关系(P=0.005),而累积接苯量应与苯致白血病危险性相关性最强，因此GPA可能是苯和其它致白血病因子作用的早期生物效应指标。GPA的M等位基因的丢失和NN等位基因的重复可能来源于有丝分裂过程的基因重组、染色体丢失或基因转化，与工人染色体数量畸变显著差异结果是一致的。而NQ突变可反映点突变、缺失、基因失活机制[9，10]。
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4.癌基因突变:夏俊杰等[11]从4个苯作业厂选择103名苯作业工人，进行多种癌基因突变检测,作者所扩增的目的基因为108 dp，然后用3种特异性的Ki-ras基因探针：12位点正常G12探针、12位点G→A突变的S12探针和12位点G→T突变的C12探针做Dot-Blot杂交。结果发现有4例外周血白细胞有C-Ki-ras基因12位点G→T突变，其接苯工龄6～10年，苯浓度范围41～590 mg/m3。其中3例在纯苯组，占该组人数3/18，1例在混苯长工龄组(7年)，占该组人数1/41，而混苯短工龄组(0.5年)和70名对照工人未检出该基因突变，所检的C-Ki-ras基因12位点G→A及c-myc基因均未在两组工人中检出阳性和扩增现象。夏昭林等[12]在41名苯作业工人中(工龄平均6.5年，全为女性)，检出1名GGT→TGT(Gly→Cys)突变，苯浓度平均为47 mg/m3。
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四、个体易感性标志物
个体易感性研究的目的主要是揭示在同一职业接触条件下，为什么有人得病有人不得病的本质。个体易感性研究，包括代谢表型和基因型的研究、DNA修复、营养状况等。关于苯的个体易感性研究目前仅限于代谢表型和基因型的研究。代谢产物和代谢快慢型的分析为代谢表型,而基因型系指负责催化代谢某致癌剂、化学物的酶的基因多态性。个体易感性研究主要是评价个体的先天因素在职业、环境接触化学物致癌、致病中的易感作用。苯本身不致癌，它是通过代谢活化产生有毒代谢产物而致癌的。因此负责苯活化代谢的酶(代谢一型)和负责解毒的酶(代谢二型)便成为研究的焦点。Rothman等[13]基于苯代谢酶CYP2E1活力增高而苯解毒酶(NQO1)活力降低，可使个体对苯的血液毒性更加敏感这一假说,及苯中毒与其后发展为非淋巴细胞白血病和骨髓发育不良症密切相关的危险人群为依据(RR=70.6),用与苯代谢类似的无毒化学物——氯唑沙宗(chlorzoxazone)在尿中的代谢产物(fe6-OH)排出的快慢来决定代谢表型快慢，而遗传型是用CYP2E1酶和NQO1609C→T的纯合子突变(此酶活力完全丧失)，用PCR-RFLP分析检出。结果表明fe6-OH代谢快型与代谢慢型比较，快型苯中毒(血液毒性)的危险性增高2.6倍。NQO1609C→T突变纯合子与杂合子或野生型比较，NQO1609C→T突变纯合子苯血液毒性危险性增高2.4倍,但fe6-OH代谢快型并有两个NQO1609C→T突变拷贝个体，苯血液毒性危险性较fe6-OH代谢慢型并有一个或两个野生型个体增高7.6倍,而与CYP2E1酶的Pstl/Rsal酶切多态性无关。
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参考文献
[1] Weiselc,YR,Roy A,et al.Biomarkers of environmental benzene exposure.Environ Health Perspect，1996,104(Suppl 6):1141-1146.
[2] 王春光，李桂兰，尹松年.苯染毒小鼠体内DNA加合物及其持续时间的研究.中华预防医学杂志，1993，11：344-345.
[3] Bodell WJ,Pathak DN,Levay G,et al.Investigation of the DNA adduct formed in B6C3F1 mice treated with benzene:Implications for molecular dosimetry.Environ Health Perspect,1996,104(Suppl 6):1189-1193.
, 百拇医药
[4] Connell KY,Rothman N,Smith MT,et al.Hemoglobin and albumin adducts of benzene oxide among workers exposed to high level of benzene.Carcinogenesis,1998,19:1565-1571.
[5] Lagorios T,Forastiere F,Irons R,et al.Exposure to benzene and urinary concentration of 8-hydroxydeoxyguanosine,a biological marker of oxidative damage to DNA.Occup Environ Med,1994,51:793-796.
[6] Anderson D,Michael JP.The International commet assay workshop.Mutagenesis，1998,13:67-73.
, 百拇医药
[7] 袁野，邬堂春，陈胜，等.苯作业工人淋巴细胞DNA损伤的研究.工业卫生与职业病，1996，22：80-82.
