糖类蛋白保护剂对热力灭活冻干IgG制品中病毒的影响
作者：许金波 刘育京 李成文 张文福 周锡鹏
单位：(许金波 周锡鹏)军事医学科学院野战输血研究所，北京 100850；(刘育京 李成文 张文福)军事医学科学院微生物流行病研究所
关键词：干热；病毒灭活；糖类；蛋白保护剂；免疫球蛋白；水泡性口炎病毒
中国消毒学杂志990301 提要 采用80℃和100℃干热灭活冻干蛋白制品中的病毒时，冻干品中的糖含量(作为蛋白保护剂)≤10%，对病毒灭活效果影响较小；糖含量≥20%，热处理后的冻干蛋白剂型变化明显。
INFLUENCE OF PROTEIN PROTECTOR SACCHARIDE
ON EFFICACY OF HEAT IN INACTIVATING VIRUS
, 百拇医药
IN LYOPHILIZED IgG PRODUCT
Xu Jinbo Zhou Xipeng
Institute of Field Transfusion, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071
Liu Yujing Li Chengwen Zhang Wenfu
Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences
Abstract
After lyophilization of sucrose or sorbitol at different concentrations with vesicular stomatitis virus and IgG, the influence of saccharide on inactivation of virus by heat and the external color and redissolution of lyophilized IgG after treatment were observed. The results indicated that after treatment with 80℃ and 100℃ dry heat, the saccharide content in lyophilized product was ≤10% and the influence on efficacy of inactivating virus was minimal. The lyophilized product only showed change in color. When the saccharide content was ≥20%, the property of preparation of lyophilized protein changed obviously.
, http://www.100md.com
Key words dry heat inactivation of virus saccharide protein protector immunoglobulin vesicular stomatitis virus
据报道，用巴氏法灭活血浆蛋白制品中的残留病毒时，蛋白液中加入较高浓度的糖类保护剂可减弱热力对血浆蛋白分子生物活性的损伤作用，但灭活病毒效果受明显影响〔1,2〕。用干热法灭活冻干蛋白制品中的病毒时，冻干品中可否加入高浓度的糖类蛋白保护剂目前还鲜见报道。为此，将不同浓度的蔗糖、山梨醇及指示病毒与IgG一起冻干后，观察糖类对热力和微波灭活病毒的影响及处理后冻干IgG的外观色泽和复溶效果。
1 方法
1.1IgG冻干品的制备
试验病毒为水泡性口炎病毒(VSV，Indiana Serotype)，滴度>8TCID50(lg)。试验时，配制含不同浓度蔗糖(北京化学试剂厂,分析纯)与山梨醇(北京化学试剂厂，分析纯)的IgG溶液。取该液0.9ml，加0.1ml病毒液，混匀(IgG含量为50mg)。经-70℃预冻后放入LGL-冷冻干燥机(军事医学科学院实验仪器厂产)内，在-42℃和50Pa真空度下干燥30h，而 后将安瓿封口。冻干品中病毒滴度单位为每50mgIgG中所含的TCID50。
, http://www.100md.com
1.2病毒灭活方法
1.2.1干热法 冻干IgG中的病毒采用102A型远红外线快速干燥箱(1400W,200±0.5℃，北京振兴实验仪器厂产) 处理。试验时，在干燥箱隔层中间放一温度计，以指示处理样品放置部位的实际温度。当箱中达到所试温度并稳定30min后，再放入2支试验样品。用结晶氯化铝(熔点100℃)和乙酰胺(熔点79℃)化学指示剂观察安瓿内容物到达的温度。灭活时间从安瓿内容物的温度到达所规定温度(100℃，80℃)时算起。
1.2.2微波法 用650W微波炉(飞龙牌，FL-650A，湖北孝感产)，通过设定不同处理时间观察微波对冻干IgG中VSV的灭活效果。
1.3病毒灭活效果判定
病毒检测采用病毒感染细胞方法。用男性白人咽癌组织上皮样细胞(HEP-2，ATCC CCL23)评价VSV的感染性。HEP-2细胞(DMEM培养)经VSV攻击后在二氧化碳箱中培养(37℃，二氧化碳浓度为5%)，细胞连续传3代，无病变者判为病毒灭活。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1不同糖含量冻干液对VSV的影响
不同糖含量冻干液中的VSV经冷冻真空干燥后，再分别测定其感染滴度。结果表明，蔗糖和山梨醇2种蛋白保护剂对VSV的影响相近。当冻干液中糖含量在5%～20%时，冻干后的VSV约下降1～2个对数滴度(TCID50,lg)；当糖含量达到30%时，VSV约减少3个对数滴度(附图)。
附图 冻干液中糖含量对VSV的影响
Fig Influence of saccharide content in lyophi-
lized fluid on VSV
