我国遗传毒理学发展的回顾
作者：印木泉 余应年 郑怡文
单位：印木泉(第二军医大学卫生毒理学教研室 (上海 200433))；郑怡文(第二军医大学卫生毒理学教研室 (上海 200433))；余应年(浙江大学医学院病理生理学教研室)
关键词：遗传毒理学；回顾
卫生毒理学杂志000401 摘要 回顾了中国遗传毒理学发展的三个阶段：自70年代末至1983年为启动阶段，建立了一系列遗传毒性检测方法，筛检了大量环境化学物的遗传毒性，以及培训了大量专业人员，成立了中国环境诱变剂学会。自1983～1993年为深入发展的关键阶段。遗传毒性检测方法标准化、规范化，开展遗传毒性机制的研究，遗传毒性试验列入新药、农药、食品、化妆品等安全性评价准则，并成立了中国毒理学会遗传毒理专业委员会。自1993年至今，遗传毒理学进入了分子时代。建立了分子致突变测试系统，例如穿梭质粒载体系统，转基因动物致突变测试系统，以及其他应用分子生物学方法进行突变的分子分析等。开展了基因突变分子机制的研究，在非定标性突变方面取得了显著成就。并且，还回顾了遗传毒理在我国人类环境的现场监测、人群健康监测、遗传毒性与疾病、肿瘤的流行病学调查中的应用。
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Retrospective review of the development of
genetic toxicology in China
YIN Mu-Quan1 YU Ying-Nian2 ZHENG Yi-Wen1
(1.Department of Health Toxicology,Second Military Medical
University,Shanghai 200433
2.Department of Pathophysiology,Medical College of Zhejiang
, http://www.100md.com University)
ABSTRACT Three stages of the development of genetic toxicology in China are retrospectively reviewed in this article.In the initiating stage from late 1970's to 1983 a series of assays for evaluation of genotoxicity were set up and a large number of environmental chemicals had been screened with these assays.Meanwhile,the training of the professional staff and the foundation of Chinese Environmental Mutagen Society were proceeded in this period.During the period of 1983～1993 the assays for evaluation of genotoxicity were standardized and normalized step by step,and finally,a battery of genotoxicity assays were listed in the items of safety evaluation guideline for research on new drugs,pesticides,foods,cosmetics and so on.Studies on mechanism of genotoxicity were carried out with effort.Furthermore,Genetic Toxicology Committee of Chinese Scoiety of Toxicology was founded.Since 1993,genetic toxicology has stepped onto a molecular level.Molecular test systems on mutations such as shuttle vector systems,transgenic animal mutation test systems,and many others which apply molecular bio-assays to analyse mutations at molecular level have been developed in succession.Researches on molecular mechanism of gene mutations are also in process and remarkable achievements have been made in studies on no-ntargeted mutations.Besides,the applications of genetic toxicology in environmental mutagens monitoring in site,human population health monitoring and epidemiologic investigations on correlation between genotoxicity and diseases (e.g.cancers)were also retrospectively reviewed.
