秋水仙素和环磷酰胺诱发微核的多色荧光原位杂交研究
作者：杨明杰 曹佳
单位：杨明杰(400038 重庆市 第三军医大学预防医学系分子毒理实验室)；曹佳(400038 重庆市 第三军医大学预防医学系分子毒理实验室)
关键词：原位杂交，荧光；秋水仙碱；环磷酰胺；微核
中华预防医学杂志000213 摘 要：目的 分析秋水仙素和环磷酰胺诱导的小鼠骨髓红细胞微核的染色体组成。方法 用着丝粒和端粒DNA探针多色荧光原位杂交检测微核的染色体组成。结果 水仙素诱导的微核83.5%既含着丝粒信号又含端粒信号，环磷酰胺诱导的微核74.5%只含端粒信号。结论 秋水仙素诱导的微核主要由整条染色体组成，环磷酰胺诱导的微核则主要由染色体断片组成。着丝粒和端粒DNA探针多色荧光原位杂交是一种较为精确的分析微核染色体组成的方法。
Studies on micronuclei induced by colchicine and cyclophosphamide using multicolor fluorescence in situ hybridization
, 百拇医药
YANG Mingjie, CAO Jia.
Molecular Toxicology Labortory, Third Military University, Chongqing 400038, China
Abstract：Objective To study chromosomal composition of micronuclei (MN) induced by colchicine (COL) and cyclophosphamide (CP) in mouse bone marrow erythrocytes. Methods Multicolor fluorescence in situ hybridization (FISH) with centromeric and telomeric DNA probes was applied to analyze chromosomal composition of micronuclei induced by COL and CP in mouse bone marrow erythrocytes. Results About 83.5% of COL-induced MN revealed both centromeric and telomeric signals. Of the CP-induced MN, 74.5% showed telomeric signals only. Conclusion Majority of COL-induced MN contain whole chromosome and that of CP-induced MN mainly contain acentric fragments. Multicolor FISH with centormeric and telomeric DNA probes was a precise technique for analyzing chromosomal composition of MN.
, 百拇医药
Key words：In situ hybridization, fluorescence；Colchicine；Cyclophosphamide；Micronucle
微核实验广泛用于环境污染物、化合物的遗传毒性评价，但常规微核实验不能区分开由染色体断裂剂所致的无着丝粒断片或非整倍体毒剂所致的整条染色体丢失形成的微核，定量测定微核面积、C带染色、抗着丝粒抗体染色等方法虽可在一定程度上把两种微核区分开，但效果均不理想。近年国内外研究认为，使用着丝粒DNA探针FISH判断微核的染色体组成是一种比较好的方法，并认为若同时使用着丝粒和端粒DNA探针进行多色荧光原位杂交(multicolor fluorescence in situ hybridization，多色FISH)能更准确地判断微核是由无着丝粒断片还是整条染色体组成[1-3]。我们使用自备的小鼠着丝粒次要卫星DNA探针和端粒DNA探针，通过多色FISH分析了秋水仙素和环磷酰胺诱导的小鼠骨髓红细胞微核的染色体组成，取得了成功。现报道如下。
, 百拇医药
材料与方法
1.秋水仙素(COL，Serva公司)，环磷酰胺(CP，上海第十二制药厂)。
