细胞与分子生物学新技术在我国毒理学研究中的应用
作者：庄志雄
单位：庄志雄(深圳市卫生防疫站 (518020))
关键词：差异显示；穿梭质粒；转基因动物；荧光原位杂交；流式细胞技术
卫生毒理学杂志000403 摘要 近年来，随着一些先进的细胞和分子生物学技术的引进与建立，我国毒理学研究整体水平得以大大的提高。现介绍几种我国已开展的细胞和分子生物学新技术的原理及其在毒理学领域中的应用，包括：差异显示技术、单细胞凝胶电泳技术、穿梭质粒pZ189和pSp189转染技术、转基因动物和转基因细胞、荧光原位杂交和流式细胞技术。这些技术具有终点明确，敏感性高等特点，在检测各种不同类型的DNA损伤和基因突变，以及研究细胞毒性和致癌的分子机理方面具有重要的价值。
Application of new technology on cellular and molecular biology to toxicological research in China
, 百拇医药
ZHUANG Zhi-Xiong
(Shenzhen Health and Anti-epidemic Station 518020)
ABSTRACT Following introduction and establishment of some advanced technologies on cellular and molecular biology,the overall level of toxicological research in China has been greatly improved in recent years.Both principle and toxicological application of new technologies on cellular and molecular biology,including differential display,single cell gel electrophoresis(comet assay),shuttle plasmid(pZ189 and pSp189) transfection,transgene animals and cells,fluorescence in situ hybridization (FISH)and flow cytometry,developed and carried out in China were reviewed.These technologies are characterized with clear endpoints and higher sensitivities,They are very important values in both detecting various types of DNA damages and gene mutations and exploring the molecular mechanisms of cellular toxicity and carcinogenesis.
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KEY WORDS Differential display;Shuttle plasmid;Transgene animal;Fluorescence in situ hybridization;Flow cytometry;
近20年来，毒理学领域发生前所未有的巨大进展，而这些进展的取得，在很大程度上得益于科学新思想的渗透和新技术的应用。特别是细胞生物学和分子生物学理论和技术的飞速发展，赋予毒理学工作者新的启迪和工具，从而改变了毒理学研究的基本格局，真正实现了从整体和器官水平向细胞和分子水平的飞跃。1993年3月，美国著名的科学专栏评论家Marshall在“Science”杂志上以显要的位置发表了题为“毒理学进入分子水平”(Toxicology goes molecular)的专论，指出“一批新的毒理学家正在应用超敏感的探针检测细胞水平的毒效应，并制订出预防接触这些毒物的措施”(A new bread of toxicologists is using ultrasensitive probes to discern toxic effects at the cellular level and working on preventive measures for those exposed)。中国毒理学会理事长吴德昌院士在中国毒理学会第二届学术会议(1997，5，西安)所作的“迎接21世纪的中国毒理学”报告中强调，随着医学科学的发展，毒理学也已经和正在发生着巨大的进展和变化，其中最重要的变化是“分子生物学理论和技术的引入，由于癌基因、抑癌基因、外源物受体删除模型及其他相关领域的重大发现与进展，使得人们对外源物致癌机理及生物学的理解有很大的提高，在研究方法中基因引入技术令人瞩目，可以此来深入研究DNA所引起的毒理学作用”。纵观我国毒理学的发展历程，一些常用的细胞与分子生物学技术，如：基因重组和克隆技术、核酸杂交技术、PCR技术、DNA测序技术以及一系列突变检测技术已广泛应用于外来化学物和环境致癌物引起的DNA损害、基因突变、加合物形成、基因多态、癌基因和抑癌基因的检测，数量逐年增加。特别是近年来，一些新的细胞与分子生物学技术的引进与建立，大大提高了毒理学研究的整体水平。现着重对我国近年来新开展的几项细胞与分子生物学技术的原理及其在毒理学领域的应用进行评述。
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1 差异显示技术
分子生物学的许多技术如Southern和Northern印迹技术、PCR技术和原位杂交技术等，都赖以应用特定的探针或引物才可测知基因的改变和表达的情况，而某一基因的探针或引物常须在该基因已被克隆和了解之后才能获得。由于各种化学毒物和环境危害因素引起的基因改变或新基因的出现大多是未知的。未知新基因的探查、分离和克隆是一项非常重要和具有创造性的工作，常用方法有差减杂交法(Subtraction hybridization)，差异显示法(Differential display)和染色体步移法(Cromosome walking)。这些方法各有其优缺点，要求条件难易程度不同。在我国现有实验条件下，不少单位已可开展前两种技术。差减杂交法可有效地富集未知目的基因的表达片段，但它是一项十分耗时费力的工作，而且存在着诸如需要大量的RNA为出发材料，实验步骤繁琐以及难以检测低丰度的mRNA等缺点，因此难以推广。1992年Liang Peng与Pardee在差减杂交基础上建立的差异显示技术，以RNA用量少、操作简便快捷和灵敏度高、重复性好等优点，使以上问题的解决有了突破性进展，随即被广泛应用。