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KEY WORDS Genetic toxicology;Retrospective review
遗传毒理学作为一门独立的学科始于1969年。它是研究化学物和辐射等环境因子诱发的致突变效应，以及接触诱变剂后导致人类健康的后果。致突变效应包括诱发DNA损伤和遗传学改变，其范围可从一个或几个DNA碱基对(基因突变)到染色体结构(染色体畸变)或数目(非整倍体或多倍体)的大改变。人类接触诱变剂后，如在生殖细胞中的突变率增加，可引起今后子代的遗传性疾病的发生率增加；如诱发体细胞突变，可引起接触个体的各种异常，最显著的是肿瘤。因此，遗传毒性效应受到毒理学家们的严重关注。30年来，毒理学家的努力集中三个方面：(1)应用测试系统检测诱变剂；(2)研究致突变机制；(3)系统地评价诱变剂的健康危害。
1 概况
我国广泛地开展遗传毒理的研究工作，始于70年代末，20多年来，发展迅速，至今已由少数实验室的开拓性工作，普及到各种相关实验室，已广泛应用于基础医学、临床医学和预防医学的研究中，并列入新药研究、环保监测、农药开发、新化学物质和食品的安全性评价、新型生物材料研制等一切涉及人类健康或安全性评价的规定检测项目。科学研究工作也逐步深入，目前有些工作已与国际同类研究一致。
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20多年来，我国在遗传毒理方面的发展可大致划分为三个阶段：
第一阶段：自70年代末到1983年，当时我国遗传毒理学研究工作尚处于起步阶段，这一时期我们从国外引进了一系列经典的遗传毒性检测方法，逐步在国内建立起相关实验室，展开了这方面的研究工作，并大量过筛了我国人群中所接触的化学物质及其它环境因子的遗传毒性。与此同时，加强对专业人员的培训也是当时学科建设的一个关键所在。许多国外知名的遗传毒理学专家曾被邀请到国内进行指导、交流；同期，国内也有大量的专业人员陆续被派往国外访问、学习，此举有力地推动了学科的进步。1983年中国环境诱变剂学会(CEMS)的成立标志着国内已组织起一支遗传毒理学专业人员的队伍，成为国内及国际间专业学术交流及研究活动的组织者。
第二阶段：自1983～1993年，这是学科全面及深入发展的阶段。遗传毒性的检测方法逐步走向标准化、规范化。同时，对遗传毒性机制的研究也成为科研的一个重点方向。而这一时期具有重大意义的是在我国各种新药、农药、工业化学品、食品、化妆品及消毒剂等的开发研制过程中，遗传毒性试验被正式列入安全性评价准则或测试规范，这不仅反映了本学科的重要价值，也标志着学科研究及应用范围的日益拓展。1993年中国毒理学会遗传毒理专业委员会正式成立，标志着遗传毒理学已成为我国毒理学中的一门分支学科。
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第三阶段：1993年之后至今，遗传毒理学研究进入了一个迅速发展的“分子时代”。随着不同学科之间相互交叉、相互渗透现象的日益普遍，分子生物学也被引入了遗传毒理学研究领域中。国内研究者应用分子生物学的概念和方法建立起了分子致突变测试系统，与此同时，还着眼于分子机制的研究工作。总之，在国内遗传毒理学界同行们的共同努力下，我们与国外在研究水平上的差距正在日益缩短，并且值得骄傲的是国内有一些研究工作，比如：穿梭质粒载体系统、转基因动物突变测试系统、非定标性突变和突变分子机制研究等已达到了国际同类水平。
2 基因突变的分子机制及分子致突变测试系统的研究进展
2.1 分子致突变测试系统的应用
2.1.1 穿梭载体突变检测系统 1983年由穿梭质粒与体外培养的哺乳动物体细胞所组成的突变检测系统首次被用于突变分析，此后的近10余年中，该系统得到了日益广泛的应用，已从最初单纯用于检测化学物质的遗传毒性拓展到目前用以研究各种突变的分子机制。
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复旦大学遗传所薛京伦等人选用恶臭假单孢杆菌(Pseudomnoas putida)TOL质粒上的xylE基因作为诱变指示的靶基因，构建了pFD891 EBV-xylE穿梭质粒。xylE基因编码邻苯二酚氧化酶，该酶可以将无色的邻苯二酚氧化成黄色的2-羟基己酸半缩醛，在含有xylE基因活性的菌落上喷洒邻苯二酚后，菌落迅速显黄色，与无xylE基因活性的白色菌落极易区别。xylE基因的蛋白质编码区仅为0.9kb，且目前已知该基因的核苷酸全序列，因此适于作为诱变分析系统的靶基因。在此基础上，薛京伦等又构建了一对比pFD891更小的携带xylE基因的pESnx1和pESnx2穿梭质粒。pESnx质粒主要有以下几个优点：1.质粒中不含人为的重复序列，因此可以避免由其引起的分子内同源重组；2.同时携带ampr、neor基因，因此对于转化有pESnx质粒的大肠杆菌可采用氨苄青霉毒及新霉素双重抗性选择培养，减少了污染的机会；3.pESnx质粒相对较小，有利于转染哺乳动物细胞及转化大肠杆菌；4.可以利用该质粒上的SV40ori在短期内扩增其拷贝数。用该质粒转染人体羊膜细胞FL后分离得到了稳定的转化细胞株FES1.7，并利用该穿梭质粒载体系统对诱变剂EMS的致突变性进行了初步的分析，结果提示该诱变分析系统简便可靠，有利于推广应用。
