酶联免疫吸附法测定健康成人的血清前白蛋白、转铁蛋白和视黄醇结合蛋白
作者：陈小莉 蔡东联 胡同杰
单位：第二军医大学附属长海医院营养科 解放军临床营养中心(上海市，200433)
关键词：前白蛋白；转铁蛋白；视黄醇结合蛋白；酶联免疫吸附法
肠外与肠内营养990114 摘要 目的：探讨酶联免疫吸附法测定前白蛋白(PA)、转铁蛋白(TRF)和视黄醇结合蛋白(RBP)的价值。方法：用酶联免疫吸附法测定32份健康成人血清样品的PA、TRF和RBP。结果：血清RBP为37.38±11.37 mg/L，PA为277.9±51.2 mg/L，TRF为2.61±0.36 g/L；并且RBP、PA和TRF之间有显著相关。结论：采用酶联免疫吸附法测定PA、TRF和RBP，简便、易行，且重复性好。
中图法分类号 R512.1
Determination of prealbumin,transferrin,retino-binding-protein
, 百拇医药
of serum by ELISA in healthy adults
Chen Xiaoli,Cai Donglian,Hu Tongjie
Department of Clinical Nutriology,Changhai Hospital,SMMU Center of Clinical Nutriology,CPLA
Abstract Objectives:To analyze the feasibility of using ELISA to test the serum concentrations of prealbumin(PA),transferrin(TRF),retinol-binding-protein(RBP). Methods:The serum concentrations of prealbumin,transferrin,retinol-binding-protein of 32 healthy adults were tested by ELISA. Results:The concentrations of serum RBP,PA,TRF were (37.78±11.37) mg/L,(277.9±51.2) mg/L and (2.61±0.36) g/L respectively,and there was a significant relationship among each other. Conclusions:The method is easy and well repeated.
, 百拇医药
Key words Prealbumin Transferrin Retinol-binding-protein ELISA
严重的营养不良在临床上比较容易诊断，但较轻的或亚临床的营养不良，单靠饮食调查或体检是很难作出诊断的，必须进行有关的实验室检查才能得出正确的结论。蛋白质实验室检查的指标很多，脏器蛋白消耗程度可用血清白蛋白(Alb)、前白蛋白(PA)、转铁蛋白(TRF)和视黄醇结合蛋白(RBP)等指标检测的结果，评价机体内蛋白消耗情况〔1〕。因为各种蛋白质在体内的生物半衰期不一，故在评价不同时间的蛋白质营养状况或是营养治疗效果时，应选择最为合适的方法〔2，3〕。本实验用酶联免疫吸附法测定血清PA、TRF和RBP的含量，以了解其敏感度和相关性。
1 材料和方法
1.1 血清样品 采集32份健康成人的静脉血，分离血清备用。所有血样的血清白蛋白均>35 g/L。
, http://www.100md.com
1.2 试剂 血清前白蛋白、转铁蛋白和视黄醇结合蛋白酶联免疫吸附试剂盒，均为上海德波生物技术有限公司生产。
1.3 测试仪器 DG5031酶联免疫检测仪为华东电子管厂生产。
1.4 测定方法
1.4.1 视黄醇结合蛋白测定 采用血视黄醇结合蛋白酶联免疫吸附法试剂盒(二步法)测定。操作步骤：将640 μg/L的标准，用稀释液进行倍比系列稀释成5、10、20、40、80、160、320 μg/L共7点标准，各取0.1 ml×2，分别加入血视黄醇结合蛋白包被板；取0.1 ml×2稀释液作为空白对照，分别加入血视黄醇结合蛋白包被板。具体步骤如下：
待测标本用稀释液(1∶600)稀释
取稀释后待测标本0.1 ml×2，分别加入血
, 百拇医药
视黄醇结合蛋白包被板
↓
37℃孵育20 min
↓
洗涤液洗涤4次，拍干
↓
血视黄醇结合蛋白酶标记物0.1 ml
加入各管(空白对照管不加)
↓
37℃孵育20 min
↓
洗涤液洗涤4次，拍干
, 百拇医药
↓
加入底物0.1 ml
↓
室温暗处放置20 min
↓
加入中止液1滴
↓
酶联免疫检测仪以空白对照管校零
↓
读取各自吸光值
1.4.2 前白蛋白和转铁蛋白测定 分别采用血前白蛋白和转铁蛋白酶联免疫吸附法试剂盒(一步法)测定。操作步骤：将前白蛋白19.2 mg/L标准液，用稀释液倍比稀释成0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6 mg/L共7点标准，将转铁蛋白256 mg/L标准液，用稀释液倍比稀释成4、8、16、32、64、128 mg/L共6点标准，各取50 μl×2，分别加入血前白蛋白、转铁蛋白包被板；待测标本用稀释液1∶201稀释后，分别取50 μl×2，加入血前白蛋白、转铁蛋白包被板。