2.探针制备：小鼠次要卫星DNA探针通过扩增含小鼠次要卫星DNA片段的质粒pRP855(加拿大York大学Pearlmann教授惠赠)，收获纯化目的片段后，用随机引物法生物素标记。端粒DNA探针通过合成动物端粒重复序列(TTAGGG)5和(CCCTAA)5，PCR扩增并延长端粒DNA序列，PCR按Ijdo等[4]的方法进行，用随机引物法地高辛标记。探针标记方法按试剂盒(宝灵曼公司)说明书进行。
3.动物分组及染毒：昆明种小鼠12只(第三军医大学实验动物中心)，体重18～24 g，随机分为对照、COL和CP染毒3组，每4只，雌雄各半。分别腹腔注射生理盐水、COL 1.5 mg/kg、CP 50 mg/kg。24 h后脱颈处死动物，收集骨髓细胞。
, 百拇医药
4.制片：中期相染色体制片及用于常规MN检测的细胞滴片按常规方法进行[5]；用于多色FISH检测的制片，参考Schriever-schwemmer[6]的方法进行。
5.常规微核实验：按常规方法进行[5]。
6.多色FISH：按Schriever-schwemmer[6]方法进行。FISH后着丝粒DNA探针用Cy3链霉抗生物蛋白(红色荧光，Sigma公司)检测，端粒DNA探针用FITC地高辛检测系统(黄色荧光，宝灵曼公司)进行2～3轮信号放大并检测，用0.5 μg/ml Hoechst 33258配染(蓝色荧光，Sigma公司)。
7.观察计数：每只动物观察50个微核，合并每组动物所计微核，按微核所含着丝粒和端粒杂交信号分类记录，统计比较不同类型微核的构成百分比。
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8.数据处理：采用卡方检验比较含不同杂交信号微核的构成百分比。
结果
1.探针验证：观察计数5个染色体数为40的中期相染色体上着丝粒和端粒杂交信号分布，验证探针特异性。结果除Y染色体外所有染色体着丝粒都可观察到两个并排的着丝粒杂交信号。71.8%的端粒部位可观察到端粒杂交信号。
2.常规微核实验：COL和CP诱导的微核细胞率均显著高于对照(P<0.01)；3组的骨髓嗜多染红细胞(polychromatic erythrocytes, PCE)与正染红细胞(normochromatic erythrocytes, NCE)比值(PCE/NCE)均为1.0左右，而COL和CP组较对照低(表1)。各组动物含微核NCE的发生率约在0.25‰～0.5‰间。
表1 常规微核实验结果(
±s) 化合物
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MNPCE(‰)
PCE/NCE
对照
1.5±1.9
1.131±0.101
COL
26.8±2.5
0.981±0.059
CP
35.0±1.4
0.786±0.105
MNPCE：含微核嗜多染红细胞；PCE：嗜多染红细胞；NCE：正染红细胞; COL：秋水仙素；CP：环磷酰胺，下同
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3.含不同杂交信号的微核：对照、COL、CP三组相互间微核的杂交信号构成百分比差异非常显著(P<0.01)。COL诱导的微核83.5%既含着丝粒信号又含端粒信号；CP诱导的微核74.5%仅含端粒信号(表2)。表明COL诱导的微核主要由整条染色体组成，CP诱导的微核主要由无着丝断片组成。
表2 含不同杂交信号微核的构成百分比(%，各组计数微核数均为200个) 化合物
C0T0
C0Tn
CnTn
对照
18.0
, 百拇医药
34.0
48.0
COL
6.5
10.0
83.5
CP
10.0
74.5
15.5
C 着丝粒信号；T 端粒信号；脚标O，n=1，2，3...杂交信号数目
4.仅含端粒信号微核的进一步分类：各组只含端粒信号的微核中，仅60%左右含1个端粒信号(表3)，表明只含端粒信号的微核40%左右由2个或2个以上断片组成。
, 百拇医药
表3 只含端粒信号的微核的信号构成百分比(%) 化合物
微核数
C0T1
C0T2
C0T3
C0T>3
对照
68
63.2
29.4
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7.4
COL
20
60.0
30.0
10.0
CP
149
53.0
28.9
11.4