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2.1.2 转基因动物突变测试系统 转基因动物致突变检测模型的建立为遗传毒理学研究带来了一次可谓是“革命性”的突破，利用这种检测系统不仅能够在整体动物内研究组织特异性突变，并对突变进行精确的分析，而且可以在同一动物体内进行多个遗传学终点的比较研究。国内在转基因动物方面已开展了大量的研究工作，目前已达到国际同类水平。
第二军医大学卫生毒理学教研室黄建等于1996年采用显微注射法成功地建立了以pESnx穿梭质粒为载体的xylE/ICR转基因小鼠致突变检测模型。该模型建系工作的研究结果表明转入的载体可由转基因小鼠稳定地遗传给后代。在利用该模型检测化学物质的遗传毒性的试验中，诱变剂MNNG、ENU分别诱发了小鼠肝、脾组织中靶基因突变率的明显升高，对突变靶基因进行序列分析，确定了不同化学物质所诱发的突变类型及突变位点。研究结果表明该模型不仅能有效地评估化学物质的遗传毒性，同时又可用于研究致突变作用的分子机理。利用多种化学物质对该模型进行骨髓、外周血微核试验及精子畸形试验的结果还提示了该模型在基因突变、染色体畸变等多遗传学终点研究中的应用前景。
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1998年曹洁等在xylE/ICR模型研究工作的基础上，以携带xylE靶基因的pUC118NX质粒为载体成功地建立了在基因组DNA中整合有完整pUC118NX质粒的C57BL/6J转基因小鼠。用诱变剂ENU可诱发该模型靶基因突变率及外周血、骨髓红细胞微核率的明显上升，初步表明该模型可用于体内基因突变及染色体畸变的研究。
第二军医大学细胞生物学教研室黎怀星等在1996年也以pSPORT1质粒作为载体，建立了D6-2转基因小鼠模型，并对小鼠骨髓组织中靶基因lacI的自发突变率以及甲基磺酸乙酯(EMS)诱发的突变率、突变类型进行了研究。1998年在对pSPORT1质粒作部分改进而建立了pMTR1质粒后，又以该质粒作为载体建立了pMTR1/C57BL/6转基因小鼠品系。
当前，在国内遗传毒理学领域内，对转基因动物致突变检测系统的研究尚处于建立并验证模型的阶段，随着已有模型的不断完善，转基因动物致突变检测系统在致突变、抗突变、生殖毒性及可遗传毒性效应的预测等研究中都将有很广阔的应用前景。
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2.1.3 其它分子突变测试方法的应用 第三军医大学分子毒理实验室曹佳等人选用LacZ基因作为诱变的靶基因，先将受试物作用于裸露的、携带LacZ靶基因的λ噬菌体DNA，然后进行λ噬菌体体外包装，并转染宿主菌，通过计数不同颜色噬菌斑来反映突变率，并进一步对突变噬菌体进行扩增和测序。利用这种分子致突变检测系统可以在检测化学物质致突变性的同时，获得有关突变的DNA分子水平上的信息数据。
国内一些实验室应用了碱性单细胞凝胶电泳(Comet)试验的方法，能够敏感地检测出单个细胞中由于毒性引起的直接DNA损伤，如：单链断裂、碱性不稳定性位点和DNA交联，以及由于与细胞死亡相关的DNA降解而引起的间接DNA损伤。此外，一些其它分子终点的测试系统和分子生物学方法在遗传毒理研究中的应用，正在逐渐展开。例如：应用荧光原位杂交(FISH)、等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法(ASO)、基因特异性扩增(ASA)、PCR单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、异源双链分析(HA)、化学错配碱基裂解法(CMC)、裂解酶切片段长度多态性分析(CFLP)、连接酶链式反应(LCR)、直接测序(DS)等进行突变的分子分析。
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2.2 基因突变分子机制的研究
浙江大学医学院病理生理学教研室余应年等应用一个将突变靶基因与哺乳细胞基因组DNA相分离的实验体系证明化学诱变剂诱发的基因突变可发生在损伤碱基以外的正常序列中，并对其发生机制作了较系统的研究，获得了一些新的分子事件。
2.2.1 化学诱变剂诱发哺乳动物的非定标性突变 张小山等应用携带SupF tRNA基因的穿梭质粒pZ189，转染在24小时前经受半衰期仅1.1小时的烷化剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)攻击的vero细胞，从细胞中回收到的在细胞体内进行过复制的质粒中选出了靶基因SupF tRNA的突变体。试验证明烷化剂MNNG攻击后可在非损伤碱基部位诱发非定标性突变(nontargeted mutation)。
2.2.2 哺乳细胞非定标性突变形成的基因表达依存性 孙雪敏等用vero细胞在MNNG攻击后不同时间转染质粒pZ189,在SupF tRNA基因中非定标性突变的发生频率呈现明显的时相性，并且细胞在MNNG攻击后用RNA合成抑制剂放线菌素D阻断基因转录，非定标性突变形成能够被完全抑制，由此证明MNNG诱发的非定标性突变依存于MNNG处理后的基因表达的改变。
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2.2.3 参与非定标性突变形成的基因的分离 胡文蔚等利用mRNA差异显示技术和反义核酸技术，分离了在MNNG处理后发生表达改变的基因表达序列标识(EST)，并鉴定了2个参与细胞非定标性突变形成有关的cDNA片段，它们的相应基因的表达被阻断后可显著影响非定标性突变的发生，进一步深入研究这些基因的全貌及其产物作用的分子机制对于最终阐明突变的分子机理是有价值的。
