冷损伤血管NO合成酶活力的变化及其生物学意义
作者：钱令嘉 潘宁 吴小红 李风芝 张亦红
单位：天津，军事医学科学院卫生学环境医学研究所 300050
关键词：冷损伤血管；NO合成酶；SOD；Vit C
冷损伤血管NO合成酶活力的变化及其生物学意义 【摘要】 目的 观察不同程度冷损伤血管NO合成酶(NOS)活力的变化，并研究超氧化物歧化酶(SOD)和Vit C对这种变化的影响。方法 分离Wistar大鼠主动脉，并在PBS培育液中培养1小时，然后使其暴露于-20 ℃环境。以全自动生化分析仪测定血管培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力，以Griess化学法观测血管NOS活力，以肾上腺素自氧化法测定血管SOD活力。结果 当血管暴露于-20 ℃环境1、2、4分钟后，血管培养液中LDH活力的增强幅度和血管SOD活力的降低程度均逐步增大，表明血管分别相应受到轻、中、重度冷损伤；冷损伤后4小时，轻度冷损伤血管NOS活力较未冷冻血管增加15.3%，中、重度冷损伤血管NOS活力则显著下降，分别达17.9%、29.6%。血管冷冻后立即给予SOD(200 U/ml)或Vit C(50 mg/ml)，可使冷损伤血管NOS活力分别较未经SOD或Vit C处理者显著升高，并降低了冷损伤血管培养液中LDH活力，使血管SOD活力回升。结论 血管NOS活力降低是导致冷损伤组织血液循环障碍发生的重要原因；SOD及Vit C可通过调节提高血管NOS活力，防止或减缓机体冷损伤的发生。
, http://www.100md.com
Changes of NO synthase activity in the cold injured blood vessels and its biological significance
Qian Lingjia,Pan Ning,Wu Xiaohong,et al.
Institute of Health and Environmental Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Tianjin 300050
【Abstract】 Objective To explore the new therapy by observing the changes of NO synthase(NOS) activity in the cold injured blood vessels and by studying the effects of SOD and Vit C on the changes of NOS activity. Methods The aortic artery was isolated from Wistar rats and cultured in PBS medium for 1 h,then exposed to -20 ℃ cold environment.LDH activity was measured using Biochemistry Automatic Analysis-Meter,NOS and SOD activities in blood vessels were analysed respectively by Griess assay and adrenalin autooxidation method. Results When the vessels were exposed to cold for 1,2,4 min respectively,LDH activity in the cultured medium increased and SOD activity in the vessels decreased at different level,indicating varying degree of vessel injury:slight-,moderate- and severe cold injury.After 4 h of cold exposure,NOS activity in the slight-,moderate- and severe-injured vessels increased by 15.3%,and decreased by 17.9%,29.6% respectively as compared with control.The changes of the NOS activity was time dependent.Treating with SOD(200 U/ml) or Vit C(50 mg/ml) immediatly after cold exposure made NOS and SOD activity in the vessels significantly increase and LDH in the medium decrease. Conclusion The decrease of NOS activity may lead to the disorder in vascular circulation of cold injury,SOD and Vit C could prevent from or alleviate cold injury by increasing NOS activity.