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取稀释液50 μl×2作空白对照，加入血前白蛋白或转铁蛋白包被板
↓
除空白孔外，实验各孔加入前白蛋白
或转铁蛋白酶标记物50 μl
↓
以下步骤同视黄醇结合蛋白测定
1.5 结果统计 根据光密度计算血清前白蛋白、转铁蛋白和视黄醇结合蛋白的含量用
±s表示，与正常值比较，并进行相关分析。
2 结果
用酶联免疫吸附法测定32例正常人血清前白蛋白、转铁蛋白和视黄醇结合蛋白的含量，结果见附表。
, 百拇医药
附表 32例正常人血清RBP、PA和TRF测定结果
Table The results of serum concentrations of PA,TRF and RBP in 32 cases of healthy adult 编号
RBP(mg/L)
PA(mg/L)
TRF(g/L)
1
37.62
209
2.79
2
, 百拇医药
29.44
267
1.96
3
36.84
282
2.68
4
44.34
237
2.32
5
45.06
, http://www.100md.com
215
2.10
6
65.94
293
2.68
7
44.34
307
3.02
8
65.94
400
, 百拇医药
2.79
9
22.50
347
2.40
10
41.34
237
2.21
11
36.84
228
2.40
, http://www.100md.com
12
48.60
280
2.53
13
20.70
234
2.19
14
34.62
333
2.08
15
, 百拇医药
40.62
373
2.68
16
33.12
360
2.40
17
31.62
237
2.85
18
24.90
, http://www.100md.com
203
2.91
19
24.90
307
2.62
20
21.90
293
2.79
21
23.16
333
, 百拇医药
3.00
22
47.34
307
3.29
23
39.84
267
2.66
24
46.56
293
2.87
, http://www.100md.com
25
31.62
212
2.98
26
29.40
320
2.85
27
28.62
240
2.94
28
, 百拇医药
32.40
228
3.06
29
38.12
225
3.11
30
38.64
307
2.19
31
29.34
, http://www.100md.com
280
2.53
32
60.02
240
1.79
根据附表的结果经统计学处理，32例正常人血清RBP为37.38±11.37 mg/L，PA为277.9±51.2 mg/L，TRF为2.91±0.36 g/L。相关分析的结果显示RBP、PA和TRF之间均有显著的相关性。
3 讨论
以往测定这几种蛋白质多用化学或是生化的方法，敏感性低，所需时间较长；而采用酶联免疫吸附法测定简便、易行，而且重复性好。
, 百拇医药
血清白蛋白为肝内合成的主要蛋白，体内含量较多，达4～5 g/kg体重，其半衰期约20天左右。是临床上评价蛋白质营养状况的常用指标之一，但用于较短时间内的营养评价时，则敏感性差。通常评价较短时间内蛋白质营养状况时，应根据实验或营养治疗的周期，适当选 用TRF、RBP和PA。TRF半衰期8～10天，平均8.8天，是评价蛋白质营养状况比较敏感的指标〔1〕。细胞外贮存量仅4 mg，可作为测量脏器蛋白质贮存的方法。但转铁蛋白代谢复杂，影响因素较多，在缺铁、肝功能损害与蛋白质丧失等均可影响转铁蛋白的值〔4〕。作为人群营养状态的指标有一定准确性，但用作测定个体营养状况则价值不大。
RBP和PA半衰期均比白蛋白短得多，而且特异性高，半衰期甲状腺素结合前白蛋白(TBPA)约1.9天，RBP约为12 h。肥胖的健康人在接受饥饿饮食后，血清RBP和PA变化比TRF和触珠蛋白均快得多。前二者血中水平迅速下降，而TRF和触珠蛋白则呈逐渐降低。在摄入足够热能，蛋白质早期缺乏时，PA下降不太明显，但单限制热能即可使得PA降低。与白蛋白相似，这两种蛋白质都在肝内合成，严重肝功能障碍时血浓度均下降。以前的研究多集中在与维生素A代谢的关系上，后来发现当蛋白缺乏期间其血浆含量降低，而且反映比上述血浆蛋白灵敏。当补充蛋白质后血浆浓度迅速升高。现常用视黄醇结合蛋白研究营养治疗早期效应。有报道发现血清RBP和血清维生素A含量有高度的相关性，认为RBP可以作为反应维生素A缺乏的敏感指标。此外，也有选用纤维连接蛋白和生长调节素作为蛋白质营养状况的监测指标〔5〕。纤维连接蛋白为糖蛋白，对免疫抗体甚为重要，在饥饿、严重创伤及肿瘤时均有下降；半衰期介于RBP和PA之间(20 h)。TPN病人以上指标反应不明显，而纤维连接蛋白有明显改变，故可用纤维连接蛋白作为短期应用TPN营养不良病人的评定营养状况指标〔6〕。生长调节素C为主要参与脂肪、肌肉和软骨合成代谢物质。氮平衡与生长调节素C之间有显著正相关。饥饿时生长调节素C水平下降，进食后上升。生长调节素半衰期很短，为2～8 h，与脏器蛋白间相关性尚未证实。