2.2.4 哺乳细胞非定标性突变是DNA复制保真度下降所引起的细胞遗传不稳定性的一种表现 细胞非定标性突变发生的时相分析所显示的延迟发生特点和基因表达依存性所显示的后生性机制(epigenetic mechanism)提示：是化学诱变剂诱发细胞遗传不稳定的一种表现。已知细胞DNA复制的高保真度主要由参与复制的DNA聚合酶的校读功能和在复制后进行错配修复的酶系维持。冯朝辉等用定量RT-PCR方法证明细胞经MNNG处理后无校读功能的DNA聚合酶β表达明显升高，由此所引起的DNA复制保真度的降低可能是以非定标性突变为特征的细胞遗传不稳定的发生机制。
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2.2.5 细胞信号转导通路与非定标性突变形成 孙雪敏等在试验中发现可激活信号转导通路的蛋白合成抑制剂放线菌酮不仅不抑制MNNG诱发的非定标性突变反而可促进其发生，这提示非定标性突变的发生有信号转导通路的介入，并且细胞经MNNG处理后早期就有cAMP浓度的升高，说明可能有cAMP-PKA通路的激活。
因此，对诱发剂诱发的以基因非定标性突变为特征的遗传不稳定性的发生机制，可以提出以下假设：化学诱变剂可以引起DNA损伤和非DNA损伤性应激并激活细胞信号转导途径，引起基因表达的改变，从而导致DNA聚合酶酶谱和其它有关改变，并使得DNA复制保真度降低，最终，细胞遗传不稳定将导致基因非定标性突变的形成。另外，在紫外线诱发的细胞反应中也已发现紫外线可引起细胞表面受体的聚簇和应激细胞信号转导通路的激活，因此，受体驱动的突变形成的可能机制是今后遗传毒理学基础研究的一个重要方向。
3 遗传毒理的广泛应用
, 百拇医药 遗传毒理不仅在我国评价各种化学物的安全性方面得到了广泛的应用，并在人类环境的现场监测、人群健康监测以及遗传毒性与疾病、肿瘤的流行病学调查等方面均得到了充分的应用。
应用细胞遗传学的方法，如微核试验、染色体畸变试验、姐妹染色单体互换等，利用植物、昆虫、水生动物等生物的细胞可以现场监测水源、空气及作业环境中遗传毒物的存在。为此，发展了紫露草、蚕豆根尖、鱼的遗传毒性试验方法以及Ames空气现场采样方法等。
人类细胞在遗传毒性评价中也有重要价值，目前可以应用多种人类细胞，如：口腔粘膜细胞、鼻腔粘膜细胞、头皮毛囊细胞、痰液细胞、支气管肺泡灌洗液中的细胞、脱落的结肠细胞、尿道上皮细胞、宫颈上皮细胞、男性生殖细胞及外周血淋巴细胞等检测微核、染色体畸变、姐妹染色单体互换率等指标，对人类接触遗传毒物的剂量及效应进行评价。
此外，逐步建立了一些生物标志物，如：DNA加合物、DNA-蛋白质交联物、非整倍体、DNA链断裂、8-羟基脱氧鸟嘌呤、多腺苷二磷酸-核糖聚合酶等的检测方法，以评价遗传毒性与多种疾病包括心血管疾病、肌肉骨骼疾病、血液病、先天畸形、自身免疫性疾病、线粒体病以及肿瘤、衰老等发生机制的关系。
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同时，还可以利用这些生物标志物，筛检接触诱变剂后可能健康会受到影响的高危人群，进行人群健康监测和流行病学调查。
遗传毒理在我国的发展是迅速的，这仅是作部分回顾，仅此，仍然挂一漏万，但是，在回顾了近20年来国内遗传毒理学界同行们共同努力所取得的成绩后，我们有理由相信，毒理学作为医学的一个学科，在21世纪中必将进一步发挥其特有的作用，在快速发展中迎接大变革的挑战，届时，唯一受到限制的可能只是毒理学家们的想象力和创新意识。
参考文献
1，卢大儒，邱信芳，薛京伦.医学分子遗传学.上海：复旦大学出版社，1998.
2，黄 建，印木泉，陈耀富等.xylE转基因小鼠的突变研究及转基因小鼠致突变检测模型的应用现状.癌变.畸变.突变，1997，9(6)：333-334.
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3，曹 洁，陈建泉，印木泉，等.pUC118NX质粒载体转基因小鼠模型的建立及其用于遗传毒性评价的研究.上海预防医学杂志，1998，10(11)：508.
4，黎怀星，李建秀，杨 桦，等.基于pSPORT1质粒的转基因小鼠家系的建立.第二军医大学学报，1998，19(1)：9-12.
5，吴 涛，曹 佳，钱 频，等.ENU诱导带LacZ靶基因的λgt11 DNA突变分子机理的初步研究.遗传，1999，21(1)：19-22.
6，ZHANG Xiao-Shan,Yu Ying-Nian,CHEN Xing-Ruo,et al.Evidence for nontargeted mutagenesis in a monkey kidney cell line and analysis of its sequence specificity using a shuttle-vector plasmid.Mutat Res,1994,323:105-112.
7，孙雪敏，余应年，陈星若.哺乳类细胞非定标性突变机理的研究.中国公共卫生学报，1999，15(1)：7-8.
8，胡文蔚，余应年，张小山，等.N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍引起vero细胞基因表达改变及有关cDNA片段的初步鉴定。中国药理学与毒理学杂志，1998，12(1)：62-66.