, http://www.100md.com
▲———▲蔗糖 Sucrose
■———■ 山梨醇 Sorbitol
2.2不同糖含量保护剂对热力灭活VSV的影响
病毒灭活试验结果表明，冻干IgG中蔗糖或山梨醇含量在10%以下时，病毒灭活效果未受影响，经80℃2h和100℃30min处理后，病毒(6.2～8.4TCID50,lg)可全部被灭活，但冻干品外观色泽略有改变。当保护剂含量达到20%以上时，经上述2种热剂量处理后，冻干IgG形成凝块，外观色泽明显改变，不易复溶，难以评价病毒的灭活效果(表1)。
表1 冻干IgG中不同糖含量对热力灭活VSV的影响
Table 1 Influence of different saccharide contents in lyophilized IgG on inactivating VSV by heat 保护剂
, http://www.100md.com
Protector
含量
Content
作用温度
Tempera ture(℃)
VSV滴度
VSVtiter(TCID50,lg)
完全来灭活时间
Time for complete inactivation(h)
外观及复溶
Appearance and redissolution
, 百拇医药
蔗糖
Sucrose
0
80
8.2
2.0
白，易溶
White,easily soluble
5
80
6.4
2.0
微黄，较易溶
, 百拇医药
Slight yellow,rlatively easily soluble
10
80
6.2
2.0
微黄，较易溶
Slight yellow,rlatively easily soluble
20
80
6.2…
黄，难溶
, 百拇医药 Yellow,difficult to dissolve
30
80
5.1…
黄，难溶
Yellow,difficult to dissolve
蔗糖
Sucrose
0
100
8.2
0.5
, 百拇医药
白，易溶
White,easily soluble
5
100
6.4
0.5
微黄，较易溶
Slight yellow,rlatively easily soluble
10
100
6.2
0.5
, 百拇医药
微黄，较易溶
Slight yellow,rlatively easily soluble
20
100
6.2…
黄，难溶
Yellow,difficult to dissolve
30
100
5.1…
黄，难溶
Yellow,difficult to dissolve
, 百拇医药
山梨醇
Sorbitol
0
80
8.4
2.0
白，易溶
White,easily soluble
5
80
6.1
2.0
微黄，较易溶
, http://www.100md.com
Slight yellow,rlatively easily soluble
10
80
6.1
2.0
微黄，较易溶
Slight yellow,rlatively easily soluble
20
80
6.2…
黄，难溶
, http://www.100md.com Yellow,difficult to dissolve
30
80
5.3…
黄，难溶
Yellow,difficult to dissolve
山梨醇
Sorbitol
0
100
8.4
0.5
, http://www.100md.com
白，易溶
White,easily soluble
5
100
6.1
0.5
微黄，较易溶
Slight yellow,rlatively easily soluble
10
100
6.1
0.5
, 百拇医药
微黄，较易溶
Slight yellow,rlatively easily soluble
20
100
6.2…
黄，难溶
Yellow,difficult to dissolve
30
100
5.3…
黄，难溶
Yellow,difficult to dissolve
, 百拇医药
2.3 糖类保护剂对微波灭活VSV的影响
糖类保护剂对微波灭活冻干IgG中的VSV具有一定影响。当IgG中糖含量为5%时，微波完全灭活其中的病毒所需时间较无糖者长；当糖含量达10%时，经微波处理5min后，冻干品变为深褐色，难溶，无法进行病毒灭活效果分析(表2)。表2 冻干IgG中不同糖含量对微波灭活VSV的影响
Table 2 Influence of different saccharide contents in lyophilized 奍gG on inactivating VSV by microwave 糖含量
Saccharide content
VSV滴度
VSV titer(TCID50,lg)
, 百拇医药
灭活时间
Inactivating time(min)
外观色泽
External color
复溶效果
Redissolution
0
8.2
4
微黄
Slight yellow
有絮状物
, http://www.100md.com
Presence of floccule
5%蔗糖
5%sucrose
6.4
5
黄
Yellow
难溶
Difficult to dissolve
5%山梨醇
5%sorbitol
6.1
, http://www.100md.com
5
黄
Yellow
难溶
Difficult to dissolve
10%蔗糖
10%sucrose
6.2…
深褐色
Dark browm
不溶
Insoluble
, http://www.100md.com
10%山梨醇
10%sorbitol
6.1…
深褐色
Dark browm
不溶
Imsoluble
注：微波炉功率为650W。
Note: The power of microwave oven was 650 W.