6.7
C0T1 含1个端粒信号微核；C0T2 含2个端粒信号微核；其余类同
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5.含着丝粒信号和端粒信号微核的进一步分类：各组既含着丝粒信号又含端粒信号的微核，80%以上含1个着丝粒信号、1～2个端粒信号或2个着丝粒信号、2～4个端信号，含1个着丝粒信、2个以上端信号或2个着丝粒信号、4个以上端粒信号及其他类型信号组成的微核所占百分比均不足10%(表4)。说明既含着丝粒又含端粒信号的微核主要由1～2条染色体组成，部分可由染色体和无着丝粒断片混合组成，但所占比例较小。
表4 含着丝粒信号和端粒信号的微核的信号构成百分比 化合物
微核数
C1T1-2
C2T2-4
C1T>2
, 百拇医药
C2T>4
其他
对照
96
57.3
26.1
3.1
5.2
8.3
COL
167
51.5
34.1
, 百拇医药
5.4
1.8
7.2
CP
31
58.1
29.0
6.5
0.0
6.4
C1T1-2 含1个着丝粒信号和1-2个端粒信号微核； C1T>2 含1个着丝粒信号和2个以上端粒信号微核；其余类同讨论
, 百拇医药
COL和CP是微核实验常用的阳性对照化合物，但由于实验方法限制，对它们诱导的微核染色体组成的研究尚不深入。定量测定微核面积和DNA含量等物理学统计方法精度差，C带染色、抗着丝粒抗体染色和单纯着丝粒DNA探针FISH等只能检测微核中的着丝粒，不能深入分析由多个无着丝粒断片组成的微核或由染色体和无着丝粒断片混合组成的微核。着丝粒和端粒DNA探针多色FISH，可同时检测微核内着丝粒和端粒的有无及其数目，依此可更准确地判断微核的组成[1]。
目前，检测小鼠着丝粒的DNA探针有小鼠主要卫星DNA探针和次要卫星DNA探针2种，均可检测Y染色体外的着丝粒，有研究认为次要卫星探针更适合于微核检测[4-9]。本研究使用我室自备的次要卫星探针，验证结果表明具有较好的特异性。检测小鼠端粒的DNA探针一般为(TTAGGG)n 6个核苷酸串联重复序列。由于小鼠端粒DNA序列长度变化于20～200 kb之间[10]，所以用端粒探针进行FISH后，有较长序列的端粒杂交信号较为明亮，而较短序列的端粒杂交信号较弱甚至观察不到杂交信号。Miller等在同类研究中使用的端粒探针一般只能检测出约70%的端粒[5]。我们自备的端粒探针可检测出71.8%的端粒。
, 百拇医药
本研究表明COL诱导的微核主要由整条染色体组成，其中57.3%可能由1条染色体组成，26.7%可能由2条染色体组成。说明COL有较强非整倍体毒性，可诱发2条甚至多条染色体丢失形成微核。CP诱导的微核主要由无着丝断片组成，其中53.0%只含1个断片，28.9%含有2个断片，18.1%含3个或3个上断片。说明CP有较强的断裂剂毒性，可诱发多个染色体臂断裂形成微核。
深入分析，发现自发的及由COL和CP诱导的只含端粒信号的微核，都有40%左右的微核由2个甚至多个无着丝粒断片组成，少数既含着丝粒信号又含端粒信号的微核可由染色体和无着丝粒断片混合组成。只有着丝粒和端粒DNA探针多色FISH才能对这些微核的染色体组成进行深入研究。
可以看出，与单纯检测微核着丝粒的方法(如抗着丝粒抗体染色和单纯着丝粒DNA探针FISH)判断微核染色体组成相比，多色FISH有明显优势，但抗着丝粒抗体染色和单纯着丝粒DNA探针FISH相对操作较为简便，也较为经济，加之含着丝粒信号的微核，绝大部分由1条或多条染色体组成，由染色体合并断片组成的微核不多。因此，在单纯区分微核是由染色体断片组成还是由染色体组成来判断化合物是否有非整倍体毒性时，着丝粒探针FISH和抗着丝粒抗体染色已可满足需要。但在需要深入了解微核中染色体和无着丝粒断片的数目、是否有染色体合并无着丝粒断片组成的微核时，多色FISH无疑更佳。在本研究条件下，由于Y染色体着丝粒和部分端粒不能被检测出，因而在准确判断组成MN的染色体或染色体断片数目等方面还存在局限。但随探针、杂交方法和检测手段的改进，这一方法将会更加完善。
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基金项目：国家自然科学基金资助(39400114)
参考文献
[1]曹佳，蔡亚娜. 微核实验中抗着丝粒抗体和DNA探针技术的应用及其意义. 癌变*畸变*突变, 1994, 6(3):43-48.