(收稿：1999-07-26), 百拇医药
单位：印木泉(第二军医大学卫生毒理学教研室 (上海 200433))；郑怡文(第二军医大学卫生毒理学教研室 (上海 200433))；余应年(浙江大学医学院病理生理学教研室)
关键词：遗传毒理学；回顾
卫生毒理学杂志000401 摘要 回顾了中国遗传毒理学发展的三个阶段：自70年代末至1983年为启动阶段，建立了一系列遗传毒性检测方法，筛检了大量环境化学物的遗传毒性，以及培训了大量专业人员，成立了中国环境诱变剂学会。自1983～1993年为深入发展的关键阶段。遗传毒性检测方法标准化、规范化，开展遗传毒性机制的研究，遗传毒性试验列入新药、农药、食品、化妆品等安全性评价准则，并成立了中国毒理学会遗传毒理专业委员会。自1993年至今，遗传毒理学进入了分子时代。建立了分子致突变测试系统，例如穿梭质粒载体系统，转基因动物致突变测试系统，以及其他应用分子生物学方法进行突变的分子分析等。开展了基因突变分子机制的研究，在非定标性突变方面取得了显著成就。并且，还回顾了遗传毒理在我国人类环境的现场监测、人群健康监测、遗传毒性与疾病、肿瘤的流行病学调查中的应用。
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Retrospective review of the development of
genetic toxicology in China
YIN Mu-Quan1 YU Ying-Nian2 ZHENG Yi-Wen1
(1.Department of Health Toxicology,Second Military Medical
University,Shanghai 200433
2.Department of Pathophysiology,Medical College of Zhejiang
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ABSTRACT Three stages of the development of genetic toxicology in China are retrospectively reviewed in this article.In the initiating stage from late 1970's to 1983 a series of assays for evaluation of genotoxicity were set up and a large number of environmental chemicals had been screened with these assays.Meanwhile,the training of the professional staff and the foundation of Chinese Environmental Mutagen Society were proceeded in this period.During the period of 1983～1993 the assays for evaluation of genotoxicity were standardized and normalized step by step,and finally,a battery of genotoxicity assays were listed in the items of safety evaluation guideline for research on new drugs,pesticides,foods,cosmetics and so on.Studies on mechanism of genotoxicity were carried out with effort.Furthermore,Genetic Toxicology Committee of Chinese Scoiety of Toxicology was founded.Since 1993,genetic toxicology has stepped onto a molecular level.Molecular test systems on mutations such as shuttle vector systems,transgenic animal mutation test systems,and many others which apply molecular bio-assays to analyse mutations at molecular level have been developed in succession.Researches on molecular mechanism of gene mutations are also in process and remarkable achievements have been made in studies on no-ntargeted mutations.Besides,the applications of genetic toxicology in environmental mutagens monitoring in site,human population health monitoring and epidemiologic investigations on correlation between genotoxicity and diseases (e.g.cancers)were also retrospectively reviewed.