3 结语
本研究结果表明，冻干IgG中的蔗糖或山梨醇含量如果小于10%，它们对80℃和100℃干热法灭活病毒效果影响较小，但处理后的冻干品色泽有一定改变。当糖含量达20%以上时，热处理后的冻干IgG干固于容器壁上，难以溶化，这与糖含量过高所引起的冻干效果不好有关。我们认为，采用干热灭活法时，冻干蛋白中的糖类保护剂含量不宜过高。对于微波灭活法，本研究剂量不适于处理含糖的冻干蛋白制品。
参考文献
〔1〕王立兰.加热灭活病毒的静脉注射免疫球蛋白的研究.微生物学免疫学进展,1991；3：1.
〔2〕Gonzalez M, Murature DA, Fidelin GD. Thermal stability of human immunoglobulins with sorbitol. Vox Sang, 1995; 68:1.
收稿日期：1998-09-02 修回日期：1998-12-14, 百拇医药
单位：(许金波 周锡鹏)军事医学科学院野战输血研究所，北京 100850；(刘育京 李成文 张文福)军事医学科学院微生物流行病研究所
关键词：干热；病毒灭活；糖类；蛋白保护剂；免疫球蛋白；水泡性口炎病毒
中国消毒学杂志990301 提要 采用80℃和100℃干热灭活冻干蛋白制品中的病毒时，冻干品中的糖含量(作为蛋白保护剂)≤10%，对病毒灭活效果影响较小；糖含量≥20%，热处理后的冻干蛋白剂型变化明显。
INFLUENCE OF PROTEIN PROTECTOR SACCHARIDE
ON EFFICACY OF HEAT IN INACTIVATING VIRUS
, 百拇医药
IN LYOPHILIZED IgG PRODUCT
Xu Jinbo Zhou Xipeng
Institute of Field Transfusion, Academy of Military Medical Sciences, Beijing 100071
Liu Yujing Li Chengwen Zhang Wenfu
Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medical Sciences
Abstract
After lyophilization of sucrose or sorbitol at different concentrations with vesicular stomatitis virus and IgG, the influence of saccharide on inactivation of virus by heat and the external color and redissolution of lyophilized IgG after treatment were observed. The results indicated that after treatment with 80℃ and 100℃ dry heat, the saccharide content in lyophilized product was ≤10% and the influence on efficacy of inactivating virus was minimal. The lyophilized product only showed change in color. When the saccharide content was ≥20%, the property of preparation of lyophilized protein changed obviously.