, 百拇医药
【Key words】 Cold injured blood vessel NO synthase SOD Vit C
在寒区冬季作业和从事高山探险、极地考察的人群中，寒冷损伤经常发生。组织血液循环障碍是最终导致机体冷损伤的主要原因[1]。血管内皮细胞是冷损伤过程中最先和最易损伤的部位，对冷致血管内皮细胞损伤的发生机制虽先后提出了自由基损伤学说、炎性介质介导学说、缺血再灌注诱导白细胞粘附学说等，但对冷损伤机体血液循环障碍的病理学本质至今未获得明确认识。近年来研究表明：血管内皮细胞产生的NO不但能舒张血管，而且有重要的细胞保护作用[2，3]，是维持血液循环不可缺少的关键调节物质。我们通过观察不同程度冷损伤血管NO合成酶(NOS)活力的变化及抗氧化剂对这种变化的调控作用，进一步探索冷损伤的发病机制，为冷损伤的治疗开拓新的思路。
材料与方法
, http://www.100md.com 1.冷损伤血管模型的建立：选取200～250 g Wistar大白鼠80只，雌雄各半，分为10组：对照组和3种不同程度冷损伤组，而各冷损伤组根据冷损伤后给予或不给予超氧化物歧化酶(SOD)、Vit C再分为冷损伤组、冷损伤+SOD组、冷损伤+Vit C组。分离大鼠主动脉并置于血管培育液(PBS)中，同时将血管剪切为2～3 mm长的血管环，放在CO2培养箱培养；冷损伤组血管在CO2培养箱内培养1小时后，将血管培育管置于-20 ℃冰浴中。以低温温度计测得管中PBS温度达-20 ℃时开始记时，分别在1、2、4分钟时，取出培育管置于37 ℃水浴中10分钟；然后根据实验设计在血管培育液中分别加入(或不加)SOD(200 U/ml)或Vit C(50 mg/ml)，并将血管放在CO2培养箱内继续培养一定时间后，取样进行有关指标测定。
2.实验方法：采用全自动生化分析仪测定血管培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力，以观测血管冷损伤程度；采用Griess化学法以观察血管NOS活力[4]；采用肾上腺素自氧化法测定血管SOD的活力；用Folin酚法测定血管蛋白含量。
, 百拇医药
3.统计学处理：数据以
±s表示，采用t检验。
结 果
1.不同冷冻强度对血管培养液中LDH活力的影响：当血管内皮细胞破损时，LDH就会释放到细胞外，因此细胞外LDH活力可作为对细胞完整性的监测指标。实验表明：当血管在-20 ℃环境暴露1、2、4分钟后，血管培养液中LDH活力较未冷冻血管显著升高，分别达125.6%、156.3%和184.2%(图1)，表明血管内皮细胞受到了明显破坏，血管受到了不同程度的冷损伤；将此3种冷冻条件所致血管冷损伤分别定义为：轻度、中度、重度血管冷损伤。
, 百拇医药
与对照组比较，*P<0.05;与冷暴露组比较，＃P<0.05
*P<0.05 vs.control;＃P<0.05 vs.cold exposure
图1 冷暴露血管培养液中LDH活力的变化(n=8)
Fig 1 Changes of LDH activity in the culture medium
of blood vessels exposed to cold(n=8)
2.冷损伤血管NOS活力的变化：如图2所示，血管NOS活力因冷损伤程度相异而有不同的变化趋势：冷损伤后4小时，轻度冷损伤者NOS活力较未损伤血管增加15.3%，中、重度冷损伤血管NOS活力则较对照显著下降，分别达17.9%、29.6%。冷损伤血管NOS活力变化具有明显的时间依赖性，不同程度冷损伤血管NOS活力的显著变化均始于冷损伤后4小时，随着冷损伤后时间的延长，这种变化的趋势持续存在(图3)。
, http://www.100md.com
与对照组比较，*P<0.05;与冷暴露组比较，＃P<0.05
*P<0.05 vs.control;＃P<0.05 vs.cold exposure
图2 冷暴露血管NO合成酶活力的变化(n=8)
Fig 2 Changes of NOS activity in blood vessels
exposed to cold(n=8)
与对照组比较，*P<0.05 * P<0.05 vs.control
, http://www.100md.com
图3 冷暴露血管NO合成酶活力变化的时间依赖性(n=6)
Fig 3 Time dependency of NOS activity in blood vessels
exposed to cold(n=6)
3.不同程度冷损伤血管SOD活力：对轻、中、重度冷损伤血管SOD活力的测定结果表明，SOD活力随冷损伤程度加重而逐步降低，分别为未损伤血管的89.4%、77.5%和68.4%(P<0.05，图4)。
4.SOD和Vit C对冷损伤血管NOS活力变化的影响：当血管受到冷冻后立即分别给予SOD和Vit C，冷损伤血管NOS活力变化发生明显改变(图2)。SOD使轻、中、重度冷损伤血管NOS活力分别较未给SOD者升高6.2%、10.8%和8.3%；Vit C则可使轻、中、重度冷损伤血管NOS活力升高0.9%、3.6%和4.4%。
, http://www.100md.com
