二氧化氮对肺组织匀浆某些生化指标的影响
作者：宋蔚忠 夏亚东 郭绪益 闻思真
单位：宋蔚忠(军事医学科学院毒物药物研究所二室 (北京 100850));夏亚东(军事医学科学院毒物药物研究所二室 (北京 100850));郭绪益(军事医学科学院毒物药物研究所二室 (北京 100850));闻思真(军事医学科学院毒物药物研究所二室 (北京 100850))
关键词：
卫生毒理学杂志000411 二氧化氮(NO2)是氮氧化物在空气中的主要存在形式，是城市环境污染物的重要组成部分，可诱发肺组织损伤。但致肺损伤的机理尚不十分清楚。NO2本身是自由基，可能通过脂质过氧化作用破坏肺组织细胞[1]。但在动物实验，实验条件不同，结果也不一致。本实验在体外直接观察NO2对肺匀浆某些生化指标的影响。
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1 材料与方法
1.1 肺匀浆制备
健康雄性Wistar大鼠，体重200±20g，股动脉放血处死，取肺组织，除去支气管和大血管，在冰浴中制备10%肺匀浆。匀浆液为：0.9%生理盐水+50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.4)+0.001mol EDTA。肺匀浆制备后，立即500r/min离心10min，取上层液3.0ml加入直径为6.0cm的玻璃培养皿内，使匀浆液在培养皿底部均匀形成一薄层。
1.2 染毒
液态NO4由航天工业总公司第一研究院101所提供，纯度大于99.5%，比重为1.45g/cm3，冰点-12.2℃，沸点21.1℃。四氧化二氮在空气中迅速挥发分解，以NO2形式存在。
, 百拇医药 把装有肺匀浆的培养皿放于染毒柜内，用微量注射器抽取一定体积的液态四氧化二氮注入染毒柜，风扇混匀，用二氧化氮监测仪(上海电光器件厂，2000系列2150型)监测柜内浓度。设43.0、88.8、127.9mg/m3三个染毒浓度组，各组染毒时间均为30min。
1.3 测定指标及方法
丙二醛(MDA)测定采用硫代巴比妥酸法[2]。标准品为1，1，3，3-四乙氧基丙烷(Fluka公司)。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定按TNB直接法[3]。GSH-Px比活力单位(u)：规定为每0.1g组织每分钟扣除非酶反应，使GSH浓度降低1u mol为一个酶活力单位。维生素E(VE)测定采用荧光法[4]。总巯基测定参见Ellman法[5]。
1.4 统计学处理
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用t检验。
2 结果
2.1 NO2对肺匀浆某些抗氧化指标的影响
如表1所示，肺匀浆中GSH-Px，VE及总巯基的含量均显著降低，且具有明显的剂量-反应关系，表现染毒浓度越高，下降越明显。
表1 NO2对肺匀浆GSH-Px，VE及总巯基的影响(
±s)
NO2
(mg/m3)
, 百拇医药
n
GSH-Px
(u/g)
VE
(μg/g)
总巯基
(μmol/g)
对照组
4
388.5±12.0
6.9±0.2
9.5±0.3
, 百拇医药 43.0
4
260.0± 6.8**
5.3±0.6**
7.3±0.2**
88.8
4
208.8±11.7**
5.9±0.5*
5.5±0.4**
127.9
, 百拇医药
4
121.4±15.2**
5.6±0.7*
4.2±0.1**
与对照组比较，*P<0.05 * *P<0.01
2.2 NO2对肺匀浆MDA含量的影响
由表2可见，MDA含量显著下降，且具有明显的剂量-反应关系，表现随染毒剂量增加，降低更为明显。
表2 NO2对肺匀浆MDA含量的影响(±s)
, 百拇医药
NO2(mg/m3)
n
MDA(nmol/g)
对照组
3
109.6±3.0
43.0
3
103.0±1.2*
88.8
3
98.4±2.0**
, 百拇医药
127.9
3
93.8±2.3**
与对照组比较，*P<0.05 * *P<0.01
2.3 NO-2或NO-3对肺匀浆中MDA含量的影响
NO2在肺组织中最终产物为NO-2和NO-3，为探讨NO2使肺匀浆MDA下降是否与其代谢产物有关及对MDA测定方法的影响，作了如下观察。
在肺匀浆中加入NO-2或NO-3，对照组加入等量蒸馏水，测定MDA的含量，结果如表3所示，NO-2可使肺匀浆MDA含量降低，肺匀浆中NO-2浓度越高，MDA含量越低，NO-3对肺匀浆MDA含量无影响。
, 百拇医药
表3 NO-2和NO-3对肺匀浆MDA含量的影响(±s)
组别
n
浓度(μmol)
MDA(nmol/g)
对照
3
0
109.6±3.0
, 百拇医药
NO-2
3
0.3
108.9±2.2
NO-2
3
0.75
102.3±2.0**
NO-2
3
1.5
, 百拇医药
94.5±2.0**
NO-2
3
3.0