[2]曹佳，胡斌，程天民，等. 昆明山海棠在微核实验中非整倍体毒性的研究. 遗传，1997，19:1-3.
[3]胡斌，曹佳，程天民，等.丙烯酰胺非整倍体诱发效应的荧光原位杂交和CREST染色的研究. 细胞生物学杂志，1997，19: 83-86.
[4]Ijdo JW, Wells RA，Baldini A, et al. Improved telomere detection using a telomere repeat probe (TTAGGG)n generated by PCR. Nucleic Acids Res, 1991, 19:4780.
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[5]周本正. 实用卫生检测技术大全. 北京:科学出版社,1992.179-182,198-199.
[6]Schreiver -schwemmer G，Adler ID. Differentiation of micronuclei in mouse bone marrow cells: a comparison between CREST staining and fluorescent in situ hybridization with centromeric and telomeric DNA probes. Mutagenesis, 1994，9: 333-340.
[7]Miller BM, Nusse M. Analysis of micronuclei induced by 2-chlorobenzylidene malonitrile (CS) using fluorescence in situ hybidization with telomeric and centromeric DNA probes,and flow cytometry. Mutagenesis, 1993,8:35-41.
, 百拇医药
[8]Kirsch-Volders M, Elhajouji A, Cundari E, et al. The in vitro micronucleus test: a multi-endpoint assay to detect simultaneously mitotic delay, apoptosis, chromosome breskage, chromosome loss and non-disjunction. Mutat Ras, 1997, 392:19-30.
[9]Chen HW, Tomar R, Eastmond DA. Detection of hydroquinone-induced nonrandom breakage in the centromeric heterochromatin of mouse bone marrow cells major and minor satellite probes. Mutat Ras, 1994, 9: 563-569.
[10]Kipling D, Cooke HJ. Hypervariable ultra-long telomeres in mice. Nature, 1990,124:547-559.
收稿日期：1999-02-08, 百拇医药
单位：杨明杰(400038 重庆市 第三军医大学预防医学系分子毒理实验室)；曹佳(400038 重庆市 第三军医大学预防医学系分子毒理实验室)
关键词：原位杂交，荧光；秋水仙碱；环磷酰胺；微核
中华预防医学杂志000213 摘 要：目的 分析秋水仙素和环磷酰胺诱导的小鼠骨髓红细胞微核的染色体组成。方法 用着丝粒和端粒DNA探针多色荧光原位杂交检测微核的染色体组成。结果 水仙素诱导的微核83.5%既含着丝粒信号又含端粒信号，环磷酰胺诱导的微核74.5%只含端粒信号。结论 秋水仙素诱导的微核主要由整条染色体组成，环磷酰胺诱导的微核则主要由染色体断片组成。着丝粒和端粒DNA探针多色荧光原位杂交是一种较为精确的分析微核染色体组成的方法。
Studies on micronuclei induced by colchicine and cyclophosphamide using multicolor fluorescence in situ hybridization
, 百拇医药
YANG Mingjie, CAO Jia.
Molecular Toxicology Labortory, Third Military University, Chongqing 400038, China
Abstract：Objective To study chromosomal composition of micronuclei (MN) induced by colchicine (COL) and cyclophosphamide (CP) in mouse bone marrow erythrocytes. Methods Multicolor fluorescence in situ hybridization (FISH) with centromeric and telomeric DNA probes was applied to analyze chromosomal composition of micronuclei induced by COL and CP in mouse bone marrow erythrocytes. Results About 83.5% of COL-induced MN revealed both centromeric and telomeric signals. Of the CP-induced MN, 74.5% showed telomeric signals only. Conclusion Majority of COL-induced MN contain whole chromosome and that of CP-induced MN mainly contain acentric fragments. Multicolor FISH with centormeric and telomeric DNA probes was a precise technique for analyzing chromosomal composition of MN.