5.SOD和Vit C对冷损伤血管的保护作用：对不同强度冷冻血管给予SOD和Vit C后，血管培养液中LDH活力较未给予SOD或Vit C者显著降低(图1)；而冷损伤血管SOD活力较未给予SOD或Vit C者明显回升(图4)。对SOD和Vit C作用后冷损伤血管NOS活力和LDH活力变化的相关分析表明:两者之间呈显著负相关关系(r=-0.956 1,P<0.05)。
与对照组比较，*P<0.05;与接触组比较，＃P<0.05
* P<0.05 vs.control;＃P<0.05 vs.exposure
, http://www.100md.com
图4 冷暴露血管SOD活力的变化(n=8)
Fig 4 Changes of SOD activity in blood vessels
exposed to cold(n=8)
讨 论
本研究结果表明：血管冷损伤时，NOS活力发生了明显的变化，并和冷损伤程度密切相关。血管轻度冷损伤时，其NOS活力明显升高，可能是由于血管受到冷冻时的应激保护性反应所致；而当冷冻程度进一步加重，血管应激保护失效，血管NOS活力将显著降低，并导致血管损伤。许多研究已经发现：血管内皮细胞中NOS功能的缺失是一些如：心肌缺血再灌、动脉粥样硬化等心血管疾病发生的重要病理学途径[2，5]，而这些疾病过程中出现的血小板高度凝集，白细胞粘附、活化及血管舒缩失调等病理特点和冷损伤组织的血液循环障碍特征几乎相同[1，6]，提示血管NOS活力降低对冷损伤发生有着重要作用。
, http://www.100md.com
NOS是迄今发现的结构最复杂的一种酶，许多生理和病理因素都可能在基因表达、酶蛋白活性位点激活等水平上影响NOS的活力[7]。Muegge等[8]的研究表明：血管内皮SOD为NOS激活的必需因素，而当机体内SOD活力和超氧化离子的产生失衡时，将会导致内皮依赖性血管舒张受损和血管反应性改变。已有研究证实：组织冷损伤时自由基的产生明显增多[6，9]。本研究亦观察到，冷损伤血管的SOD的活力显著降低，表明冷损伤血管组织氧化和抗氧化系统的失衡。血管冷冻后即刻给予SOD，一方面有效地促使了血管N损害，并使血管内源性SOD消耗与分解速率降低，从而导致NOS高水平的激活，保护了受冷冻血管。这项研究结果不仅为血管NOS活力降低是导致冷损伤组织血液循环障碍的重要原因的论点提供了进一步的科学依据，也提示给予受冷冻机体SOD及Vit C可通过调节和提高血管NOS活力，保护严寒环境中机体的血液循环系统，防止或减缓机体冷损伤的发生。
参考文献
, 百拇医药
1 Mills WJJ,O'Malley J,Kappers B.Cold and freezing:A historical chronology of laboratory investigation and clinical experience.Alaska Med,1993,35:89-93.
2 Schulz R,Triggle CR.Role of NO in vascular smooth muscle and cardiac muscle function.Tips,1994,15:255-259.
3 Buss R,Fleming I.Regulation and functional consequences of endothelial nitric oxide formation.Ann Med,1995,27:331-340.
4 Stuehr DJ,Know NS,Gross SS,et al.Synthesis of nitrogen oxides from L-arginine by macrophage cytosol:requirement for inducible and constitutive components.Biochem Biophys Res Commun,1989,161:420-426.
, 百拇医药
5 Moncada S,Palmer RMJ,Higgs EA.Nitric oxide:Physiology,Pathophysiology and Pharmacology.Phamacol Rev,1991,27:331-340.
6 Marzellar L,Jesudass PR,Manson PN,et al.Morphologic characterization of acute injury to vascular endothelium of skin after frostbite.Plast Peconst Surg,1989,83:267-272.
7 Griffith OW,Stuehr DJ.Nitric oxide synthases:properties and catalytic mechanism.Annu Rev Physiol,1995,57:707-716.
, http://www.100md.com
8 Muegge A,Elwell JH,Peterson TE,et al.Release of intact endothelium-derived relaxing factor depends on endothelial superoxide dismutase activity.Am J Physiol,1991,260(Part 1)：C219-C225.