, http://www.100md.com
Key words dry heat inactivation of virus saccharide protein protector immunoglobulin vesicular stomatitis virus
据报道，用巴氏法灭活血浆蛋白制品中的残留病毒时，蛋白液中加入较高浓度的糖类保护剂可减弱热力对血浆蛋白分子生物活性的损伤作用，但灭活病毒效果受明显影响〔1,2〕。用干热法灭活冻干蛋白制品中的病毒时，冻干品中可否加入高浓度的糖类蛋白保护剂目前还鲜见报道。为此，将不同浓度的蔗糖、山梨醇及指示病毒与IgG一起冻干后，观察糖类对热力和微波灭活病毒的影响及处理后冻干IgG的外观色泽和复溶效果。
1 方法
1.1IgG冻干品的制备
试验病毒为水泡性口炎病毒(VSV，Indiana Serotype)，滴度>8TCID50(lg)。试验时，配制含不同浓度蔗糖(北京化学试剂厂,分析纯)与山梨醇(北京化学试剂厂，分析纯)的IgG溶液。取该液0.9ml，加0.1ml病毒液，混匀(IgG含量为50mg)。经-70℃预冻后放入LGL-冷冻干燥机(军事医学科学院实验仪器厂产)内，在-42℃和50Pa真空度下干燥30h，而 后将安瓿封口。冻干品中病毒滴度单位为每50mgIgG中所含的TCID50。
, http://www.100md.com
1.2病毒灭活方法
1.2.1干热法 冻干IgG中的病毒采用102A型远红外线快速干燥箱(1400W,200±0.5℃，北京振兴实验仪器厂产) 处理。试验时，在干燥箱隔层中间放一温度计，以指示处理样品放置部位的实际温度。当箱中达到所试温度并稳定30min后，再放入2支试验样品。用结晶氯化铝(熔点100℃)和乙酰胺(熔点79℃)化学指示剂观察安瓿内容物到达的温度。灭活时间从安瓿内容物的温度到达所规定温度(100℃，80℃)时算起。
1.2.2微波法 用650W微波炉(飞龙牌，FL-650A，湖北孝感产)，通过设定不同处理时间观察微波对冻干IgG中VSV的灭活效果。
1.3病毒灭活效果判定
病毒检测采用病毒感染细胞方法。用男性白人咽癌组织上皮样细胞(HEP-2，ATCC CCL23)评价VSV的感染性。HEP-2细胞(DMEM培养)经VSV攻击后在二氧化碳箱中培养(37℃，二氧化碳浓度为5%)，细胞连续传3代，无病变者判为病毒灭活。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1不同糖含量冻干液对VSV的影响
不同糖含量冻干液中的VSV经冷冻真空干燥后，再分别测定其感染滴度。结果表明，蔗糖和山梨醇2种蛋白保护剂对VSV的影响相近。当冻干液中糖含量在5%～20%时，冻干后的VSV约下降1～2个对数滴度(TCID50,lg)；当糖含量达到30%时，VSV约减少3个对数滴度(附图)。
附图 冻干液中糖含量对VSV的影响
Fig Influence of saccharide content in lyophi-
lized fluid on VSV
, http://www.100md.com
▲———▲蔗糖 Sucrose
■———■ 山梨醇 Sorbitol
2.2不同糖含量保护剂对热力灭活VSV的影响
病毒灭活试验结果表明，冻干IgG中蔗糖或山梨醇含量在10%以下时，病毒灭活效果未受影响，经80℃2h和100℃30min处理后，病毒(6.2～8.4TCID50,lg)可全部被灭活，但冻干品外观色泽略有改变。当保护剂含量达到20%以上时，经上述2种热剂量处理后，冻干IgG形成凝块，外观色泽明显改变，不易复溶，难以评价病毒的灭活效果(表1)。
表1 冻干IgG中不同糖含量对热力灭活VSV的影响
Table 1 Influence of different saccharide contents in lyophilized IgG on inactivating VSV by heat 保护剂
, http://www.100md.com
Protector
含量
Content
作用温度
Tempera ture(℃)
VSV滴度
VSVtiter(TCID50,lg)
完全来灭活时间
Time for complete inactivation(h)
外观及复溶
Appearance and redissolution
, 百拇医药
蔗糖
Sucrose
0
80
8.2
2.0
白，易溶
White,easily soluble
5
80
6.4
2.0
微黄，较易溶
, 百拇医药
Slight yellow,rlatively easily soluble
10
80
6.2
2.0
微黄，较易溶
Slight yellow,rlatively easily soluble
20
80
6.2…
黄，难溶
, 百拇医药 Yellow,difficult to dissolve
30
80
5.1…