87.3±1.2**
NO-3
3
0.75
110.2±9.0
NO-3
3
, 百拇医药
3.0
114.2±5.2
与对照组比较，* *P<0.01
测定生物样品中MDA的原理是：过氧化脂质的分解产物MDA与TBA反应，产生粉红色呈色物，通过测定呈色物的量反应MDA的量。因1，1，3，3-四乙氧基丙烷(TEP)与过氧化脂质同样分解产生MDA，因此用TEP作标准品定量。在本实验中把NO-2加入TEP溶液，观察NO-2对MDA与TBA反应的影响，结果如表4所示，加入NO-2对标准管的吸收率值无影响。
表4 NO2对TEP与TBA反应吸光度的影响(±s)
, 百拇医药
组 别
n
AD值
TEP
3
0.127±0.002
TEP+NO-2(0.75μmol)
3
0.126±0.002
TEP+NO-2(3.0μmol)
3
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0.125±0.002
3 讨论
自由基能攻击膜的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化，影响膜的功能，导致线粒体和溶酶体膜受损，蛋白水解酶释出。机体具有抗氧化防御系统，使自由基的产生和清除保持平衡，使机体不致遭到损害。如果内源性自由基生成过多或外源性自由基的参与，破坏了体内自由基生成和清除之间的平衡，脂质过氧化作用不能及时被终止，产物在体内蓄积，就可造成组织细胞的损伤。
NO2本身是自由基，在体外化学反应体系，它能与不饱和脂肪酸反应，启动脂质过氧化[6]。但在整体实验，实验条件不同，结果也不一致。本文观察在体外肺匀浆接触NO2后脂质过氧化的变化，排除了整体动物实验时机体复杂的防御系统及产物转运的影响，更直接的反应了NO2的作用。实验结果表明，肺匀浆接触NO2后，抗氧化酶及抗氧化剂含量均显著下降，表明NO2可直接损伤肺组织的抗氧化系统，使其抗氧化能力下降，细胞易于受到自由基的攻击，这在NO2致肺损伤中可能起一定作用。
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本研究中，肺匀浆接触NO2后，MDA含量明显降低，这是一个较为反常的现象。Sagai等[7]也曾报道，大鼠NO2染毒后，肺组织MDA含量及呼出气中乙烷含量均显著降低。NO2与肺组织细胞成分反应，其转化产物主要是NO-2和NO-3[8]。本实验中NO-2使肺匀浆MDA含量降低，但对MDA与TBA的反应无影响，即NO-2使MDA下降不是由于测定方法的原因。
参考文献
1，Mayorga MA.Overview of nitrogen dioxide effects on the lung with emphasis on military relevance.Toxicology,1994,89:176.
, 百拇医药
2，Ohkawa H, Ohishi N,Yagi K. Assay for lipid peroxides in animals tissues by thiobarbituric acid reaction.Analyt Biochem,1979,95:351-358.
3，夏奕明，朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定方法.卫生研究，1987，16(4)：29-33.
4，候少范，朱振源.生物材料中生育酚的荧光测定法.分析化学，1982，10(9)：535-539.
5，Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups.Arch Biochem Biophys,1959,82:70.
6，Pryor WA and Lightsey JW. Mechnism of nitrgen dioxide reactions:intiation of lipid peroxidation and the production of nitrous acid.Science,1981,214:435-437.
, 百拇医药
7，Sagai M, lchinose T, Oda H, et al. Studies on biochemical effects of nitrogen dioxide.Ⅱ. Changes of the protective systems in rat lungs and of lipid peroxidation by acute exposure.J Toxicol Environ Health,1982,9:153-164.
8，Postlethwait EM, Bidani A. Pulmonary diposition of inhaled NO2-Nitrogen in isolated rat lungs.Toxixol Appl Pharmacol,1989,98:303-312.