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差异显示技术是在转录水平上研究基因表达差异的有效方法。它通过一系列的锚定引物与随机引物组合把不同种细胞(如正常和转化细胞)的mRNA进行分组反转录，用PCR方法扩增cDNA，用序列凝胶电泳法显示出扩增结果，比较正常的和异常的cDNA带，从而找出差异表达的基因。差异显示技术建立至今仅6年时间，便在分析基因表达差异、绘制遗传图谱、分离特异性表达基因、临床遗传疾病的诊断等方面得到广泛的应用，并不断得到改正和完善。我国学者在最近开始将这一技术应用于毒理学和环境医学领域，取得了一定进展。军事医学科学院李刚、吴德昌等[1]利用mRNA差异显示技术比较了原代大鼠气管上皮细胞(RTE)与α-粒子诱发的恶性转化RTE细胞之间基因表达的差异状况，共观察到近80个差异表达基因片段，排除假阳性片段后，对15个差异表达基因片段进行了克隆、测序。共向Gene Bank登录7条新基因序列，为探讨α-粒子辐射致癌机理和危险度评估提供了重要资料；北京医科大学鲁民风、刘霜等[2]对黑色氧化镍(Ni\-2O\-3)染毒后形态转化的人胚肺细胞用mRNA差异显示技术进行测序和同源性分析，表明差异片段与Cyclophilin(一种与程序性细胞死亡时大片段DNA断裂有关的基因)mRNA的329-795碱基序列同源；浙江医科大学胡文蔚等[3]也应用这一技术观察了烷化剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)处理的猴肾Vero细胞的差异表达情况，发现MNNG单独或合并环已亚胺(CHM)处理可诱导参与信号传导的基因表达发生改变而影响信息传递。预防医学科学院刘秉慈目前正在进行着“粉尘诱导的肺纤维化及癌变的基因差异显示研究”的国家自然科学基金课题，这将为阐明粉尘诱癌机理和我国差异显示技术的发展起推进作用。
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2 单细胞凝胶电泳
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis SCGE)又称彗星试验(Comet assay)，是近年来广泛开展的一项新的有核细胞DNA损害的检测方法。1984年首先由Ostling和Johanson建立，最初是在中性电泳条件下检测DNA双链断，随后Sigh等(1988年)对实验条件进行了改良，利用碱性条件溶解分散于琼脂糖凝胶中的细胞然后进行电泳，使DNA双螺旋变性解链后释放出断裂的碎片在电场中向阳极泳动，形成头向阳极尾向阴极的彗星样影像，大大提高了检测DNA损害的敏感性，从而使该方法展示出强大生命力。由于该方法具有敏感，简便，快速、低耗，重复性好等独特优点，并可直接观察单个细胞内的DNA损害，因而迅速成为近年最流行的DNA损害检测方法而应用于遗传毒理学、辐射生物学、肿瘤学、老年学、病理学、环境生态学以及环境与职业人群的生物监测。迄今全世界共约300余篇论文发表，内容涉及各种物理(UV、X射线、γ辐射等)，化学因素(环境污染物、致癌物、化学药物、职业中毒等)和生物学因素共50种；所研究的细胞类型30余种。国内从1995年开始有文献报告，迄今已发表近40余篇文献。
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笔者所在实验室近3年来陆续利用单细胞电泳技术观察了镍、铬、镉、石棉、三氯乙烯、苯、甲基叔丁醚、甲醛、H2O2对人外周血淋巴细胞和人胚肺成纤维细胞DNA损害，并对石棉、三氯乙烯和苯作业工人进行监测[4～13]。最近，又在此基础上建立了检测DNA交联和DNA蛋白交联的方法[6，12，13]，该方法的原理是基于DNA与DNA分子或DNA与蛋白质分子的交互联结，在电泳过程中必将阻止DNA的泳动。通过使用标准化的随机分布的DNA断裂剂如甲基甲磺酸(MMS)、X-射线或γ-射线处理的细胞使之产生特异的DNA链断裂，则可产生标准化的特定长度的彗星影像，在交联剂存在时，由这些标准断裂剂形成的彗星长度将大大缩短。为了进一步确定DNA-蛋白质交联的形成，还可以加入高浓度的蛋白酶K到凝胶上以去除与DNA交联着的蛋白质。通过与不加蛋白酶K的凝胶比较，从而确定这种交联对DNA迁移率的影响。我们实验室最近已利用改良的单细胞凝胶电泳技术观察了甲醛、镉、镍和顺铂引起的人外周血淋巴细胞DNA交联和DNA-蛋白质交联，并与碱洗脱方法进行比较，证实了这种方法是检测交联剂对DNA损害作用的有效方法，并进一步开展了整体动物和人群的研究，使单细胞凝胶电泳成为可检测多类型DNA损害的有效方法。同济医科大学劳动卫生教研室[14，15，16]和环境卫生教研室[17，18]分别开展了高温、CO和粉尘联合作用和硒、苯引起DNA损伤的检测；北京医科大学劳动卫生教研室[19，20]观察了吸烟与温石棉联合作用对人胚肺细胞和人造矿物纤维对A549细胞DNA的断裂效应。华西医科大学衡正昌、张遵真等[21]开展了二氯胺基酚对V79细胞DNA损伤效应的研究。山西大学、西安医科大学和上海医科大学等单位也陆续在毒理学领域引进单细胞凝胶电泳技术。
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3 穿梭质粒在突变检测中的应用