9 Carpenter FJ.Cellular and tissue injury dring nonfreezing cold injury and frosbite.ADA244809,1992.
(收稿：1998-12-14 修回：1999-06-24), 百拇医药
单位：天津，军事医学科学院卫生学环境医学研究所 300050
关键词：冷损伤血管；NO合成酶；SOD；Vit C
冷损伤血管NO合成酶活力的变化及其生物学意义 【摘要】 目的 观察不同程度冷损伤血管NO合成酶(NOS)活力的变化，并研究超氧化物歧化酶(SOD)和Vit C对这种变化的影响。方法 分离Wistar大鼠主动脉，并在PBS培育液中培养1小时，然后使其暴露于-20 ℃环境。以全自动生化分析仪测定血管培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力，以Griess化学法观测血管NOS活力，以肾上腺素自氧化法测定血管SOD活力。结果 当血管暴露于-20 ℃环境1、2、4分钟后，血管培养液中LDH活力的增强幅度和血管SOD活力的降低程度均逐步增大，表明血管分别相应受到轻、中、重度冷损伤；冷损伤后4小时，轻度冷损伤血管NOS活力较未冷冻血管增加15.3%，中、重度冷损伤血管NOS活力则显著下降，分别达17.9%、29.6%。血管冷冻后立即给予SOD(200 U/ml)或Vit C(50 mg/ml)，可使冷损伤血管NOS活力分别较未经SOD或Vit C处理者显著升高，并降低了冷损伤血管培养液中LDH活力，使血管SOD活力回升。结论 血管NOS活力降低是导致冷损伤组织血液循环障碍发生的重要原因；SOD及Vit C可通过调节提高血管NOS活力，防止或减缓机体冷损伤的发生。
, http://www.100md.com
Changes of NO synthase activity in the cold injured blood vessels and its biological significance
Qian Lingjia,Pan Ning,Wu Xiaohong,et al.
Institute of Health and Environmental Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Tianjin 300050
【Abstract】 Objective To explore the new therapy by observing the changes of NO synthase(NOS) activity in the cold injured blood vessels and by studying the effects of SOD and Vit C on the changes of NOS activity. Methods The aortic artery was isolated from Wistar rats and cultured in PBS medium for 1 h,then exposed to -20 ℃ cold environment.LDH activity was measured using Biochemistry Automatic Analysis-Meter,NOS and SOD activities in blood vessels were analysed respectively by Griess assay and adrenalin autooxidation method. Results When the vessels were exposed to cold for 1,2,4 min respectively,LDH activity in the cultured medium increased and SOD activity in the vessels decreased at different level,indicating varying degree of vessel injury:slight-,moderate- and severe cold injury.After 4 h of cold exposure,NOS activity in the slight-,moderate- and severe-injured vessels increased by 15.3%,and decreased by 17.9%,29.6% respectively as compared with control.The changes of the NOS activity was time dependent.Treating with SOD(200 U/ml) or Vit C(50 mg/ml) immediatly after cold exposure made NOS and SOD activity in the vessels significantly increase and LDH in the medium decrease. Conclusion The decrease of NOS activity may lead to the disorder in vascular circulation of cold injury,SOD and Vit C could prevent from or alleviate cold injury by increasing NOS activity.