, 百拇医药
Key words：In situ hybridization, fluorescence；Colchicine；Cyclophosphamide；Micronucle
微核实验广泛用于环境污染物、化合物的遗传毒性评价，但常规微核实验不能区分开由染色体断裂剂所致的无着丝粒断片或非整倍体毒剂所致的整条染色体丢失形成的微核，定量测定微核面积、C带染色、抗着丝粒抗体染色等方法虽可在一定程度上把两种微核区分开，但效果均不理想。近年国内外研究认为，使用着丝粒DNA探针FISH判断微核的染色体组成是一种比较好的方法，并认为若同时使用着丝粒和端粒DNA探针进行多色荧光原位杂交(multicolor fluorescence in situ hybridization，多色FISH)能更准确地判断微核是由无着丝粒断片还是整条染色体组成[1-3]。我们使用自备的小鼠着丝粒次要卫星DNA探针和端粒DNA探针，通过多色FISH分析了秋水仙素和环磷酰胺诱导的小鼠骨髓红细胞微核的染色体组成，取得了成功。现报道如下。
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材料与方法
1.秋水仙素(COL，Serva公司)，环磷酰胺(CP，上海第十二制药厂)。
2.探针制备：小鼠次要卫星DNA探针通过扩增含小鼠次要卫星DNA片段的质粒pRP855(加拿大York大学Pearlmann教授惠赠)，收获纯化目的片段后，用随机引物法生物素标记。端粒DNA探针通过合成动物端粒重复序列(TTAGGG)5和(CCCTAA)5，PCR扩增并延长端粒DNA序列，PCR按Ijdo等[4]的方法进行，用随机引物法地高辛标记。探针标记方法按试剂盒(宝灵曼公司)说明书进行。
3.动物分组及染毒：昆明种小鼠12只(第三军医大学实验动物中心)，体重18～24 g，随机分为对照、COL和CP染毒3组，每4只，雌雄各半。分别腹腔注射生理盐水、COL 1.5 mg/kg、CP 50 mg/kg。24 h后脱颈处死动物，收集骨髓细胞。
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4.制片：中期相染色体制片及用于常规MN检测的细胞滴片按常规方法进行[5]；用于多色FISH检测的制片，参考Schriever-schwemmer[6]的方法进行。
5.常规微核实验：按常规方法进行[5]。
6.多色FISH：按Schriever-schwemmer[6]方法进行。FISH后着丝粒DNA探针用Cy3链霉抗生物蛋白(红色荧光，Sigma公司)检测，端粒DNA探针用FITC地高辛检测系统(黄色荧光，宝灵曼公司)进行2～3轮信号放大并检测，用0.5 μg/ml Hoechst 33258配染(蓝色荧光，Sigma公司)。
7.观察计数：每只动物观察50个微核，合并每组动物所计微核，按微核所含着丝粒和端粒杂交信号分类记录，统计比较不同类型微核的构成百分比。
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8.数据处理：采用卡方检验比较含不同杂交信号微核的构成百分比。
结果
1.探针验证：观察计数5个染色体数为40的中期相染色体上着丝粒和端粒杂交信号分布，验证探针特异性。结果除Y染色体外所有染色体着丝粒都可观察到两个并排的着丝粒杂交信号。71.8%的端粒部位可观察到端粒杂交信号。
2.常规微核实验：COL和CP诱导的微核细胞率均显著高于对照(P<0.01)；3组的骨髓嗜多染红细胞(polychromatic erythrocytes, PCE)与正染红细胞(normochromatic erythrocytes, NCE)比值(PCE/NCE)均为1.0左右，而COL和CP组较对照低(表1)。各组动物含微核NCE的发生率约在0.25‰～0.5‰间。
表1 常规微核实验结果(
±s) 化合物, http://www.100md.com
MNPCE(‰)
PCE/NCE
对照
1.5±1.9
1.131±0.101
COL
26.8±2.5
0.981±0.059
CP
35.0±1.4
0.786±0.105
MNPCE：含微核嗜多染红细胞；PCE：嗜多染红细胞；NCE：正染红细胞; COL：秋水仙素；CP：环磷酰胺，下同
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3.含不同杂交信号的微核：对照、COL、CP三组相互间微核的杂交信号构成百分比差异非常显著(P<0.01)。COL诱导的微核83.5%既含着丝粒信号又含端粒信号；CP诱导的微核74.5%仅含端粒信号(表2)。表明COL诱导的微核主要由整条染色体组成，CP诱导的微核主要由无着丝断片组成。