穿梭质粒是一类既可在哺乳动物细胞中复制，又可在细菌细胞内增殖的特殊的复合型质粒，由病毒基因组的部分序列(启动子、增强子、复制与转录起点等)，质粒的部分序列(复制起始点及抗性基因等)、靶基因和选择基因构建而成。近几年来，以SV40病毒为基础，以大肠杆菌tRNA琥珀突变抑制基因SupF为突变靶基因的短暂复制型穿梭质粒已广泛应用各种诱变剂在哺乳动物细胞内的突变研究，其中最有代表性的是美国学者Seidman构建的PZ189质粒。将诱变剂处理的穿梭质粒转染哺乳动物细胞，或先转染后再用诱变剂处理，经复制形成突变后，从细胞提取质粒，转化宿主菌，在X-Gal和IPTG琼脂平板上筛选突变子，正常菌落为蓝色，若靶基因SupF由于诱变制作用而失活，则呈白色，并可进一步对靶基因直接测序以了解突变的位点、类型、序列特异性等信息。最近作者又进一步对该质粒进行了改进，在靶基因下游紧邻处加一个8bp的标识序列(Signature Sequence)，构建了PSP189质粒。诱变剂处理后，同时测定靶基因和标识序列，根据标识序列的改变情况可判断并区分独立突变或同胞突变，能更精确地在DNA分子水平上评价突变的性质和热点。由于穿梭质粒能够在细胞与哺乳动物细胞中间“穿梭”，靶基因的突变又是在哺乳动物细胞内发生，因而能够较真实反映高等哺乳动物的突变机理。同时SupF靶基因的突变很容易在细菌中通过显色反应筛选突变子并进行序列分析，使表型改变在DNA分子水平上得到证明，且其任何一位置发生单碱基置换都能从表型改变检测出来，敏感性极高。利用穿梭质粒研究基因突变始于80年代，迄今全世界已有数百篇文献报告，包括了放射线、重金属、环境诱变剂和致癌物引起的基因突变。我国最近开始引进了PZ189和PS189两种质粒，如浙江医学大学冯朝辉、张小山等[22～24]利用PZ189质粒观察了烷化剂N-甲基-N-硝基-亚硝基胍(MNNG)引起的细胞定标性和非定标性突变；华西医科大学范奇元等[25]研究了乙基甲磺酸对PZ189穿梭质粒的诱变作用；卫生部食品卫生监督检验所谈幸之等[26，27]利用PSP189研究了黄曲霉毒素致突变机理；北京市劳动卫生职业病研究所崔明珍等[28]观察了稀土化合物对MNNG致穿梭质粒PSP189突变的影响，我们最近也观察了在核蛋白对镍致PZ189质粒突变的影响，表明核蛋白对镍引起的突变有促进作用。
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4 转基因动物和转基因细胞
转基因动物是当今生物高科技中的一个研究热点，随着重组DNA技术的迅速发展，转基因动物技术的研究与应用都得到许多开创性的进展。转基因动物是指通过基因重组和导入等各种手段，使体内基因组中整合有外源性基因的动物，这些外源基因可以是标志基因(如neo基因、TK基因)，也可以是某些疾病相关的基因或代表毒性终点的基因。在毒理学领域，转基因动物主要用于化学毒物致突变和出生缺陷的机理的研究，其主要特点是：可从整体水平比较不同器官突变的组织特异性，从而确定敏感的靶器官，并在同一动物进行多种突变终点的比较研究；易于从动物基因组中回收导入的基因以进行突变的精细研究(如测序、测定突变谱、研究突变热点等)；敏感性高，可在低剂量下检测，特别适宜于观察慢性低水平接触时的DNA损伤。
近年来，国外已陆续发展了多种用于突变检测的转基因动物，其中三种已投入商品化生产，MutaTM小鼠；Big BlueTM大鼠和Xenomouse小鼠，它们分别采用大肠杆菌乳糖操纵子的lac Z和/或lac I作为诱变的靶基因。国外已开展对丙烯酰胺、1.3-丁二烯、环磷酰胺、乙基亚硝基脲等数十种遗传毒物基因突变的分析，表明该试验重现性好，与内源性基因一致。1995年第七届国际毒理学术会议提出：转基因小鼠的致突变试验有可能取代两年的长期动物致癌试验。我国转基因动物的研究起步较晚，最近，第二军医大学黄建等建立了以穿梭质粒pEsnx为目的质粒，携带xylE基因为诱变靶基因的转基因小鼠，并证明了目的质粒已完整整合于小鼠染色体上，可稳定遗传给后代[29]。随后，又进行了体内基因突变的检测。作者用致突变剂n-甲基-n′-硝基-n-亚硝基胍(MNNG)对转基因小鼠(ip 10 mg/kg)连续染毒4天发现，MNNG使外周血NCE的微核率从(2.20±1.48)‰上升为(6.80±2.28)‰，xylE基因突变率从小于1/22843增至3/18641，序列分析显示这种突变主要是单个碱基缺失，其中以A/C缺失最多见。表明xylE转基因小鼠是检测体内基因突变的有效模型[30]。我国旅美学者刘杰[31，32]和康裕建等[33]分别利用金属硫蛋白转基因和基因删除动物研究镉毒性和阿霉素的心脏毒性，均获得满意的结果。
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转基因细胞可以看成转基因动物的缩影，美国纽约大学Klein通过遗传工程方法，将大肠杆菌(E.Coli)的黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt)插入到V79细胞染色体而建立了G12转基因细胞，该细胞株已经由林慰慈教授引进我国[34]，并陆续开展了一些工作，用于观察细胞基因突变，姐妹染色单体交换和微核。北京医科大学贾光等[35]用G12细胞研究六价铬对gpt位点的影响，结果表明在细胞中毒不明显的情况下，即可诱发gpt位点的突变。上海劳研所顾祖维[36]用这种细胞对柴油机废气颗粒进行多种遗传毒性的终点检测，认为其敏感性高。浙江医科大学病理生理教研室[37，38]近年来陆续建立了稳定表达Cyt P450的转基因细胞株CHL-1A1，2B6和好3A4，对前诱变物/致癌物具有代谢活化能力，因此在体外试验中可免加外源性代谢活化系统，具有重要应用价值。第二军医大学徐唯等[39]观察了亚硝基胍对含xylE基因的pESnx/FL穿梭质粒克隆细胞的致突变作用。
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5 荧光原位杂交技术
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是80年代在原位杂交基础上建立起来的一种分子杂交技术。是一种高度灵敏和特异性以及分辨率强的染色体和基因分析技术，它通过荧光标记的各类DNA和RNA探针与细胞或组织在玻片上进行杂交，在不改变其结构和分布格局的情况下，进行细胞内DNA、RNA某特定序列的相互位置关系的拷贝数的测定，用于染色体识别，基因定位和基因诊断、染色体结构和数目畸变分析。FISH方法的优点在于：①荧光试剂和探针标记经济，相对安全，同时在特异性、速度、探针的稳定性方面优于放射性探针杂交；②可分析中期和间期核，灵敏度高，目前，可用FISH定位的DNA序列从1kd发展到整条染色体范围；③所用的探针，对基因组不同部分可用不同颜色标记，特别是90年代发展起来的多色FISH技术，可在同一细胞核或中期染色体中显示出不同的颜色，从而可同时检测两种以上DNA的三维结构，制备出染色体的光谱核型，使全染色体的自动化分析真正得以实现。FISH主要用于以下几个方面：①通过全染色体图谱测定中期相染色体畸变；②用亚染色体区带探针进行间期染色体断裂和非整倍体分析；③用着丝点探针或抗着丝点抗体进行微核试验；④非整倍体和异常数量的特定染色体分析。
