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编号:10259848
使用中消毒液污染细菌的质粒谱分析
http://www.100md.com 《中国消毒学杂志》 1998年第4期
     作者:陈昭斌 张朝武* 叶梅君* 殷强仲* 余倩*

    单位:陈昭斌 张朝武 叶梅君 殷强仲 余倩 (广东省深圳市南山区卫生防疫站,深圳 518052)

    关键词:细菌质粒;消毒液污染细菌;质粒检出率;质粒谱

    中国消毒学杂志980406

    提 要 分离自使用中消毒液的98株细菌,葡萄球菌、微球菌和链球菌的质粒检出率均为100%。其质粒大小为2.0~54.2 kb。61.11%菌株为单一54.2 kb质粒。革兰阴性与革兰阳性杆菌质粒检出率分别为100%与92.0%,质粒大小分别为1.1~219.4 kb与1.1~53.2 kb,质粒谱型均较分散。

    ANALYSIS OF PLASMID PATTERN OF BACTERIA CONTAMINATING
, 百拇医药
    DISINFECTANT SOLUTION IN USE

    Chen Zhaobin Zhang Chaowu* Ye Meijun* Yin Qiangzhong* Yu Qian*

    ( Nanshan District Sanitary and Anti-epidemic Station of Shenzhen City,Guangdong Province, Shenzhen 518052)

    Abstract In the 98 strains of bacteria isolated from the disinfectant solution in use, the plasmid detection rate of staphylococci, micrococci and streptococci was 100%. The molecules of the plasmids contained 2.0~54.2 kb. 61.11% of the bacterial strain showed single type of 54.2 kb plasmid. The plasmid detection rates of gram-positive and gram-negative bacilli were 100% and 92.0% respectively. The molecules of the plasmids contained 1.1~219.4 kb and 1.1~53.2 kb respectively. The plasmid pattern was rather scattered.
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    Key words bacterial plasmid bacteria in disinfectant solution plasmid detection rateplasmid pattern

    质粒是染色体外能自主复制的遗传因子,其所携带决定特殊表型的基因,染色体上一般没有。这有利于细菌在不利环境下生存。目前,已鉴定出细菌质粒所控制的性状逾100种。国外已用质粒分析的间接分子生物学技术对鼠伤寒沙门氏菌、阴沟肠杆菌、空肠弯曲杆菌等进行流行病学调查〔1〕。对使用中消毒液污染菌的质粒状况,尚鲜见报道。为此,对其质粒谱进行了分析并将分析结果报告于下。

    1 方法

    1.1 质粒的提取

    用于提取、分析质粒的98株细菌,分离自230份使用中消毒液样本中。其中包括54株球菌,44株杆菌。提取方法使用参照Serghini 等〔2〕和魏珍宇等〔3〕方法的改进法。提取时,将球菌接种于TSBEYG肉汤(含3.0%胰胨、0.3%酵母浸出粉、0.5%甘氨酸、0.1%葡萄糖、1.0%氯化钠,pH 7.3±0.2)中,杆菌接种于LB 肉汤(含1.0%蛋白胨、0.5%牛肉浸膏、0.5%酵母浸膏、0.5%氯化钠,pH 7.4~7.6) 中,置37℃摇床培养16 h。然后,取1.5 ml置于Eppendorff 管中,以12 000 r/min 旋转5 min,控干菌体。加50 μl TE缓冲液(含10 mmol/L pH 8.0三羟甲基氯基甲烷-盐酸,1 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠),于旋涡混旋器上振荡30 s 以重悬菌体。再加50 μl质粒提取液(酚∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1的混合液),充分振荡30 s后,离心(12 000 r/min) 5 min。取上清液 35μl,加15 μl点样缓冲液(TBE 电泳缓冲液加以50% 甘油与25% 溴酚蓝;TBE 电泳缓冲液含50 mmol/L pH 8.0三羟甲基氨基甲烷-盐酸,50 mmol/L 硼酸,20 mmol/L 乙二胺四乙酸二钠),混匀。
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    1.2 电泳分析与分子量计算