, 百拇医药
综上所述，采用酶联免疫吸附法测定血清TRF、RBP和PA的含量，操作简便、快速，而且灵敏度高，可用于短期临床营养治疗时对蛋白质营养状况的评价。
参考文献
1 Haider M,Haider SQ.Assenssment of protein-calorie malnutrition.Clin Chem,1984，30:1286
2 Dietscher JE,Foulks CJ,Smith RW.Nutritional response of patients in an intensive care unit to an elemental formula vs a standard enteral formula.J Am Diet Assoc,1998,98(3):335
3 Winkler MF.Use of retinol-binding protien and peralbumin as indicators of response to nutrition therapy.Am J Diet Assoc,1989,89:684
, 百拇医药
4 Shiga C,Ohi R,Chiba T,et al.Assessment of nutritional status of post operative patients with biliary atresia.Tohoku J Exp Med,1997,181(1):217
5 Karr M,Mira M,Causer J,et al.Age-specific reference intervals for plasma vitamins A,E and beta-carotene and for serum zinc,retinol-binding protein and prealbumin for sydney children aged 9～62 months.Int J Vitam Nutr Res,1997,67(6):432
6 Guo C,Xu Q,Wei J,et al.Responses of plasma fibronectin to the changes of dietary protein levels in rats.Nutrition,1997,13(4):327
(1998-08-13收稿), http://www.100md.com
单位：第二军医大学附属长海医院营养科 解放军临床营养中心(上海市，200433)
关键词：前白蛋白；转铁蛋白；视黄醇结合蛋白；酶联免疫吸附法
肠外与肠内营养990114 摘要 目的：探讨酶联免疫吸附法测定前白蛋白(PA)、转铁蛋白(TRF)和视黄醇结合蛋白(RBP)的价值。方法：用酶联免疫吸附法测定32份健康成人血清样品的PA、TRF和RBP。结果：血清RBP为37.38±11.37 mg/L，PA为277.9±51.2 mg/L，TRF为2.61±0.36 g/L；并且RBP、PA和TRF之间有显著相关。结论：采用酶联免疫吸附法测定PA、TRF和RBP，简便、易行，且重复性好。
中图法分类号 R512.1
Determination of prealbumin,transferrin,retino-binding-protein
, 百拇医药
of serum by ELISA in healthy adults
Chen Xiaoli,Cai Donglian,Hu Tongjie
Department of Clinical Nutriology,Changhai Hospital,SMMU Center of Clinical Nutriology,CPLA
Abstract Objectives:To analyze the feasibility of using ELISA to test the serum concentrations of prealbumin(PA),transferrin(TRF),retinol-binding-protein(RBP). Methods:The serum concentrations of prealbumin,transferrin,retinol-binding-protein of 32 healthy adults were tested by ELISA. Results:The concentrations of serum RBP,PA,TRF were (37.78±11.37) mg/L,(277.9±51.2) mg/L and (2.61±0.36) g/L respectively,and there was a significant relationship among each other. Conclusions:The method is easy and well repeated.