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中山医科大学郑履康等[40，41]用生物素标记的α-卫星X染色体特异的DNA探针对接触CS2工人的精子DNA进行FISH分析，发现接触工人X染色体双体率明显高于正常人，随后，刘胜勤等[42]又利用生物素标记的X染色体特异性DNA探针DXZ1和地高辛标记的Y染色体特异的DNA探针DYZ3进行双色FISH，以检测苯接触工人精子染色体的畸变率，发现接触组XX率明显高于对照组。第三军医大学曹佳等和胡斌等[43，44，45]用小鼠着丝粒卫星DNA探针FISH和抗着丝粒抗体间接免疫荧光染色技术(又称CREST染色)，研究了丙烯酰胺，昆明山海棠，甲基丙烯酸，环氧丙酯和氢醌等几种物质诱导小鼠NIH3T3成纤维细胞微核和着丝粒组成比例，以对微核来源进行判断，证明了这两种方法均可用于微核的染色体组成的鉴定。华西医科大学张立富等[46]使用小鼠11号染色体和3号染色体特异性DNA探针，分析了自发和化学物诱导的三氟胸苷抗性L5178Y突变细胞集落。结果表明，突变集落有明显的11号染色体异常，主要涉及远端胸苷激酶(TK)基因定位区域。上海医科大学邵建华等[47]用两种不同染色体特异性DNA探针研究苯代谢产物氢醌、苯三酚及二者联合作用诱发人淋巴细胞多倍体形成。
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6 流式细胞计技术
流式细胞计技术(flow cytometry)是对单个细胞或其他生物微粒进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包含在液流中处理过的细胞逐个通过聚集的光源，进而用各种光敏元件测量这些细胞的散射光、荧光等参数而达到测定其化学性质，物理性质和生物学特性等目的，并根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群。目前我国已开展的项目有细胞成分的测量。如DNA、RNA、蛋白质、胞浆内Ca2+,pH等；细胞增殖周期定量分析，DNA倍体测定，染色体核型分析；细胞表面抗原的检查。近年来，随着单克隆抗体技术的发展和分子探针的开发，一些细胞周期特异性(增殖相关)抗原或癌基因产物的单克隆抗体使得流式细胞技术可在一个杂合的细胞群体中检测一完整细胞的特定基因表达，而成为研究化学毒物对细胞损害和化学致癌的重要工具。流式细胞仪多功能的特点允许它可以同步地探讨单个活细胞在细胞水平与分子水平的变化，这种功能是当今任何其它仪器或实验手段都有无法比拟的。北京医科大学王红兵等[48]观察了微藻毒素、佛波酯及苯巴比妥钠对BALB/C3T3细胞周期的影响，表明三种非遗传毒性致癌物均可不同程度地诱发S期细胞比例增加，并呈一定剂量-反应关系；白求恩医科大学李修义等[49]和李景舜等[50]分别观察了甲基汞对小鼠胸腺、脾细胞和卵巢细胞细胞周期的影响；北京医科大学王起恩等[51]在研究香烟烟雾与石棉联合作用时，应用流式细胞仪技术观察了ras癌基因产物P21蛋白质的表达，发现石棉可使C-Hi-ras mRNA水平和P21表达呈协同增加；同济医科大学汤平涛等[52]流式细胞仪技术研究高温，烟碱及其联合作用对大鼠肝细胞HSP70表达。李连秀[53]对*****染毒小鼠睾丸进行流式细胞DNA分析，发现不同剂量TNT染毒组单倍体细胞DNA含量显著低于对照组而二倍体细胞DNA含量均显著高于对照组，表明TNT染毒主要对减数分裂的次数精母细胞发育有影响。
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(收稿：1999-08-04), 百拇医药
单位：庄志雄(深圳市卫生防疫站 (518020))
关键词：差异显示；穿梭质粒；转基因动物；荧光原位杂交；流式细胞技术
卫生毒理学杂志000403 摘要 近年来，随着一些先进的细胞和分子生物学技术的引进与建立，我国毒理学研究整体水平得以大大的提高。现介绍几种我国已开展的细胞和分子生物学新技术的原理及其在毒理学领域中的应用，包括：差异显示技术、单细胞凝胶电泳技术、穿梭质粒pZ189和pSp189转染技术、转基因动物和转基因细胞、荧光原位杂交和流式细胞技术。这些技术具有终点明确，敏感性高等特点，在检测各种不同类型的DNA损伤和基因突变，以及研究细胞毒性和致癌的分子机理方面具有重要的价值。
Application of new technology on cellular and molecular biology to toxicological research in China
, 百拇医药
ZHUANG Zhi-Xiong
(Shenzhen Health and Anti-epidemic Station 518020)
ABSTRACT Following introduction and establishment of some advanced technologies on cellular and molecular biology,the overall level of toxicological research in China has been greatly improved in recent years.Both principle and toxicological application of new technologies on cellular and molecular biology,including differential display,single cell gel electrophoresis(comet assay),shuttle plasmid(pZ189 and pSp189) transfection,transgene animals and cells,fluorescence in situ hybridization (FISH)and flow cytometry,developed and carried out in China were reviewed.These technologies are characterized with clear endpoints and higher sensitivities,They are very important values in both detecting various types of DNA damages and gene mutations and exploring the molecular mechanisms of cellular toxicity and carcinogenesis.