    电泳分析采用蔡武成提供的方法〔4〕,取加有点样缓冲液的提取液35 μl,点样于0.8% 琼脂糖凝胶( 用1×TBE电泳缓冲液配制)上,作电泳分离,测Rf值。按蔡良琬所述方法〔5〕计算质粒大小。

    计算时,先由参考菌株大肠杆菌v 517、R483、Rtsi与R40a(均由华西医科大学医学检验教研室提供)建立回归方程。R483、Rtsi与R40a标准质粒的大小分别为93.9 kb 、212 kb与145.3 kb。大肠杆菌v 517的8种质粒分子量为 54.2 、7.3、5.6、5.2、3.9、3.1、2.7、2.1 kb。以质粒大小常用对数值(X)与其对应Rf常用对数值(Y)建立回归方程:Y = 0.0268-0.0486 X,r=-0.9973 。将所测Rf值代入方程,计算质粒大小。
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    2 结果

    2.1 质粒检测结果

    所检54株球菌包括血浆凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)32株、微球菌21株和链球菌1株。葡萄球菌中,65.62%是头状葡萄球菌,18.75%为木糖葡萄球菌,余为孔氏葡萄球菌、模仿葡萄球菌、华纳葡萄球菌与人型葡萄球菌。微球菌以藤黄微球菌为主(71.43%),尚有易变微球菌和玫瑰微球菌。链球菌为肺炎链球菌。所检杆菌中,革兰阴性与革兰阳性分别为19株与25株。前者含假单胞菌和巴斯德菌崐各3株,沙雷菌和欧文杆菌各2株,以及莫拉菌、黄杆菌、鲍特菌、哈夫尼亚菌、加德纳尔菌、变形杆菌、放线杆菌与链杆菌等。后者包括芽胞杆菌11株,棒状杆菌9株和李斯特菌5株。

    经检测,球菌质粒检出率为100%,质粒大小为2.0~54.2 kb。CNS平均每株1.69个质粒,微球菌平均每株2.10个质粒,1株链球菌仅检出1个54.2 kb质粒。革兰阴性杆菌质粒检出率亦为100%,质粒大小为1.1~219.4 kb,平均每株2.05个质粒。革兰阳性杆菌质粒检出率为92.0%,质粒大小为1.1~53.2 kb,平均每株2.24个质粒(表1)。
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    表1 不同细菌的质粒检测结果

    Table1 Results of examination of plasmids of different bacteria 细菌

    Bacteria

    检测菌株数

    No.of strains detected

    检出质粒菌株数

    No.of strains with plasmid detected

    检出率

    Detection rate

    (%)
, 百拇医药
    检出质粒数

    No.of plasmids detected

    (个)

    平均每株菌质粒数

    Average No.of plasmids per strain

    (个)

    质粒大小

    Size of plasmid

    (kb)

    葡萄球菌

    Staphylococci
, 百拇医药
    32

    32

    100.0

    54

    1.69

    2.0~54.2

    微球菌

    Micrococci

    21

    21

    100.0

    44

    2.10
, 百拇医药
    2.0~54.2

    革兰阴性杆菌

    Gram-negative bacilli

    19

    19

    100.0

    39

    2.05

    1.1~219.4

    革兰阳性杆菌

    Gram-positive bacilli

    25
, 百拇医药
    23

    92.0

    56

    2.24

    1.1~53.2

    2.2 质粒谱

    所检球菌的质粒谱模式中,单一54.2 kb质粒谱者占61.11%,其它模式较分散(表2)。检测对象中,62.50% CNS与57.14%微球菌为单一54.2 kb质粒,90.62% CNS与80.95%微球菌含有54.2 kb质粒。所检革兰阴性杆菌中,>50.0 kb的质粒占48.72%(19/39),<3.0 kb的质粒占30.77%(12/39), 质粒谱模式达19种,极为分散。所检革兰阳性杆菌质粒,33.93%(19/56)>50.0 kb, 66.07%(37/56)<5.5 kb, 质粒谱模式有18种,亦较分散。表2 54株球菌的质粒谱模式分布
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    Table2 Plasmid pattern of 54 strains of bacteria 编号