, 百拇医药
【Key words】 Cold injured blood vessel NO synthase SOD Vit C
在寒区冬季作业和从事高山探险、极地考察的人群中，寒冷损伤经常发生。组织血液循环障碍是最终导致机体冷损伤的主要原因[1]。血管内皮细胞是冷损伤过程中最先和最易损伤的部位，对冷致血管内皮细胞损伤的发生机制虽先后提出了自由基损伤学说、炎性介质介导学说、缺血再灌注诱导白细胞粘附学说等，但对冷损伤机体血液循环障碍的病理学本质至今未获得明确认识。近年来研究表明：血管内皮细胞产生的NO不但能舒张血管，而且有重要的细胞保护作用[2，3]，是维持血液循环不可缺少的关键调节物质。我们通过观察不同程度冷损伤血管NO合成酶(NOS)活力的变化及抗氧化剂对这种变化的调控作用，进一步探索冷损伤的发病机制，为冷损伤的治疗开拓新的思路。
材料与方法
, http://www.100md.com 1.冷损伤血管模型的建立：选取200～250 g Wistar大白鼠80只，雌雄各半，分为10组：对照组和3种不同程度冷损伤组，而各冷损伤组根据冷损伤后给予或不给予超氧化物歧化酶(SOD)、Vit C再分为冷损伤组、冷损伤+SOD组、冷损伤+Vit C组。分离大鼠主动脉并置于血管培育液(PBS)中，同时将血管剪切为2～3 mm长的血管环，放在CO2培养箱培养；冷损伤组血管在CO2培养箱内培养1小时后，将血管培育管置于-20 ℃冰浴中。以低温温度计测得管中PBS温度达-20 ℃时开始记时，分别在1、2、4分钟时，取出培育管置于37 ℃水浴中10分钟；然后根据实验设计在血管培育液中分别加入(或不加)SOD(200 U/ml)或Vit C(50 mg/ml)，并将血管放在CO2培养箱内继续培养一定时间后，取样进行有关指标测定。
2.实验方法：采用全自动生化分析仪测定血管培养液中乳酸脱氢酶(LDH)活力，以观测血管冷损伤程度；采用Griess化学法以观察血管NOS活力[4]；采用肾上腺素自氧化法测定血管SOD的活力；用Folin酚法测定血管蛋白含量。
, 百拇医药
3.统计学处理：数据以
±s表示，采用t检验。结 果
1.不同冷冻强度对血管培养液中LDH活力的影响：当血管内皮细胞破损时，LDH就会释放到细胞外，因此细胞外LDH活力可作为对细胞完整性的监测指标。实验表明：当血管在-20 ℃环境暴露1、2、4分钟后，血管培养液中LDH活力较未冷冻血管显著升高，分别达125.6%、156.3%和184.2%(图1)，表明血管内皮细胞受到了明显破坏，血管受到了不同程度的冷损伤；将此3种冷冻条件所致血管冷损伤分别定义为：轻度、中度、重度血管冷损伤。
, 百拇医药
与对照组比较，*P<0.05;与冷暴露组比较，＃P<0.05
*P<0.05 vs.control;＃P<0.05 vs.cold exposure
图1 冷暴露血管培养液中LDH活力的变化(n=8)
Fig 1 Changes of LDH activity in the culture medium
of blood vessels exposed to cold(n=8)
2.冷损伤血管NOS活力的变化：如图2所示，血管NOS活力因冷损伤程度相异而有不同的变化趋势：冷损伤后4小时，轻度冷损伤者NOS活力较未损伤血管增加15.3%，中、重度冷损伤血管NOS活力则较对照显著下降，分别达17.9%、29.6%。冷损伤血管NOS活力变化具有明显的时间依赖性，不同程度冷损伤血管NOS活力的显著变化均始于冷损伤后4小时，随着冷损伤后时间的延长，这种变化的趋势持续存在(图3)。
, http://www.100md.com
与对照组比较，*P<0.05;与冷暴露组比较，＃P<0.05
*P<0.05 vs.control;＃P<0.05 vs.cold exposure
图2 冷暴露血管NO合成酶活力的变化(n=8)
Fig 2 Changes of NOS activity in blood vessels
exposed to cold(n=8)
与对照组比较，*P<0.05 * P<0.05 vs.control
, http://www.100md.com
图3 冷暴露血管NO合成酶活力变化的时间依赖性(n=6)
Fig 3 Time dependency of NOS activity in blood vessels
exposed to cold(n=6)
3.不同程度冷损伤血管SOD活力：对轻、中、重度冷损伤血管SOD活力的测定结果表明，SOD活力随冷损伤程度加重而逐步降低，分别为未损伤血管的89.4%、77.5%和68.4%(P<0.05，图4)。
4.SOD和Vit C对冷损伤血管NOS活力变化的影响：当血管受到冷冻后立即分别给予SOD和Vit C，冷损伤血管NOS活力变化发生明显改变(图2)。SOD使轻、中、重度冷损伤血管NOS活力分别较未给SOD者升高6.2%、10.8%和8.3%；Vit C则可使轻、中、重度冷损伤血管NOS活力升高0.9%、3.6%和4.4%。
, http://www.100md.com
5.SOD和Vit C对冷损伤血管的保护作用：对不同强度冷冻血管给予SOD和Vit C后，血管培养液中LDH活力较未给予SOD或Vit C者显著降低(图1)；而冷损伤血管SOD活力较未给予SOD或Vit C者明显回升(图4)。对SOD和Vit C作用后冷损伤血管NOS活力和LDH活力变化的相关分析表明:两者之间呈显著负相关关系(r=-0.956 1,P<0.05)。