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KEY WORDS Genetic toxicology;Retrospective review
遗传毒理学作为一门独立的学科始于1969年。它是研究化学物和辐射等环境因子诱发的致突变效应，以及接触诱变剂后导致人类健康的后果。致突变效应包括诱发DNA损伤和遗传学改变，其范围可从一个或几个DNA碱基对(基因突变)到染色体结构(染色体畸变)或数目(非整倍体或多倍体)的大改变。人类接触诱变剂后，如在生殖细胞中的突变率增加，可引起今后子代的遗传性疾病的发生率增加；如诱发体细胞突变，可引起接触个体的各种异常，最显著的是肿瘤。因此，遗传毒性效应受到毒理学家们的严重关注。30年来，毒理学家的努力集中三个方面：(1)应用测试系统检测诱变剂；(2)研究致突变机制；(3)系统地评价诱变剂的健康危害。
1 概况
我国广泛地开展遗传毒理的研究工作，始于70年代末，20多年来，发展迅速，至今已由少数实验室的开拓性工作，普及到各种相关实验室，已广泛应用于基础医学、临床医学和预防医学的研究中，并列入新药研究、环保监测、农药开发、新化学物质和食品的安全性评价、新型生物材料研制等一切涉及人类健康或安全性评价的规定检测项目。科学研究工作也逐步深入，目前有些工作已与国际同类研究一致。
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20多年来，我国在遗传毒理方面的发展可大致划分为三个阶段：
第一阶段：自70年代末到1983年，当时我国遗传毒理学研究工作尚处于起步阶段，这一时期我们从国外引进了一系列经典的遗传毒性检测方法，逐步在国内建立起相关实验室，展开了这方面的研究工作，并大量过筛了我国人群中所接触的化学物质及其它环境因子的遗传毒性。与此同时，加强对专业人员的培训也是当时学科建设的一个关键所在。许多国外知名的遗传毒理学专家曾被邀请到国内进行指导、交流；同期，国内也有大量的专业人员陆续被派往国外访问、学习，此举有力地推动了学科的进步。1983年中国环境诱变剂学会(CEMS)的成立标志着国内已组织起一支遗传毒理学专业人员的队伍，成为国内及国际间专业学术交流及研究活动的组织者。
第二阶段：自1983～1993年，这是学科全面及深入发展的阶段。遗传毒性的检测方法逐步走向标准化、规范化。同时，对遗传毒性机制的研究也成为科研的一个重点方向。而这一时期具有重大意义的是在我国各种新药、农药、工业化学品、食品、化妆品及消毒剂等的开发研制过程中，遗传毒性试验被正式列入安全性评价准则或测试规范，这不仅反映了本学科的重要价值，也标志着学科研究及应用范围的日益拓展。1993年中国毒理学会遗传毒理专业委员会正式成立，标志着遗传毒理学已成为我国毒理学中的一门分支学科。
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第三阶段：1993年之后至今，遗传毒理学研究进入了一个迅速发展的“分子时代”。随着不同学科之间相互交叉、相互渗透现象的日益普遍，分子生物学也被引入了遗传毒理学研究领域中。国内研究者应用分子生物学的概念和方法建立起了分子致突变测试系统，与此同时，还着眼于分子机制的研究工作。总之，在国内遗传毒理学界同行们的共同努力下，我们与国外在研究水平上的差距正在日益缩短，并且值得骄傲的是国内有一些研究工作，比如：穿梭质粒载体系统、转基因动物突变测试系统、非定标性突变和突变分子机制研究等已达到了国际同类水平。
2 基因突变的分子机制及分子致突变测试系统的研究进展
2.1 分子致突变测试系统的应用
2.1.1 穿梭载体突变检测系统 1983年由穿梭质粒与体外培养的哺乳动物体细胞所组成的突变检测系统首次被用于突变分析，此后的近10余年中，该系统得到了日益广泛的应用，已从最初单纯用于检测化学物质的遗传毒性拓展到目前用以研究各种突变的分子机制。
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复旦大学遗传所薛京伦等人选用恶臭假单孢杆菌(Pseudomnoas putida)TOL质粒上的xylE基因作为诱变指示的靶基因，构建了pFD891 EBV-xylE穿梭质粒。xylE基因编码邻苯二酚氧化酶，该酶可以将无色的邻苯二酚氧化成黄色的2-羟基己酸半缩醛，在含有xylE基因活性的菌落上喷洒邻苯二酚后，菌落迅速显黄色，与无xylE基因活性的白色菌落极易区别。xylE基因的蛋白质编码区仅为0.9kb，且目前已知该基因的核苷酸全序列，因此适于作为诱变分析系统的靶基因。在此基础上，薛京伦等又构建了一对比pFD891更小的携带xylE基因的pESnx1和pESnx2穿梭质粒。pESnx质粒主要有以下几个优点：1.质粒中不含人为的重复序列，因此可以避免由其引起的分子内同源重组；2.同时携带ampr、neor基因，因此对于转化有pESnx质粒的大肠杆菌可采用氨苄青霉毒及新霉素双重抗性选择培养，减少了污染的机会；3.pESnx质粒相对较小，有利于转染哺乳动物细胞及转化大肠杆菌；4.可以利用该质粒上的SV40ori在短期内扩增其拷贝数。用该质粒转染人体羊膜细胞FL后分离得到了稳定的转化细胞株FES1.7，并利用该穿梭质粒载体系统对诱变剂EMS的致突变性进行了初步的分析，结果提示该诱变分析系统简便可靠，有利于推广应用。