    Number

    质粒大小(kb)谱模式

    Patterm of size of plasmids

    菌株数

    No.of bacterial strains

    比例

    Ratio

    Ⅰ

    54.2

    33
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    61.11

    Ⅱ

    54.2

    3.9

    3.0

    3

    5.56

    Ⅲ

    54.2

    4.5

    3.0

    2

    3.70
, 百拇医药
    Ⅳ

    54.2

    5.6

    3.4

    2.0

    2

    3.70

    其它

    Others

    14

    25.93

    3 讨论

    3.1 分离自使用中消毒液的32株CNS质粒检出率为100%,质粒大小为2.0~54.2 kb。舒泉等报道,98.1%金黄色葡萄球菌检出2.1~37.3 kb的质粒〔6〕。李倩等报道,在47株葡萄球菌中,质粒检出率为100%,质粒大小为2.4~54.0 kb〔7〕。本结果与报道较吻合。
, 百拇医药
    3.2 本结果革兰阴性杆菌质粒检出率为100%, 质粒大小为1.1~219.4 kb,平均每株菌2.05个质粒。刘延友等报道,从院内感染分离出的革兰阴性杆菌菌株,质粒检出率为98.3%(113/115), 质粒大小为1.0~132.0 kb,平均每株菌3.19个质粒〔8〕。两者相近。

    3.3 分离自使用中消毒液的葡萄球菌、微球菌、链球菌与革兰阴性杆菌质粒检出率均为100%,革兰阳性杆菌者亦达92.0%。此说明质粒可能与细菌对消毒剂的抗力有关。

    3.4 本结果32株CNS中,90.62%含有54.2 kb质粒,62.50%含单一54.2 kb质粒;21株微球菌,80.95%含有54.2 kb质粒,57.14%为单一54.2 kb质粒;1株链球菌仅含54.2 kb质粒。然而,19株革兰阴性杆菌有19种质粒谱型,极为分散;25株革兰阳性杆菌亦有18种质粒谱型,仍较分散。此是否与细菌种属有关,尚待进一步研究。
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    (四川省宜宾地区卫生防疫站王南志对样本采集给予大力协作,特此致谢!)

    * 华西医科大学公共卫生学院

    * School of Public Health, West China University of Medical Science

    参考文献

    〔1〕 Tnover FC, Williams S, Gordon KP, et al. Utility of plasmid fingerprinting for epidemiological studies of Campylobacter jejuni infection. J Infect Dis

    1984; 149:279.
, 百拇医药
    〔2〕 Serghini MA, Ritzenthler C, Pinck L. A rapid and efficient‘miniprep’

    for isolation of plasmid DNA. Nucleic Acids REs 1989; 17(9):3604.

    〔3〕 魏珍宇, 王苏燕,叶寅,等. 质粒DNA的酚-氯仿一步抽提法. 微生物学通报 1993; 20(6):375.

    〔4〕 蔡武成. 生物化学实验技术教程. 第二版. 上海:复旦大学出版社,1987:136.

    〔5〕 蔡良琬. 核酸技术. 北京:科学出版社,1987:122.

    〔6〕 舒泉, 陈建华,秦生巨,等. 金黄色葡萄球菌质粒分型的研究. 中华微生物学和免疫学杂志 1992;12(3):148.

    〔7〕 李倩,陈宁庆,马清钧,等.葡萄球菌质粒分析在医院内感染调查中的应用. 中华流行病学杂志 1990;11(特刊6号):103.

    〔8〕 刘延友,王其南,杜继昭,等. 革兰氏阴性杆菌院内感染菌株的质粒分析. 中国抗生素杂志 1991; 16(5):344.

    (1997-11-28收稿 1998-03-06修回), 百拇医药(陈昭斌 张朝武* 叶梅君* 殷强仲* 余倩*)