(收稿：1999-01-04), 百拇医药
单位：宋蔚忠(军事医学科学院毒物药物研究所二室 (北京 100850));夏亚东(军事医学科学院毒物药物研究所二室 (北京 100850));郭绪益(军事医学科学院毒物药物研究所二室 (北京 100850));闻思真(军事医学科学院毒物药物研究所二室 (北京 100850))
关键词：
卫生毒理学杂志000411 二氧化氮(NO2)是氮氧化物在空气中的主要存在形式，是城市环境污染物的重要组成部分，可诱发肺组织损伤。但致肺损伤的机理尚不十分清楚。NO2本身是自由基，可能通过脂质过氧化作用破坏肺组织细胞[1]。但在动物实验，实验条件不同，结果也不一致。本实验在体外直接观察NO2对肺匀浆某些生化指标的影响。
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1 材料与方法
1.1 肺匀浆制备
健康雄性Wistar大鼠，体重200±20g，股动脉放血处死，取肺组织，除去支气管和大血管，在冰浴中制备10%肺匀浆。匀浆液为：0.9%生理盐水+50mmol磷酸盐缓冲液(pH7.4)+0.001mol EDTA。肺匀浆制备后，立即500r/min离心10min，取上层液3.0ml加入直径为6.0cm的玻璃培养皿内，使匀浆液在培养皿底部均匀形成一薄层。
1.2 染毒
液态NO4由航天工业总公司第一研究院101所提供，纯度大于99.5%，比重为1.45g/cm3，冰点-12.2℃，沸点21.1℃。四氧化二氮在空气中迅速挥发分解，以NO2形式存在。
, 百拇医药 把装有肺匀浆的培养皿放于染毒柜内，用微量注射器抽取一定体积的液态四氧化二氮注入染毒柜，风扇混匀，用二氧化氮监测仪(上海电光器件厂，2000系列2150型)监测柜内浓度。设43.0、88.8、127.9mg/m3三个染毒浓度组，各组染毒时间均为30min。
1.3 测定指标及方法
丙二醛(MDA)测定采用硫代巴比妥酸法[2]。标准品为1，1，3，3-四乙氧基丙烷(Fluka公司)。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测定按TNB直接法[3]。GSH-Px比活力单位(u)：规定为每0.1g组织每分钟扣除非酶反应，使GSH浓度降低1u mol为一个酶活力单位。维生素E(VE)测定采用荧光法[4]。总巯基测定参见Ellman法[5]。
1.4 统计学处理
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用t检验。
2 结果
2.1 NO2对肺匀浆某些抗氧化指标的影响
如表1所示，肺匀浆中GSH-Px，VE及总巯基的含量均显著降低，且具有明显的剂量-反应关系，表现染毒浓度越高，下降越明显。
表1 NO2对肺匀浆GSH-Px，VE及总巯基的影响(
±s)NO2
(mg/m3)
, 百拇医药
n
GSH-Px
(u/g)
VE
(μg/g)
总巯基
(μmol/g)
对照组
4
388.5±12.0
6.9±0.2
9.5±0.3
, 百拇医药 43.0
4
260.0± 6.8**
5.3±0.6**
7.3±0.2**
88.8
4
208.8±11.7**
5.9±0.5*
5.5±0.4**
127.9
, 百拇医药
4
121.4±15.2**
5.6±0.7*
4.2±0.1**
与对照组比较，*P<0.05 * *P<0.01
2.2 NO2对肺匀浆MDA含量的影响
由表2可见，MDA含量显著下降，且具有明显的剂量-反应关系，表现随染毒剂量增加，降低更为明显。
表2 NO2对肺匀浆MDA含量的影响(
±s), 百拇医药
NO2(mg/m3)
n
MDA(nmol/g)
对照组
3
109.6±3.0
43.0
3
103.0±1.2*
88.8
3
98.4±2.0**
, 百拇医药
127.9
3
93.8±2.3**
与对照组比较，*P<0.05 * *P<0.01
2.3 NO-2或NO-3对肺匀浆中MDA含量的影响
NO2在肺组织中最终产物为NO-2和NO-3，为探讨NO2使肺匀浆MDA下降是否与其代谢产物有关及对MDA测定方法的影响，作了如下观察。
在肺匀浆中加入NO-2或NO-3，对照组加入等量蒸馏水，测定MDA的含量，结果如表3所示，NO-2可使肺匀浆MDA含量降低，肺匀浆中NO-2浓度越高，MDA含量越低，NO-3对肺匀浆MDA含量无影响。
, 百拇医药
表3 NO-2和NO-3对肺匀浆MDA含量的影响(
±s)组别
n
浓度(μmol)
MDA(nmol/g)
对照
3
0
109.6±3.0
, 百拇医药
NO-2
3
0.3
108.9±2.2
NO-2
3
0.75
102.3±2.0**
NO-2
3
1.5
, 百拇医药
94.5±2.0**
NO-2
3
3.0
87.3±1.2**
NO-3