, 百拇医药
Key words Prealbumin Transferrin Retinol-binding-protein ELISA
严重的营养不良在临床上比较容易诊断，但较轻的或亚临床的营养不良，单靠饮食调查或体检是很难作出诊断的，必须进行有关的实验室检查才能得出正确的结论。蛋白质实验室检查的指标很多，脏器蛋白消耗程度可用血清白蛋白(Alb)、前白蛋白(PA)、转铁蛋白(TRF)和视黄醇结合蛋白(RBP)等指标检测的结果，评价机体内蛋白消耗情况〔1〕。因为各种蛋白质在体内的生物半衰期不一，故在评价不同时间的蛋白质营养状况或是营养治疗效果时，应选择最为合适的方法〔2，3〕。本实验用酶联免疫吸附法测定血清PA、TRF和RBP的含量，以了解其敏感度和相关性。
1 材料和方法
1.1 血清样品 采集32份健康成人的静脉血，分离血清备用。所有血样的血清白蛋白均>35 g/L。
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1.2 试剂 血清前白蛋白、转铁蛋白和视黄醇结合蛋白酶联免疫吸附试剂盒，均为上海德波生物技术有限公司生产。
1.3 测试仪器 DG5031酶联免疫检测仪为华东电子管厂生产。
1.4 测定方法
1.4.1 视黄醇结合蛋白测定 采用血视黄醇结合蛋白酶联免疫吸附法试剂盒(二步法)测定。操作步骤：将640 μg/L的标准，用稀释液进行倍比系列稀释成5、10、20、40、80、160、320 μg/L共7点标准，各取0.1 ml×2，分别加入血视黄醇结合蛋白包被板；取0.1 ml×2稀释液作为空白对照，分别加入血视黄醇结合蛋白包被板。具体步骤如下：
待测标本用稀释液(1∶600)稀释
取稀释后待测标本0.1 ml×2，分别加入血
, 百拇医药
视黄醇结合蛋白包被板
↓
37℃孵育20 min
↓
洗涤液洗涤4次，拍干
↓
血视黄醇结合蛋白酶标记物0.1 ml
加入各管(空白对照管不加)
↓
37℃孵育20 min
↓
洗涤液洗涤4次，拍干
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↓
加入底物0.1 ml
↓
室温暗处放置20 min
↓
加入中止液1滴
↓
酶联免疫检测仪以空白对照管校零
↓
读取各自吸光值
1.4.2 前白蛋白和转铁蛋白测定 分别采用血前白蛋白和转铁蛋白酶联免疫吸附法试剂盒(一步法)测定。操作步骤：将前白蛋白19.2 mg/L标准液，用稀释液倍比稀释成0.15、0.3、0.6、1.2、2.4、4.8、9.6 mg/L共7点标准，将转铁蛋白256 mg/L标准液，用稀释液倍比稀释成4、8、16、32、64、128 mg/L共6点标准，各取50 μl×2，分别加入血前白蛋白、转铁蛋白包被板；待测标本用稀释液1∶201稀释后，分别取50 μl×2，加入血前白蛋白、转铁蛋白包被板。
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取稀释液50 μl×2作空白对照，加入血前白蛋白或转铁蛋白包被板
↓
除空白孔外，实验各孔加入前白蛋白
或转铁蛋白酶标记物50 μl
↓
以下步骤同视黄醇结合蛋白测定
1.5 结果统计 根据光密度计算血清前白蛋白、转铁蛋白和视黄醇结合蛋白的含量用
±s表示，与正常值比较，并进行相关分析。2 结果
用酶联免疫吸附法测定32例正常人血清前白蛋白、转铁蛋白和视黄醇结合蛋白的含量，结果见附表。
, 百拇医药
附表 32例正常人血清RBP、PA和TRF测定结果
Table The results of serum concentrations of PA,TRF and RBP in 32 cases of healthy adult 编号
RBP(mg/L)
PA(mg/L)
TRF(g/L)
1
37.62
209
2.79
2
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29.44
267
1.96
3
36.84
282
2.68
4
44.34
237
2.32
5
45.06
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215
2.10
6
65.94
293
2.68
7
44.34
307
3.02
8
65.94
400
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2.79
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22.50
347
2.40
10
41.34
237
2.21
11
36.84
228
2.40
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12
48.60
280
2.53
13
20.70
234
2.19
14
34.62
333
2.08
15
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360
2.40
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237
2.85
18
24.90
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203
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19
24.90
307
2.62
20
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293
2.79
21
23.16
333
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3.00