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KEY WORDS Differential display;Shuttle plasmid;Transgene animal;Fluorescence in situ hybridization;Flow cytometry;
近20年来，毒理学领域发生前所未有的巨大进展，而这些进展的取得，在很大程度上得益于科学新思想的渗透和新技术的应用。特别是细胞生物学和分子生物学理论和技术的飞速发展，赋予毒理学工作者新的启迪和工具，从而改变了毒理学研究的基本格局，真正实现了从整体和器官水平向细胞和分子水平的飞跃。1993年3月，美国著名的科学专栏评论家Marshall在“Science”杂志上以显要的位置发表了题为“毒理学进入分子水平”(Toxicology goes molecular)的专论，指出“一批新的毒理学家正在应用超敏感的探针检测细胞水平的毒效应，并制订出预防接触这些毒物的措施”(A new bread of toxicologists is using ultrasensitive probes to discern toxic effects at the cellular level and working on preventive measures for those exposed)。中国毒理学会理事长吴德昌院士在中国毒理学会第二届学术会议(1997，5，西安)所作的“迎接21世纪的中国毒理学”报告中强调，随着医学科学的发展，毒理学也已经和正在发生着巨大的进展和变化，其中最重要的变化是“分子生物学理论和技术的引入，由于癌基因、抑癌基因、外源物受体删除模型及其他相关领域的重大发现与进展，使得人们对外源物致癌机理及生物学的理解有很大的提高，在研究方法中基因引入技术令人瞩目，可以此来深入研究DNA所引起的毒理学作用”。纵观我国毒理学的发展历程，一些常用的细胞与分子生物学技术，如：基因重组和克隆技术、核酸杂交技术、PCR技术、DNA测序技术以及一系列突变检测技术已广泛应用于外来化学物和环境致癌物引起的DNA损害、基因突变、加合物形成、基因多态、癌基因和抑癌基因的检测，数量逐年增加。特别是近年来，一些新的细胞与分子生物学技术的引进与建立，大大提高了毒理学研究的整体水平。现着重对我国近年来新开展的几项细胞与分子生物学技术的原理及其在毒理学领域的应用进行评述。
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1 差异显示技术
分子生物学的许多技术如Southern和Northern印迹技术、PCR技术和原位杂交技术等，都赖以应用特定的探针或引物才可测知基因的改变和表达的情况，而某一基因的探针或引物常须在该基因已被克隆和了解之后才能获得。由于各种化学毒物和环境危害因素引起的基因改变或新基因的出现大多是未知的。未知新基因的探查、分离和克隆是一项非常重要和具有创造性的工作，常用方法有差减杂交法(Subtraction hybridization)，差异显示法(Differential display)和染色体步移法(Cromosome walking)。这些方法各有其优缺点，要求条件难易程度不同。在我国现有实验条件下，不少单位已可开展前两种技术。差减杂交法可有效地富集未知目的基因的表达片段，但它是一项十分耗时费力的工作，而且存在着诸如需要大量的RNA为出发材料，实验步骤繁琐以及难以检测低丰度的mRNA等缺点，因此难以推广。1992年Liang Peng与Pardee在差减杂交基础上建立的差异显示技术，以RNA用量少、操作简便快捷和灵敏度高、重复性好等优点，使以上问题的解决有了突破性进展，随即被广泛应用。
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差异显示技术是在转录水平上研究基因表达差异的有效方法。它通过一系列的锚定引物与随机引物组合把不同种细胞(如正常和转化细胞)的mRNA进行分组反转录，用PCR方法扩增cDNA，用序列凝胶电泳法显示出扩增结果，比较正常的和异常的cDNA带，从而找出差异表达的基因。差异显示技术建立至今仅6年时间，便在分析基因表达差异、绘制遗传图谱、分离特异性表达基因、临床遗传疾病的诊断等方面得到广泛的应用，并不断得到改正和完善。我国学者在最近开始将这一技术应用于毒理学和环境医学领域，取得了一定进展。军事医学科学院李刚、吴德昌等[1]利用mRNA差异显示技术比较了原代大鼠气管上皮细胞(RTE)与α-粒子诱发的恶性转化RTE细胞之间基因表达的差异状况，共观察到近80个差异表达基因片段，排除假阳性片段后，对15个差异表达基因片段进行了克隆、测序。共向Gene Bank登录7条新基因序列，为探讨α-粒子辐射致癌机理和危险度评估提供了重要资料；北京医科大学鲁民风、刘霜等[2]对黑色氧化镍(Ni\-2O\-3)染毒后形态转化的人胚肺细胞用mRNA差异显示技术进行测序和同源性分析，表明差异片段与Cyclophilin(一种与程序性细胞死亡时大片段DNA断裂有关的基因)mRNA的329-795碱基序列同源；浙江医科大学胡文蔚等[3]也应用这一技术观察了烷化剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)处理的猴肾Vero细胞的差异表达情况，发现MNNG单独或合并环已亚胺(CHM)处理可诱导参与信号传导的基因表达发生改变而影响信息传递。预防医学科学院刘秉慈目前正在进行着“粉尘诱导的肺纤维化及癌变的基因差异显示研究”的国家自然科学基金课题，这将为阐明粉尘诱癌机理和我国差异显示技术的发展起推进作用。