[8] 倪祖尧，逢兵，孟建峰，等.单细胞电泳检测接触苯、甲苯和二甲苯工人外周血细胞DNA损伤.卫生毒理学杂志，1996，10：267-268.
[9] Smith MT.The mechanism of benzene-induced leukemia:A hypothesis.Environ Health Perspect,1996,104(Suppl 6):1219-1225.
[10] Rothman N,Haas R,Hayes RB,et al.Benzene induces gene-duplication but not geneinactivating mutations at the glycophorin A locu in exposed humans.Proc Natl Acad Sci USA Med Sci,1995,92:4069-4073.
, http://www.100md.com
[11] 夏俊杰，张国高，毕勇毅，等.接触苯工人白细胞癌基因激活的研究.中华劳动卫生职业病杂志，1994,12:79-82.
[12] 夏昭林，金锡鹏，袁弥涛，等.苯作业工人白细胞Ki-ras癌基因点突变分子检测初探.中国工业医学杂志，1995,8:193-195.
[13] Rothman N,Smith MT,Hayes RB,et al.Benzene poisoning,a risk fator for hematological malignancy,is associated with the NQO1609C→T mutation and rapid fractional excretion of chlorzoxazone.Cancer Res,1997,57:2839-2842.
(收稿：1998-02-14 修回：1999-05-28), http://www.100md.com
单位：100050 北京，中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所
关键词：
中华劳动卫生职业病杂志/990432 生物标志物可以分为四大类：内剂量、生物有效量(DNA、RNA和蛋白质加合物)、早期生物效应和个体易感性标志物。其中内剂量及生物有效量标志物都可作为接触标志物。
一、内剂量标志物
所谓内剂量系指职业接触、环境接触化学物进入机体内的量。内剂量与外剂量、生物有效量及生物效应有直接关联。
苯只有经代谢活化后才能行使其致毒、致癌作用,因此人体接触苯后，通过机体代谢作用生成苯的各种活性代谢产物便成为接触苯后不同的内剂量标志物,样品多来源于血液和尿液。最有希望的代谢产物是反式,反式粘糠酸(trans-trans-muconic acid,t,t-MA)和苯巯基尿酸(S-phenyl morcapturic acid,S-PMA)[1]，可反映不同水平的接触。有报道石油化工区小学生尿液中S-PMA和t,t-MA含量比非职业性苯作业区居民尿中的含量增高。S-PMA是环状羟基化代谢产物，发现在烹调业工人中有剂量-反应关系；汽车修理工人平均接苯水平为1 ppm，S-PMA较t,t-MA有更强的接触-反应关系。化工厂工人接苯几何均数为0.1 ppm，接苯工人并吸烟者尿液排出S-PMA和t,t-MA与对照人群比较有统计学差异,故S-PMA被认为是低苯接触时特异而灵敏的生物标志物。由于食品添加剂(sorbic acid)也可代谢为t,t-MA，故低苯接触时t,t-MA不是特异的。
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二、生物有效量标志物
1.DNA加合物:苯-DNA加合物的研究至今仍停留在动物实验研究阶段，由于方法灵敏度的限制,尚未用于人群。我们在80年代末开始苯-DNA加合物的实验研究，并首次在1993年看到苯在小鼠体内至少可形成2种加合物斑点，且在染苯后可持续存在3周[2]。之后,Bodell等[3]给小鼠注射苯(IP)，1次/d，未见加合物产生,但剂量为440 mg/kg，2次/d，共1～7天时，在骨髓细胞和WBC中均发现1个主要的和2个小的加合物斑点。骨髓细胞与WBC加合物相关系数r=0.95。经7天处理的小鼠骨髓细胞数从1.6×107下降到0.85×107,显示髓性毒性,并与加合物水平平行。
2.蛋白质加合物:苯氧化物(BO)可与血红蛋白(Hb)和血清蛋白(Alb)中的半胱氨酸结合形成蛋白质加合物。在80年代末,只在动物实验中证实苯-蛋白质加合物的存在。1998年Connell等[4]开始了人群的研究，先用三氟乙酰酐和甲基磺酸盐处理蛋白质,再用GC-MS分析BO-Hb和BO-Alb加合物水平，对照组分别为32.0和103 pmol/g，而接触组分别为79.0和1 220 pmol/g。经统计学处理，二者差异均有显著性(P<0.000 1)。若按浓度分为低浓度组(≤31 ppm,21人)和高浓度组(>31 ppm,22人)，则BO-Hb加合物中值在对照组和这两个接触组分别为32.0、46.7和129.0 pmol/g Hb(r=0.67，P<0.000 1)。而Alb-BO加合物中值在这3个组分别为103(n=19)、351(n=7)和2 010(n=12)pmol/g，(r=0.90，P<0.000 1),首次证明人的蛋白加合物与苯接触水平有关。