黄，难溶
Yellow,difficult to dissolve
蔗糖
Sucrose
0
100
8.2
0.5
, 百拇医药
白，易溶
White,easily soluble
5
100
6.4
0.5
微黄，较易溶
Slight yellow,rlatively easily soluble
10
100
6.2
0.5
, 百拇医药
微黄，较易溶
Slight yellow,rlatively easily soluble
20
100
6.2…
黄，难溶
Yellow,difficult to dissolve
30
100
5.1…
黄，难溶
Yellow,difficult to dissolve
, 百拇医药
山梨醇
Sorbitol
0
80
8.4
2.0
白，易溶
White,easily soluble
5
80
6.1
2.0
微黄，较易溶
, http://www.100md.com
Slight yellow,rlatively easily soluble
10
80
6.1
2.0
微黄，较易溶
Slight yellow,rlatively easily soluble
20
80
6.2…
黄，难溶
, http://www.100md.com Yellow,difficult to dissolve
30
80
5.3…
黄，难溶
Yellow,difficult to dissolve
山梨醇
Sorbitol
0
100
8.4
0.5
, http://www.100md.com
白，易溶
White,easily soluble
5
100
6.1
0.5
微黄，较易溶
Slight yellow,rlatively easily soluble
10
100
6.1
0.5
, 百拇医药
微黄，较易溶
Slight yellow,rlatively easily soluble
20
100
6.2…
黄，难溶
Yellow,difficult to dissolve
30
100
5.3…
黄，难溶
Yellow,difficult to dissolve
, 百拇医药
2.3 糖类保护剂对微波灭活VSV的影响
糖类保护剂对微波灭活冻干IgG中的VSV具有一定影响。当IgG中糖含量为5%时，微波完全灭活其中的病毒所需时间较无糖者长；当糖含量达10%时，经微波处理5min后，冻干品变为深褐色，难溶，无法进行病毒灭活效果分析(表2)。表2 冻干IgG中不同糖含量对微波灭活VSV的影响
Table 2 Influence of different saccharide contents in lyophilized 奍gG on inactivating VSV by microwave 糖含量
Saccharide content
VSV滴度
VSV titer(TCID50,lg)
, 百拇医药
灭活时间
Inactivating time(min)
外观色泽
External color
复溶效果
Redissolution
0
8.2
4
微黄
Slight yellow
有絮状物
, http://www.100md.com
Presence of floccule
5%蔗糖
5%sucrose
6.4
5
黄
Yellow
难溶
Difficult to dissolve
5%山梨醇
5%sorbitol
6.1
, http://www.100md.com
5
黄
Yellow
难溶
Difficult to dissolve
10%蔗糖
10%sucrose
6.2…
深褐色
Dark browm
不溶
Insoluble
, http://www.100md.com
10%山梨醇
10%sorbitol
6.1…
深褐色
Dark browm
不溶
Imsoluble
注：微波炉功率为650W。
Note: The power of microwave oven was 650 W.
3 结语
本研究结果表明，冻干IgG中的蔗糖或山梨醇含量如果小于10%，它们对80℃和100℃干热法灭活病毒效果影响较小，但处理后的冻干品色泽有一定改变。当糖含量达20%以上时，热处理后的冻干IgG干固于容器壁上，难以溶化，这与糖含量过高所引起的冻干效果不好有关。我们认为，采用干热灭活法时，冻干蛋白中的糖类保护剂含量不宜过高。对于微波灭活法，本研究剂量不适于处理含糖的冻干蛋白制品。
参考文献
〔1〕王立兰.加热灭活病毒的静脉注射免疫球蛋白的研究.微生物学免疫学进展,1991；3：1.
〔2〕Gonzalez M, Murature DA, Fidelin GD. Thermal stability of human immunoglobulins with sorbitol. Vox Sang, 1995; 68:1.
收稿日期：1998-09-02 修回日期：1998-12-14, 百拇医药