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2.1.2 转基因动物突变测试系统 转基因动物致突变检测模型的建立为遗传毒理学研究带来了一次可谓是“革命性”的突破，利用这种检测系统不仅能够在整体动物内研究组织特异性突变，并对突变进行精确的分析，而且可以在同一动物体内进行多个遗传学终点的比较研究。国内在转基因动物方面已开展了大量的研究工作，目前已达到国际同类水平。
第二军医大学卫生毒理学教研室黄建等于1996年采用显微注射法成功地建立了以pESnx穿梭质粒为载体的xylE/ICR转基因小鼠致突变检测模型。该模型建系工作的研究结果表明转入的载体可由转基因小鼠稳定地遗传给后代。在利用该模型检测化学物质的遗传毒性的试验中，诱变剂MNNG、ENU分别诱发了小鼠肝、脾组织中靶基因突变率的明显升高，对突变靶基因进行序列分析，确定了不同化学物质所诱发的突变类型及突变位点。研究结果表明该模型不仅能有效地评估化学物质的遗传毒性，同时又可用于研究致突变作用的分子机理。利用多种化学物质对该模型进行骨髓、外周血微核试验及精子畸形试验的结果还提示了该模型在基因突变、染色体畸变等多遗传学终点研究中的应用前景。
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1998年曹洁等在xylE/ICR模型研究工作的基础上，以携带xylE靶基因的pUC118NX质粒为载体成功地建立了在基因组DNA中整合有完整pUC118NX质粒的C57BL/6J转基因小鼠。用诱变剂ENU可诱发该模型靶基因突变率及外周血、骨髓红细胞微核率的明显上升，初步表明该模型可用于体内基因突变及染色体畸变的研究。
第二军医大学细胞生物学教研室黎怀星等在1996年也以pSPORT1质粒作为载体，建立了D6-2转基因小鼠模型，并对小鼠骨髓组织中靶基因lacI的自发突变率以及甲基磺酸乙酯(EMS)诱发的突变率、突变类型进行了研究。1998年在对pSPORT1质粒作部分改进而建立了pMTR1质粒后，又以该质粒作为载体建立了pMTR1/C57BL/6转基因小鼠品系。
当前，在国内遗传毒理学领域内，对转基因动物致突变检测系统的研究尚处于建立并验证模型的阶段，随着已有模型的不断完善，转基因动物致突变检测系统在致突变、抗突变、生殖毒性及可遗传毒性效应的预测等研究中都将有很广阔的应用前景。
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2.1.3 其它分子突变测试方法的应用 第三军医大学分子毒理实验室曹佳等人选用LacZ基因作为诱变的靶基因，先将受试物作用于裸露的、携带LacZ靶基因的λ噬菌体DNA，然后进行λ噬菌体体外包装，并转染宿主菌，通过计数不同颜色噬菌斑来反映突变率，并进一步对突变噬菌体进行扩增和测序。利用这种分子致突变检测系统可以在检测化学物质致突变性的同时，获得有关突变的DNA分子水平上的信息数据。
国内一些实验室应用了碱性单细胞凝胶电泳(Comet)试验的方法，能够敏感地检测出单个细胞中由于毒性引起的直接DNA损伤，如：单链断裂、碱性不稳定性位点和DNA交联，以及由于与细胞死亡相关的DNA降解而引起的间接DNA损伤。此外，一些其它分子终点的测试系统和分子生物学方法在遗传毒理研究中的应用，正在逐渐展开。例如：应用荧光原位杂交(FISH)、等位基因特异性寡核苷酸探针杂交法(ASO)、基因特异性扩增(ASA)、PCR单链构象多态性分析(PCR-SSCP)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、异源双链分析(HA)、化学错配碱基裂解法(CMC)、裂解酶切片段长度多态性分析(CFLP)、连接酶链式反应(LCR)、直接测序(DS)等进行突变的分子分析。
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2.2 基因突变分子机制的研究
浙江大学医学院病理生理学教研室余应年等应用一个将突变靶基因与哺乳细胞基因组DNA相分离的实验体系证明化学诱变剂诱发的基因突变可发生在损伤碱基以外的正常序列中，并对其发生机制作了较系统的研究，获得了一些新的分子事件。
2.2.1 化学诱变剂诱发哺乳动物的非定标性突变 张小山等应用携带SupF tRNA基因的穿梭质粒pZ189，转染在24小时前经受半衰期仅1.1小时的烷化剂N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)攻击的vero细胞，从细胞中回收到的在细胞体内进行过复制的质粒中选出了靶基因SupF tRNA的突变体。试验证明烷化剂MNNG攻击后可在非损伤碱基部位诱发非定标性突变(nontargeted mutation)。
2.2.2 哺乳细胞非定标性突变形成的基因表达依存性 孙雪敏等用vero细胞在MNNG攻击后不同时间转染质粒pZ189,在SupF tRNA基因中非定标性突变的发生频率呈现明显的时相性，并且细胞在MNNG攻击后用RNA合成抑制剂放线菌素D阻断基因转录，非定标性突变形成能够被完全抑制，由此证明MNNG诱发的非定标性突变依存于MNNG处理后的基因表达的改变。
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2.2.3 参与非定标性突变形成的基因的分离 胡文蔚等利用mRNA差异显示技术和反义核酸技术，分离了在MNNG处理后发生表达改变的基因表达序列标识(EST)，并鉴定了2个参与细胞非定标性突变形成有关的cDNA片段，它们的相应基因的表达被阻断后可显著影响非定标性突变的发生，进一步深入研究这些基因的全貌及其产物作用的分子机制对于最终阐明突变的分子机理是有价值的。