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三、早期生物效应标志物
1.DNA氧化损伤:苯的酚类代谢物通过髓性过氧化物酶(MPO)进一步氧化为半醌、醌类代谢产物，可直接与大分子结合并产生有氧基团。羟基脱氧鸟嘌呤(8-OHdG)可反映羟基基团攻击DNA的能力。氢醌(HQ)、苯三醇均可使小鼠体内、体外8-OHdG增高，但苯三醇作用更明显。有报道意大利汽车加油站工人尿液8-OHdG排出增高，与动物实验及体外实验结果一致[5]。以不同代谢产物酚、儿茶酚、HQ联合染毒，也使8-OHdG明显增高，而且酚+HQ的效力最大,说明了多种代谢产物参与了苯的毒性。
8-OHdG的形成能引起突变,特别是G→T和A→C碱基对的替换,若此损伤不被修复则可引起链断裂。DNA的断裂也可由DNA中的组蛋白的损伤而引起DNA的折叠和组装(packaging)所致。
2.DNA链断裂损伤:单个细胞凝胶电泳彗星实验证实苯是染色体损伤、断裂效应的典型化学物。彗星实验可简易筛检DNA氧化损伤引起的链断裂。1997年召开的国际彗星实验研讨会，认为该方法敏感、快速、简便、重复性好，并可直接观察单个细胞的DNA损伤[6]，从而成为近年最流行的DNA损伤检测方法。实验可在中性(双链断裂)和碱性条件下进行。碱性条件可检出脱碱基作用(abasic sites)、其它碱性不稳定区、中性碱基或核苷切除修复。总之，彗星实验可测体内、体外DNA损伤，并可测不同取样时间的DNA修复作用。
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袁野等[7]测定了苯作业工人(苯中毒组,苯接触高、低浓度组)和非苯作业对照组工人的DNA损伤率,结果发现苯中毒组DNA损伤发生率(分级)明显高于对照组(P<0.01)，且损伤程度严重；高浓度组也高于对照组，但差异不显著。倪祖尧等[8]测定了苯、甲苯、二甲苯工人的彗星细胞率，发现苯、甲苯、二甲苯浓度分别为15、20～40、50～150组与20～50、70～256、80～490 mg/m3组的彗星细胞率明显高于对照组，而且证明混苯浓度越高的工厂其工人的彗星细胞百分数越高。
3.体细胞突变:苯及其代谢产物不像其它致癌剂，传统致癌剂在Ames Salmonella Test有很高的阳性突变率，而苯不能。糖蛋白A(GPA)突变法可证实苯致人体骨髂细胞的突变是一种广谱突变，包括点突变、缺失、染色体染色质间的相互反应等。利用外周血红细胞突变的表达可检验骨髓细胞中的干细胞或红细胞前身细胞的突变。GPA可为红细胞表面蛋白编码,在红细胞中存在有M和N两种形式，即MN杂合子，为正常。检验结果表明M型丢失，即NQ型和N型重复性突变为NN型，高接苯组(24人)与正常工人(23人)比较，NN型基因突变细胞频率升高，但两组NQVf值(变异系数)没有显著差异。有趣的是发现这种NN突变细胞频数与职业性终生累积接苯量有明显的剂量-反应关系(P=0.005),而累积接苯量应与苯致白血病危险性相关性最强，因此GPA可能是苯和其它致白血病因子作用的早期生物效应指标。GPA的M等位基因的丢失和NN等位基因的重复可能来源于有丝分裂过程的基因重组、染色体丢失或基因转化，与工人染色体数量畸变显著差异结果是一致的。而NQ突变可反映点突变、缺失、基因失活机制[9，10]。
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4.癌基因突变:夏俊杰等[11]从4个苯作业厂选择103名苯作业工人，进行多种癌基因突变检测,作者所扩增的目的基因为108 dp，然后用3种特异性的Ki-ras基因探针：12位点正常G12探针、12位点G→A突变的S12探针和12位点G→T突变的C12探针做Dot-Blot杂交。结果发现有4例外周血白细胞有C-Ki-ras基因12位点G→T突变，其接苯工龄6～10年，苯浓度范围41～590 mg/m3。其中3例在纯苯组，占该组人数3/18，1例在混苯长工龄组(7年)，占该组人数1/41，而混苯短工龄组(0.5年)和70名对照工人未检出该基因突变，所检的C-Ki-ras基因12位点G→A及c-myc基因均未在两组工人中检出阳性和扩增现象。夏昭林等[12]在41名苯作业工人中(工龄平均6.5年，全为女性)，检出1名GGT→TGT(Gly→Cys)突变，苯浓度平均为47 mg/m3。
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四、个体易感性标志物