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2 单细胞凝胶电泳
单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis SCGE)又称彗星试验(Comet assay)，是近年来广泛开展的一项新的有核细胞DNA损害的检测方法。1984年首先由Ostling和Johanson建立，最初是在中性电泳条件下检测DNA双链断，随后Sigh等(1988年)对实验条件进行了改良，利用碱性条件溶解分散于琼脂糖凝胶中的细胞然后进行电泳，使DNA双螺旋变性解链后释放出断裂的碎片在电场中向阳极泳动，形成头向阳极尾向阴极的彗星样影像，大大提高了检测DNA损害的敏感性，从而使该方法展示出强大生命力。由于该方法具有敏感，简便，快速、低耗，重复性好等独特优点，并可直接观察单个细胞内的DNA损害，因而迅速成为近年最流行的DNA损害检测方法而应用于遗传毒理学、辐射生物学、肿瘤学、老年学、病理学、环境生态学以及环境与职业人群的生物监测。迄今全世界共约300余篇论文发表，内容涉及各种物理(UV、X射线、γ辐射等)，化学因素(环境污染物、致癌物、化学药物、职业中毒等)和生物学因素共50种；所研究的细胞类型30余种。国内从1995年开始有文献报告，迄今已发表近40余篇文献。
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笔者所在实验室近3年来陆续利用单细胞电泳技术观察了镍、铬、镉、石棉、三氯乙烯、苯、甲基叔丁醚、甲醛、H2O2对人外周血淋巴细胞和人胚肺成纤维细胞DNA损害，并对石棉、三氯乙烯和苯作业工人进行监测[4～13]。最近，又在此基础上建立了检测DNA交联和DNA蛋白交联的方法[6，12，13]，该方法的原理是基于DNA与DNA分子或DNA与蛋白质分子的交互联结，在电泳过程中必将阻止DNA的泳动。通过使用标准化的随机分布的DNA断裂剂如甲基甲磺酸(MMS)、X-射线或γ-射线处理的细胞使之产生特异的DNA链断裂，则可产生标准化的特定长度的彗星影像，在交联剂存在时，由这些标准断裂剂形成的彗星长度将大大缩短。为了进一步确定DNA-蛋白质交联的形成，还可以加入高浓度的蛋白酶K到凝胶上以去除与DNA交联着的蛋白质。通过与不加蛋白酶K的凝胶比较，从而确定这种交联对DNA迁移率的影响。我们实验室最近已利用改良的单细胞凝胶电泳技术观察了甲醛、镉、镍和顺铂引起的人外周血淋巴细胞DNA交联和DNA-蛋白质交联，并与碱洗脱方法进行比较，证实了这种方法是检测交联剂对DNA损害作用的有效方法，并进一步开展了整体动物和人群的研究，使单细胞凝胶电泳成为可检测多类型DNA损害的有效方法。同济医科大学劳动卫生教研室[14，15，16]和环境卫生教研室[17，18]分别开展了高温、CO和粉尘联合作用和硒、苯引起DNA损伤的检测；北京医科大学劳动卫生教研室[19，20]观察了吸烟与温石棉联合作用对人胚肺细胞和人造矿物纤维对A549细胞DNA的断裂效应。华西医科大学衡正昌、张遵真等[21]开展了二氯胺基酚对V79细胞DNA损伤效应的研究。山西大学、西安医科大学和上海医科大学等单位也陆续在毒理学领域引进单细胞凝胶电泳技术。
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3 穿梭质粒在突变检测中的应用
穿梭质粒是一类既可在哺乳动物细胞中复制，又可在细菌细胞内增殖的特殊的复合型质粒，由病毒基因组的部分序列(启动子、增强子、复制与转录起点等)，质粒的部分序列(复制起始点及抗性基因等)、靶基因和选择基因构建而成。近几年来，以SV40病毒为基础，以大肠杆菌tRNA琥珀突变抑制基因SupF为突变靶基因的短暂复制型穿梭质粒已广泛应用各种诱变剂在哺乳动物细胞内的突变研究，其中最有代表性的是美国学者Seidman构建的PZ189质粒。将诱变剂处理的穿梭质粒转染哺乳动物细胞，或先转染后再用诱变剂处理，经复制形成突变后，从细胞提取质粒，转化宿主菌，在X-Gal和IPTG琼脂平板上筛选突变子，正常菌落为蓝色，若靶基因SupF由于诱变制作用而失活，则呈白色，并可进一步对靶基因直接测序以了解突变的位点、类型、序列特异性等信息。