2.2.4 哺乳细胞非定标性突变是DNA复制保真度下降所引起的细胞遗传不稳定性的一种表现 细胞非定标性突变发生的时相分析所显示的延迟发生特点和基因表达依存性所显示的后生性机制(epigenetic mechanism)提示：是化学诱变剂诱发细胞遗传不稳定的一种表现。已知细胞DNA复制的高保真度主要由参与复制的DNA聚合酶的校读功能和在复制后进行错配修复的酶系维持。冯朝辉等用定量RT-PCR方法证明细胞经MNNG处理后无校读功能的DNA聚合酶β表达明显升高，由此所引起的DNA复制保真度的降低可能是以非定标性突变为特征的细胞遗传不稳定的发生机制。
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2.2.5 细胞信号转导通路与非定标性突变形成 孙雪敏等在试验中发现可激活信号转导通路的蛋白合成抑制剂放线菌酮不仅不抑制MNNG诱发的非定标性突变反而可促进其发生，这提示非定标性突变的发生有信号转导通路的介入，并且细胞经MNNG处理后早期就有cAMP浓度的升高，说明可能有cAMP-PKA通路的激活。
因此，对诱发剂诱发的以基因非定标性突变为特征的遗传不稳定性的发生机制，可以提出以下假设：化学诱变剂可以引起DNA损伤和非DNA损伤性应激并激活细胞信号转导途径，引起基因表达的改变，从而导致DNA聚合酶酶谱和其它有关改变，并使得DNA复制保真度降低，最终，细胞遗传不稳定将导致基因非定标性突变的形成。另外，在紫外线诱发的细胞反应中也已发现紫外线可引起细胞表面受体的聚簇和应激细胞信号转导通路的激活，因此，受体驱动的突变形成的可能机制是今后遗传毒理学基础研究的一个重要方向。
3 遗传毒理的广泛应用
, 百拇医药 遗传毒理不仅在我国评价各种化学物的安全性方面得到了广泛的应用，并在人类环境的现场监测、人群健康监测以及遗传毒性与疾病、肿瘤的流行病学调查等方面均得到了充分的应用。
应用细胞遗传学的方法，如微核试验、染色体畸变试验、姐妹染色单体互换等，利用植物、昆虫、水生动物等生物的细胞可以现场监测水源、空气及作业环境中遗传毒物的存在。为此，发展了紫露草、蚕豆根尖、鱼的遗传毒性试验方法以及Ames空气现场采样方法等。
人类细胞在遗传毒性评价中也有重要价值，目前可以应用多种人类细胞，如：口腔粘膜细胞、鼻腔粘膜细胞、头皮毛囊细胞、痰液细胞、支气管肺泡灌洗液中的细胞、脱落的结肠细胞、尿道上皮细胞、宫颈上皮细胞、男性生殖细胞及外周血淋巴细胞等检测微核、染色体畸变、姐妹染色单体互换率等指标，对人类接触遗传毒物的剂量及效应进行评价。
此外，逐步建立了一些生物标志物，如：DNA加合物、DNA-蛋白质交联物、非整倍体、DNA链断裂、8-羟基脱氧鸟嘌呤、多腺苷二磷酸-核糖聚合酶等的检测方法，以评价遗传毒性与多种疾病包括心血管疾病、肌肉骨骼疾病、血液病、先天畸形、自身免疫性疾病、线粒体病以及肿瘤、衰老等发生机制的关系。
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同时，还可以利用这些生物标志物，筛检接触诱变剂后可能健康会受到影响的高危人群，进行人群健康监测和流行病学调查。
遗传毒理在我国的发展是迅速的，这仅是作部分回顾，仅此，仍然挂一漏万，但是，在回顾了近20年来国内遗传毒理学界同行们共同努力所取得的成绩后，我们有理由相信，毒理学作为医学的一个学科，在21世纪中必将进一步发挥其特有的作用，在快速发展中迎接大变革的挑战，届时，唯一受到限制的可能只是毒理学家们的想象力和创新意识。
参考文献
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2，黄 建，印木泉，陈耀富等.xylE转基因小鼠的突变研究及转基因小鼠致突变检测模型的应用现状.癌变.畸变.突变，1997，9(6)：333-334.
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3，曹 洁，陈建泉，印木泉，等.pUC118NX质粒载体转基因小鼠模型的建立及其用于遗传毒性评价的研究.上海预防医学杂志，1998，10(11)：508.
4，黎怀星，李建秀，杨 桦，等.基于pSPORT1质粒的转基因小鼠家系的建立.第二军医大学学报，1998，19(1)：9-12.
5，吴 涛，曹 佳，钱 频，等.ENU诱导带LacZ靶基因的λgt11 DNA突变分子机理的初步研究.遗传，1999，21(1)：19-22.
6，ZHANG Xiao-Shan,Yu Ying-Nian,CHEN Xing-Ruo,et al.Evidence for nontargeted mutagenesis in a monkey kidney cell line and analysis of its sequence specificity using a shuttle-vector plasmid.Mutat Res,1994,323:105-112.
7，孙雪敏，余应年，陈星若.哺乳类细胞非定标性突变机理的研究.中国公共卫生学报，1999，15(1)：7-8.
8，胡文蔚，余应年，张小山，等.N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍引起vero细胞基因表达改变及有关cDNA片段的初步鉴定。中国药理学与毒理学杂志，1998，12(1)：62-66.
(收稿：1999-07-26), 百拇医药