与对照组比较，*P<0.05;与接触组比较，＃P<0.05
* P<0.05 vs.control;＃P<0.05 vs.exposure
, http://www.100md.com
图4 冷暴露血管SOD活力的变化(n=8)
Fig 4 Changes of SOD activity in blood vessels
exposed to cold(n=8)
讨 论
本研究结果表明：血管冷损伤时，NOS活力发生了明显的变化，并和冷损伤程度密切相关。血管轻度冷损伤时，其NOS活力明显升高，可能是由于血管受到冷冻时的应激保护性反应所致；而当冷冻程度进一步加重，血管应激保护失效，血管NOS活力将显著降低，并导致血管损伤。许多研究已经发现：血管内皮细胞中NOS功能的缺失是一些如：心肌缺血再灌、动脉粥样硬化等心血管疾病发生的重要病理学途径[2，5]，而这些疾病过程中出现的血小板高度凝集，白细胞粘附、活化及血管舒缩失调等病理特点和冷损伤组织的血液循环障碍特征几乎相同[1，6]，提示血管NOS活力降低对冷损伤发生有着重要作用。
, http://www.100md.com
NOS是迄今发现的结构最复杂的一种酶，许多生理和病理因素都可能在基因表达、酶蛋白活性位点激活等水平上影响NOS的活力[7]。Muegge等[8]的研究表明：血管内皮SOD为NOS激活的必需因素，而当机体内SOD活力和超氧化离子的产生失衡时，将会导致内皮依赖性血管舒张受损和血管反应性改变。已有研究证实：组织冷损伤时自由基的产生明显增多[6，9]。本研究亦观察到，冷损伤血管的SOD的活力显著降低，表明冷损伤血管组织氧化和抗氧化系统的失衡。血管冷冻后即刻给予SOD，一方面有效地促使了血管N损害，并使血管内源性SOD消耗与分解速率降低，从而导致NOS高水平的激活，保护了受冷冻血管。这项研究结果不仅为血管NOS活力降低是导致冷损伤组织血液循环障碍的重要原因的论点提供了进一步的科学依据，也提示给予受冷冻机体SOD及Vit C可通过调节和提高血管NOS活力，保护严寒环境中机体的血液循环系统，防止或减缓机体冷损伤的发生。
参考文献
, 百拇医药
1 Mills WJJ,O'Malley J,Kappers B.Cold and freezing:A historical chronology of laboratory investigation and clinical experience.Alaska Med,1993,35:89-93.
2 Schulz R,Triggle CR.Role of NO in vascular smooth muscle and cardiac muscle function.Tips,1994,15:255-259.
3 Buss R,Fleming I.Regulation and functional consequences of endothelial nitric oxide formation.Ann Med,1995,27:331-340.
4 Stuehr DJ,Know NS,Gross SS,et al.Synthesis of nitrogen oxides from L-arginine by macrophage cytosol:requirement for inducible and constitutive components.Biochem Biophys Res Commun,1989,161:420-426.
, 百拇医药
5 Moncada S,Palmer RMJ,Higgs EA.Nitric oxide:Physiology,Pathophysiology and Pharmacology.Phamacol Rev,1991,27:331-340.
6 Marzellar L,Jesudass PR,Manson PN,et al.Morphologic characterization of acute injury to vascular endothelium of skin after frostbite.Plast Peconst Surg,1989,83:267-272.
7 Griffith OW,Stuehr DJ.Nitric oxide synthases:properties and catalytic mechanism.Annu Rev Physiol,1995,57:707-716.
, http://www.100md.com
8 Muegge A,Elwell JH,Peterson TE,et al.Release of intact endothelium-derived relaxing factor depends on endothelial superoxide dismutase activity.Am J Physiol,1991,260(Part 1)：C219-C225.
9 Carpenter FJ.Cellular and tissue injury dring nonfreezing cold injury and frosbite.ADA244809,1992.
(收稿：1998-12-14 修回：1999-06-24), 百拇医药