最近作者又进一步对该质粒进行了改进，在靶基因下游紧邻处加一个8bp的标识序列(Signature Sequence)，构建了PSP189质粒。诱变剂处理后，同时测定靶基因和标识序列，根据标识序列的改变情况可判断并区分独立突变或同胞突变，能更精确地在DNA分子水平上评价突变的性质和热点。由于穿梭质粒能够在细胞与哺乳动物细胞中间“穿梭”，靶基因的突变又是在哺乳动物细胞内发生，因而能够较真实反映高等哺乳动物的突变机理。同时SupF靶基因的突变很容易在细菌中通过显色反应筛选突变子并进行序列分析，使表型改变在DNA分子水平上得到证明，且其任何一位置发生单碱基置换都能从表型改变检测出来，敏感性极高。利用穿梭质粒研究基因突变始于80年代，迄今全世界已有数百篇文献报告，包括了放射线、重金属、环境诱变剂和致癌物引起的基因突变。我国最近开始引进了PZ189和PS189两种质粒，如浙江医学大学冯朝辉、张小山等[22～24]利用PZ189质粒观察了烷化剂N-甲基-N-硝基-亚硝基胍(MNNG)引起的细胞定标性和非定标性突变；华西医科大学范奇元等[25]研究了乙基甲磺酸对PZ189穿梭质粒的诱变作用；卫生部食品卫生监督检验所谈幸之等[26，27]利用PSP189研究了黄曲霉毒素致突变机理；北京市劳动卫生职业病研究所崔明珍等[28]观察了稀土化合物对MNNG致穿梭质粒PSP189突变的影响，我们最近也观察了在核蛋白对镍致PZ189质粒突变的影响，表明核蛋白对镍引起的突变有促进作用。
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4 转基因动物和转基因细胞
转基因动物是当今生物高科技中的一个研究热点，随着重组DNA技术的迅速发展，转基因动物技术的研究与应用都得到许多开创性的进展。转基因动物是指通过基因重组和导入等各种手段，使体内基因组中整合有外源性基因的动物，这些外源基因可以是标志基因(如neo基因、TK基因)，也可以是某些疾病相关的基因或代表毒性终点的基因。在毒理学领域，转基因动物主要用于化学毒物致突变和出生缺陷的机理的研究，其主要特点是：可从整体水平比较不同器官突变的组织特异性，从而确定敏感的靶器官，并在同一动物进行多种突变终点的比较研究；易于从动物基因组中回收导入的基因以进行突变的精细研究(如测序、测定突变谱、研究突变热点等)；敏感性高，可在低剂量下检测，特别适宜于观察慢性低水平接触时的DNA损伤。
近年来，国外已陆续发展了多种用于突变检测的转基因动物，其中三种已投入商品化生产，MutaTM小鼠；Big BlueTM大鼠和Xenomouse小鼠，它们分别采用大肠杆菌乳糖操纵子的lac Z和/或lac I作为诱变的靶基因。国外已开展对丙烯酰胺、1.3-丁二烯、环磷酰胺、乙基亚硝基脲等数十种遗传毒物基因突变的分析，表明该试验重现性好，与内源性基因一致。1995年第七届国际毒理学术会议提出：转基因小鼠的致突变试验有可能取代两年的长期动物致癌试验。我国转基因动物的研究起步较晚，最近，第二军医大学黄建等建立了以穿梭质粒pEsnx为目的质粒，携带xylE基因为诱变靶基因的转基因小鼠，并证明了目的质粒已完整整合于小鼠染色体上，可稳定遗传给后代[29]。随后，又进行了体内基因突变的检测。作者用致突变剂n-甲基-n′-硝基-n-亚硝基胍(MNNG)对转基因小鼠(ip 10 mg/kg)连续染毒4天发现，MNNG使外周血NCE的微核率从(2.20±1.48)‰上升为(6.80±2.28)‰，xylE基因突变率从小于1/22843增至3/18641，序列分析显示这种突变主要是单个碱基缺失，其中以A/C缺失最多见。表明xylE转基因小鼠是检测体内基因突变的有效模型[30]。我国旅美学者刘杰[31，32]和康裕建等[33]分别利用金属硫蛋白转基因和基因删除动物研究镉毒性和阿霉素的心脏毒性，均获得满意的结果。
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转基因细胞可以看成转基因动物的缩影，美国纽约大学Klein通过遗传工程方法，将大肠杆菌(E.Coli)的黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因(gpt)插入到V79细胞染色体而建立了G12转基因细胞，该细胞株已经由林慰慈教授引进我国[34]，并陆续开展了一些工作，用于观察细胞基因突变，姐妹染色单体交换和微核。北京医科大学贾光等[35]用G12细胞研究六价铬对gpt位点的影响，结果表明在细胞中毒不明显的情况下，即可诱发gpt位点的突变。上海劳研所顾祖维[36]用这种细胞对柴油机废气颗粒进行多种遗传毒性的终点检测，认为其敏感性高。浙江医科大学病理生理教研室[37，38]近年来陆续建立了稳定表达Cyt P450的转基因细胞株CHL-1A1，2B6和好3A4，对前诱变物/致癌物具有代谢活化能力，因此在体外试验中可免加外源性代谢活化系统，具有重要应用价值。第二军医大学徐唯等[39]观察了亚硝基胍对含xylE基因的pESnx/FL穿梭质粒克隆细胞的致突变作用。