个体易感性研究的目的主要是揭示在同一职业接触条件下，为什么有人得病有人不得病的本质。个体易感性研究，包括代谢表型和基因型的研究、DNA修复、营养状况等。关于苯的个体易感性研究目前仅限于代谢表型和基因型的研究。代谢产物和代谢快慢型的分析为代谢表型,而基因型系指负责催化代谢某致癌剂、化学物的酶的基因多态性。个体易感性研究主要是评价个体的先天因素在职业、环境接触化学物致癌、致病中的易感作用。苯本身不致癌，它是通过代谢活化产生有毒代谢产物而致癌的。因此负责苯活化代谢的酶(代谢一型)和负责解毒的酶(代谢二型)便成为研究的焦点。Rothman等[13]基于苯代谢酶CYP2E1活力增高而苯解毒酶(NQO1)活力降低，可使个体对苯的血液毒性更加敏感这一假说,及苯中毒与其后发展为非淋巴细胞白血病和骨髓发育不良症密切相关的危险人群为依据(RR=70.6),用与苯代谢类似的无毒化学物——氯唑沙宗(chlorzoxazone)在尿中的代谢产物(fe6-OH)排出的快慢来决定代谢表型快慢，而遗传型是用CYP2E1酶和NQO1609C→T的纯合子突变(此酶活力完全丧失)，用PCR-RFLP分析检出。结果表明fe6-OH代谢快型与代谢慢型比较，快型苯中毒(血液毒性)的危险性增高2.6倍。NQO1609C→T突变纯合子与杂合子或野生型比较，NQO1609C→T突变纯合子苯血液毒性危险性增高2.4倍,但fe6-OH代谢快型并有两个NQO1609C→T突变拷贝个体，苯血液毒性危险性较fe6-OH代谢慢型并有一个或两个野生型个体增高7.6倍,而与CYP2E1酶的Pstl/Rsal酶切多态性无关。
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参考文献
[1] Weiselc,YR,Roy A,et al.Biomarkers of environmental benzene exposure.Environ Health Perspect，1996,104(Suppl 6):1141-1146.
[2] 王春光，李桂兰，尹松年.苯染毒小鼠体内DNA加合物及其持续时间的研究.中华预防医学杂志，1993，11：344-345.
[3] Bodell WJ,Pathak DN,Levay G,et al.Investigation of the DNA adduct formed in B6C3F1 mice treated with benzene:Implications for molecular dosimetry.Environ Health Perspect,1996,104(Suppl 6):1189-1193.
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[4] Connell KY,Rothman N,Smith MT,et al.Hemoglobin and albumin adducts of benzene oxide among workers exposed to high level of benzene.Carcinogenesis,1998,19:1565-1571.
[5] Lagorios T,Forastiere F,Irons R,et al.Exposure to benzene and urinary concentration of 8-hydroxydeoxyguanosine,a biological marker of oxidative damage to DNA.Occup Environ Med,1994,51:793-796.
[6] Anderson D,Michael JP.The International commet assay workshop.Mutagenesis，1998,13:67-73.
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[7] 袁野，邬堂春，陈胜，等.苯作业工人淋巴细胞DNA损伤的研究.工业卫生与职业病，1996，22：80-82.
[8] 倪祖尧，逢兵，孟建峰，等.单细胞电泳检测接触苯、甲苯和二甲苯工人外周血细胞DNA损伤.卫生毒理学杂志，1996，10：267-268.
[9] Smith MT.The mechanism of benzene-induced leukemia:A hypothesis.Environ Health Perspect,1996,104(Suppl 6):1219-1225.
[10] Rothman N,Haas R,Hayes RB,et al.Benzene induces gene-duplication but not geneinactivating mutations at the glycophorin A locu in exposed humans.Proc Natl Acad Sci USA Med Sci,1995,92:4069-4073.
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[12] 夏昭林，金锡鹏，袁弥涛，等.苯作业工人白细胞Ki-ras癌基因点突变分子检测初探.中国工业医学杂志，1995,8:193-195.
[13] Rothman N,Smith MT,Hayes RB,et al.Benzene poisoning,a risk fator for hematological malignancy,is associated with the NQO1609C→T mutation and rapid fractional excretion of chlorzoxazone.Cancer Res,1997,57:2839-2842.
(收稿：1998-02-14 修回：1999-05-28), http://www.100md.com