表2 含不同杂交信号微核的构成百分比(%，各组计数微核数均为200个) 化合物
C0T0
C0Tn
CnTn
对照
18.0
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34.0
48.0
COL
6.5
10.0
83.5
CP
10.0
74.5
15.5
C 着丝粒信号；T 端粒信号；脚标O，n=1，2，3...杂交信号数目
4.仅含端粒信号微核的进一步分类：各组只含端粒信号的微核中，仅60%左右含1个端粒信号(表3)，表明只含端粒信号的微核40%左右由2个或2个以上断片组成。
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表3 只含端粒信号的微核的信号构成百分比(%) 化合物
微核数
C0T1
C0T2
C0T3
C0T>3
对照
68
63.2
29.4
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7.4
COL
20
60.0
30.0
10.0
CP
149
53.0
28.9
11.4
6.7
C0T1 含1个端粒信号微核；C0T2 含2个端粒信号微核；其余类同
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5.含着丝粒信号和端粒信号微核的进一步分类：各组既含着丝粒信号又含端粒信号的微核，80%以上含1个着丝粒信号、1～2个端粒信号或2个着丝粒信号、2～4个端信号，含1个着丝粒信、2个以上端信号或2个着丝粒信号、4个以上端粒信号及其他类型信号组成的微核所占百分比均不足10%(表4)。说明既含着丝粒又含端粒信号的微核主要由1～2条染色体组成，部分可由染色体和无着丝粒断片混合组成，但所占比例较小。
表4 含着丝粒信号和端粒信号的微核的信号构成百分比 化合物
微核数
C1T1-2
C2T2-4
C1T>2
, 百拇医药
C2T>4
其他
对照
96
57.3
26.1
3.1
5.2
8.3
COL
167
51.5
34.1
, 百拇医药
5.4
1.8
7.2
CP
31
58.1
29.0
6.5
0.0
6.4
C1T1-2 含1个着丝粒信号和1-2个端粒信号微核； C1T>2 含1个着丝粒信号和2个以上端粒信号微核；其余类同讨论
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COL和CP是微核实验常用的阳性对照化合物，但由于实验方法限制，对它们诱导的微核染色体组成的研究尚不深入。定量测定微核面积和DNA含量等物理学统计方法精度差，C带染色、抗着丝粒抗体染色和单纯着丝粒DNA探针FISH等只能检测微核中的着丝粒，不能深入分析由多个无着丝粒断片组成的微核或由染色体和无着丝粒断片混合组成的微核。着丝粒和端粒DNA探针多色FISH，可同时检测微核内着丝粒和端粒的有无及其数目，依此可更准确地判断微核的组成[1]。
目前，检测小鼠着丝粒的DNA探针有小鼠主要卫星DNA探针和次要卫星DNA探针2种，均可检测Y染色体外的着丝粒，有研究认为次要卫星探针更适合于微核检测[4-9]。本研究使用我室自备的次要卫星探针，验证结果表明具有较好的特异性。检测小鼠端粒的DNA探针一般为(TTAGGG)n 6个核苷酸串联重复序列。由于小鼠端粒DNA序列长度变化于20～200 kb之间[10]，所以用端粒探针进行FISH后，有较长序列的端粒杂交信号较为明亮，而较短序列的端粒杂交信号较弱甚至观察不到杂交信号。Miller等在同类研究中使用的端粒探针一般只能检测出约70%的端粒[5]。我们自备的端粒探针可检测出71.8%的端粒。
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本研究表明COL诱导的微核主要由整条染色体组成，其中57.3%可能由1条染色体组成，26.7%可能由2条染色体组成。说明COL有较强非整倍体毒性，可诱发2条甚至多条染色体丢失形成微核。CP诱导的微核主要由无着丝断片组成，其中53.0%只含1个断片，28.9%含有2个断片，18.1%含3个或3个上断片。说明CP有较强的断裂剂毒性，可诱发多个染色体臂断裂形成微核。
深入分析，发现自发的及由COL和CP诱导的只含端粒信号的微核，都有40%左右的微核由2个甚至多个无着丝粒断片组成，少数既含着丝粒信号又含端粒信号的微核可由染色体和无着丝粒断片混合组成。只有着丝粒和端粒DNA探针多色FISH才能对这些微核的染色体组成进行深入研究。