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5 荧光原位杂交技术
荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization,FISH)是80年代在原位杂交基础上建立起来的一种分子杂交技术。是一种高度灵敏和特异性以及分辨率强的染色体和基因分析技术，它通过荧光标记的各类DNA和RNA探针与细胞或组织在玻片上进行杂交，在不改变其结构和分布格局的情况下，进行细胞内DNA、RNA某特定序列的相互位置关系的拷贝数的测定，用于染色体识别，基因定位和基因诊断、染色体结构和数目畸变分析。FISH方法的优点在于：①荧光试剂和探针标记经济，相对安全，同时在特异性、速度、探针的稳定性方面优于放射性探针杂交；②可分析中期和间期核，灵敏度高，目前，可用FISH定位的DNA序列从1kd发展到整条染色体范围；③所用的探针，对基因组不同部分可用不同颜色标记，特别是90年代发展起来的多色FISH技术，可在同一细胞核或中期染色体中显示出不同的颜色，从而可同时检测两种以上DNA的三维结构，制备出染色体的光谱核型，使全染色体的自动化分析真正得以实现。FISH主要用于以下几个方面：①通过全染色体图谱测定中期相染色体畸变；②用亚染色体区带探针进行间期染色体断裂和非整倍体分析；③用着丝点探针或抗着丝点抗体进行微核试验；④非整倍体和异常数量的特定染色体分析。
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中山医科大学郑履康等[40，41]用生物素标记的α-卫星X染色体特异的DNA探针对接触CS2工人的精子DNA进行FISH分析，发现接触工人X染色体双体率明显高于正常人，随后，刘胜勤等[42]又利用生物素标记的X染色体特异性DNA探针DXZ1和地高辛标记的Y染色体特异的DNA探针DYZ3进行双色FISH，以检测苯接触工人精子染色体的畸变率，发现接触组XX率明显高于对照组。第三军医大学曹佳等和胡斌等[43，44，45]用小鼠着丝粒卫星DNA探针FISH和抗着丝粒抗体间接免疫荧光染色技术(又称CREST染色)，研究了丙烯酰胺，昆明山海棠，甲基丙烯酸，环氧丙酯和氢醌等几种物质诱导小鼠NIH3T3成纤维细胞微核和着丝粒组成比例，以对微核来源进行判断，证明了这两种方法均可用于微核的染色体组成的鉴定。华西医科大学张立富等[46]使用小鼠11号染色体和3号染色体特异性DNA探针，分析了自发和化学物诱导的三氟胸苷抗性L5178Y突变细胞集落。结果表明，突变集落有明显的11号染色体异常，主要涉及远端胸苷激酶(TK)基因定位区域。上海医科大学邵建华等[47]用两种不同染色体特异性DNA探针研究苯代谢产物氢醌、苯三酚及二者联合作用诱发人淋巴细胞多倍体形成。
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6 流式细胞计技术
流式细胞计技术(flow cytometry)是对单个细胞或其他生物微粒进行快速定量分析与分选的一门技术。在分析或分选过程中，包含在液流中处理过的细胞逐个通过聚集的光源，进而用各种光敏元件测量这些细胞的散射光、荧光等参数而达到测定其化学性质，物理性质和生物学特性等目的，并根据这些性质分选出高纯度的细胞亚群。目前我国已开展的项目有细胞成分的测量。如DNA、RNA、蛋白质、胞浆内Ca2+,pH等；细胞增殖周期定量分析，DNA倍体测定，染色体核型分析；细胞表面抗原的检查。近年来，随着单克隆抗体技术的发展和分子探针的开发，一些细胞周期特异性(增殖相关)抗原或癌基因产物的单克隆抗体使得流式细胞技术可在一个杂合的细胞群体中检测一完整细胞的特定基因表达，而成为研究化学毒物对细胞损害和化学致癌的重要工具。流式细胞仪多功能的特点允许它可以同步地探讨单个活细胞在细胞水平与分子水平的变化，这种功能是当今任何其它仪器或实验手段都有无法比拟的。北京医科大学王红兵等[48]观察了微藻毒素、佛波酯及苯巴比妥钠对BALB/C3T3细胞周期的影响，表明三种非遗传毒性致癌物均可不同程度地诱发S期细胞比例增加，并呈一定剂量-反应关系；白求恩医科大学李修义等[49]和李景舜等[50]分别观察了甲基汞对小鼠胸腺、脾细胞和卵巢细胞细胞周期的影响；北京医科大学王起恩等[51]在研究香烟烟雾与石棉联合作用时，应用流式细胞仪技术观察了ras癌基因产物P21蛋白质的表达，发现石棉可使C-Hi-ras mRNA水平和P21表达呈协同增加；同济医科大学汤平涛等[52]流式细胞仪技术研究高温，烟碱及其联合作用对大鼠肝细胞HSP70表达。李连秀[53]对*****染毒小鼠睾丸进行流式细胞DNA分析，发现不同剂量TNT染毒组单倍体细胞DNA含量显著低于对照组而二倍体细胞DNA含量均显著高于对照组，表明TNT染毒主要对减数分裂的次数精母细胞发育有影响。
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(收稿：1999-08-04), 百拇医药