22
47.34
307
3.29
23
39.84
267
2.66
24
46.56
293
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25
31.62
212
2.98
26
29.40
320
2.85
27
28.62
240
2.94
28
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32.40
228
3.06
29
38.12
225
3.11
30
38.64
307
2.19
31
29.34
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280
2.53
32
60.02
240
1.79
根据附表的结果经统计学处理，32例正常人血清RBP为37.38±11.37 mg/L，PA为277.9±51.2 mg/L，TRF为2.91±0.36 g/L。相关分析的结果显示RBP、PA和TRF之间均有显著的相关性。
3 讨论
以往测定这几种蛋白质多用化学或是生化的方法，敏感性低，所需时间较长；而采用酶联免疫吸附法测定简便、易行，而且重复性好。
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血清白蛋白为肝内合成的主要蛋白，体内含量较多，达4～5 g/kg体重，其半衰期约20天左右。是临床上评价蛋白质营养状况的常用指标之一，但用于较短时间内的营养评价时，则敏感性差。通常评价较短时间内蛋白质营养状况时，应根据实验或营养治疗的周期，适当选 用TRF、RBP和PA。TRF半衰期8～10天，平均8.8天，是评价蛋白质营养状况比较敏感的指标〔1〕。细胞外贮存量仅4 mg，可作为测量脏器蛋白质贮存的方法。但转铁蛋白代谢复杂，影响因素较多，在缺铁、肝功能损害与蛋白质丧失等均可影响转铁蛋白的值〔4〕。作为人群营养状态的指标有一定准确性，但用作测定个体营养状况则价值不大。
RBP和PA半衰期均比白蛋白短得多，而且特异性高，半衰期甲状腺素结合前白蛋白(TBPA)约1.9天，RBP约为12 h。肥胖的健康人在接受饥饿饮食后，血清RBP和PA变化比TRF和触珠蛋白均快得多。前二者血中水平迅速下降，而TRF和触珠蛋白则呈逐渐降低。在摄入足够热能，蛋白质早期缺乏时，PA下降不太明显，但单限制热能即可使得PA降低。与白蛋白相似，这两种蛋白质都在肝内合成，严重肝功能障碍时血浓度均下降。以前的研究多集中在与维生素A代谢的关系上，后来发现当蛋白缺乏期间其血浆含量降低，而且反映比上述血浆蛋白灵敏。当补充蛋白质后血浆浓度迅速升高。现常用视黄醇结合蛋白研究营养治疗早期效应。有报道发现血清RBP和血清维生素A含量有高度的相关性，认为RBP可以作为反应维生素A缺乏的敏感指标。此外，也有选用纤维连接蛋白和生长调节素作为蛋白质营养状况的监测指标〔5〕。纤维连接蛋白为糖蛋白，对免疫抗体甚为重要，在饥饿、严重创伤及肿瘤时均有下降；半衰期介于RBP和PA之间(20 h)。TPN病人以上指标反应不明显，而纤维连接蛋白有明显改变，故可用纤维连接蛋白作为短期应用TPN营养不良病人的评定营养状况指标〔6〕。生长调节素C为主要参与脂肪、肌肉和软骨合成代谢物质。氮平衡与生长调节素C之间有显著正相关。饥饿时生长调节素C水平下降，进食后上升。生长调节素半衰期很短，为2～8 h，与脏器蛋白间相关性尚未证实。
, 百拇医药
综上所述，采用酶联免疫吸附法测定血清TRF、RBP和PA的含量，操作简便、快速，而且灵敏度高，可用于短期临床营养治疗时对蛋白质营养状况的评价。
参考文献
1 Haider M,Haider SQ.Assenssment of protein-calorie malnutrition.Clin Chem,1984，30:1286
2 Dietscher JE,Foulks CJ,Smith RW.Nutritional response of patients in an intensive care unit to an elemental formula vs a standard enteral formula.J Am Diet Assoc,1998,98(3):335
3 Winkler MF.Use of retinol-binding protien and peralbumin as indicators of response to nutrition therapy.Am J Diet Assoc,1989,89:684
, 百拇医药
4 Shiga C,Ohi R,Chiba T,et al.Assessment of nutritional status of post operative patients with biliary atresia.Tohoku J Exp Med,1997,181(1):217
5 Karr M,Mira M,Causer J,et al.Age-specific reference intervals for plasma vitamins A,E and beta-carotene and for serum zinc,retinol-binding protein and prealbumin for sydney children aged 9～62 months.Int J Vitam Nutr Res,1997,67(6):432
6 Guo C,Xu Q,Wei J,et al.Responses of plasma fibronectin to the changes of dietary protein levels in rats.Nutrition,1997,13(4):327
(1998-08-13收稿), http://www.100md.com