可以看出，与单纯检测微核着丝粒的方法(如抗着丝粒抗体染色和单纯着丝粒DNA探针FISH)判断微核染色体组成相比，多色FISH有明显优势，但抗着丝粒抗体染色和单纯着丝粒DNA探针FISH相对操作较为简便，也较为经济，加之含着丝粒信号的微核，绝大部分由1条或多条染色体组成，由染色体合并断片组成的微核不多。因此，在单纯区分微核是由染色体断片组成还是由染色体组成来判断化合物是否有非整倍体毒性时，着丝粒探针FISH和抗着丝粒抗体染色已可满足需要。但在需要深入了解微核中染色体和无着丝粒断片的数目、是否有染色体合并无着丝粒断片组成的微核时，多色FISH无疑更佳。在本研究条件下，由于Y染色体着丝粒和部分端粒不能被检测出，因而在准确判断组成MN的染色体或染色体断片数目等方面还存在局限。但随探针、杂交方法和检测手段的改进，这一方法将会更加完善。
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基金项目：国家自然科学基金资助(39400114)
参考文献
[1]曹佳，蔡亚娜. 微核实验中抗着丝粒抗体和DNA探针技术的应用及其意义. 癌变*畸变*突变, 1994, 6(3):43-48.
[2]曹佳，胡斌，程天民，等. 昆明山海棠在微核实验中非整倍体毒性的研究. 遗传，1997，19:1-3.
[3]胡斌，曹佳，程天民，等.丙烯酰胺非整倍体诱发效应的荧光原位杂交和CREST染色的研究. 细胞生物学杂志，1997，19: 83-86.
[4]Ijdo JW, Wells RA，Baldini A, et al. Improved telomere detection using a telomere repeat probe (TTAGGG)n generated by PCR. Nucleic Acids Res, 1991, 19:4780.
, http://www.100md.com
[5]周本正. 实用卫生检测技术大全. 北京:科学出版社,1992.179-182,198-199.
[6]Schreiver -schwemmer G，Adler ID. Differentiation of micronuclei in mouse bone marrow cells: a comparison between CREST staining and fluorescent in situ hybridization with centromeric and telomeric DNA probes. Mutagenesis, 1994，9: 333-340.
[7]Miller BM, Nusse M. Analysis of micronuclei induced by 2-chlorobenzylidene malonitrile (CS) using fluorescence in situ hybidization with telomeric and centromeric DNA probes,and flow cytometry. Mutagenesis, 1993,8:35-41.
, 百拇医药
[8]Kirsch-Volders M, Elhajouji A, Cundari E, et al. The in vitro micronucleus test: a multi-endpoint assay to detect simultaneously mitotic delay, apoptosis, chromosome breskage, chromosome loss and non-disjunction. Mutat Ras, 1997, 392:19-30.
[9]Chen HW, Tomar R, Eastmond DA. Detection of hydroquinone-induced nonrandom breakage in the centromeric heterochromatin of mouse bone marrow cells major and minor satellite probes. Mutat Ras, 1994, 9: 563-569.
[10]Kipling D, Cooke HJ. Hypervariable ultra-long telomeres in mice. Nature, 1990,124:547-559.
收稿日期：1999-02-08, 百拇医药