3
0.75
110.2±9.0
NO-3
3
, 百拇医药
3.0
114.2±5.2
与对照组比较，* *P<0.01
测定生物样品中MDA的原理是：过氧化脂质的分解产物MDA与TBA反应，产生粉红色呈色物，通过测定呈色物的量反应MDA的量。因1，1，3，3-四乙氧基丙烷(TEP)与过氧化脂质同样分解产生MDA，因此用TEP作标准品定量。在本实验中把NO-2加入TEP溶液，观察NO-2对MDA与TBA反应的影响，结果如表4所示，加入NO-2对标准管的吸收率值无影响。
表4 NO2对TEP与TBA反应吸光度的影响(
±s), 百拇医药
组 别
n
AD值
TEP
3
0.127±0.002
TEP+NO-2(0.75μmol)
3
0.126±0.002
TEP+NO-2(3.0μmol)
3
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0.125±0.002
3 讨论
自由基能攻击膜的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化，影响膜的功能，导致线粒体和溶酶体膜受损，蛋白水解酶释出。机体具有抗氧化防御系统，使自由基的产生和清除保持平衡，使机体不致遭到损害。如果内源性自由基生成过多或外源性自由基的参与，破坏了体内自由基生成和清除之间的平衡，脂质过氧化作用不能及时被终止，产物在体内蓄积，就可造成组织细胞的损伤。
NO2本身是自由基，在体外化学反应体系，它能与不饱和脂肪酸反应，启动脂质过氧化[6]。但在整体实验，实验条件不同，结果也不一致。本文观察在体外肺匀浆接触NO2后脂质过氧化的变化，排除了整体动物实验时机体复杂的防御系统及产物转运的影响，更直接的反应了NO2的作用。实验结果表明，肺匀浆接触NO2后，抗氧化酶及抗氧化剂含量均显著下降，表明NO2可直接损伤肺组织的抗氧化系统，使其抗氧化能力下降，细胞易于受到自由基的攻击，这在NO2致肺损伤中可能起一定作用。
, http://www.100md.com
本研究中，肺匀浆接触NO2后，MDA含量明显降低，这是一个较为反常的现象。Sagai等[7]也曾报道，大鼠NO2染毒后，肺组织MDA含量及呼出气中乙烷含量均显著降低。NO2与肺组织细胞成分反应，其转化产物主要是NO-2和NO-3[8]。本实验中NO-2使肺匀浆MDA含量降低，但对MDA与TBA的反应无影响，即NO-2使MDA下降不是由于测定方法的原因。
参考文献
1，Mayorga MA.Overview of nitrogen dioxide effects on the lung with emphasis on military relevance.Toxicology,1994,89:176.
, 百拇医药
2，Ohkawa H, Ohishi N,Yagi K. Assay for lipid peroxides in animals tissues by thiobarbituric acid reaction.Analyt Biochem,1979,95:351-358.
3，夏奕明，朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定方法.卫生研究，1987，16(4)：29-33.
4，候少范，朱振源.生物材料中生育酚的荧光测定法.分析化学，1982，10(9)：535-539.
5，Ellman GL. Tissue sulfhydryl groups.Arch Biochem Biophys,1959,82:70.
6，Pryor WA and Lightsey JW. Mechnism of nitrgen dioxide reactions:intiation of lipid peroxidation and the production of nitrous acid.Science,1981,214:435-437.
, 百拇医药
7，Sagai M, lchinose T, Oda H, et al. Studies on biochemical effects of nitrogen dioxide.Ⅱ. Changes of the protective systems in rat lungs and of lipid peroxidation by acute exposure.J Toxicol Environ Health,1982,9:153-164.
8，Postlethwait EM, Bidani A. Pulmonary diposition of inhaled NO2-Nitrogen in isolated rat lungs.Toxixol Appl Pharmacol,1989,98:303-312.
(收稿：1999-01-04), 百拇医药