高碘对豚鼠脑和甲状腺细胞凋亡及调节基因表达的影响
作者：杨长春 尹桂山 崔灵光 朱惠民 左连富
单位：杨长春(050017 石家庄市 河北医科大学生化教研室)；尹桂山(050017 石家庄市 河北医科大学生化教研室)；崔灵光(050017 石家庄市 河北医科大学生化教研室)；朱惠民(公共卫生学院)；左连富(河北省肿瘤研究所)
关键词：碘；脑；甲状腺；脱噬作用；基因表达
中华预防医学杂志000211 摘 要：目的 探讨高碘对脑和甲状腺细胞凋亡及bcl-2、bax基因表达的影响。方法 分别以含碘量为50 μg/L(适碘组)和10 000 μg/L(高碘组)的蒸馏水喂养两个实验组的豚鼠6个月，应用流式细胞术和免疫荧光技术检测豚鼠大脑皮质、海马和甲状腺细胞凋亡率，并对bcl-2、bax基因蛋白表达进行定量检测。结果 高碘组大脑皮质、海马和甲状腺细胞凋亡率明显高于适碘组；高碘组大脑皮质、海马和甲状腺组织bcl-2蛋白表达量较适碘组明显降低,而bax蛋白表达量则明显高于适碘组；高碘组大脑皮质、海马和甲状腺组织bcl-2/bax比值较适碘组明显降低。结论 高碘可以诱发大脑皮质、海马和甲状腺细胞凋亡,bax基因过度表达和bcl-2基因表达下调以及由此引起的bcl-2/bax比值降低可能在高碘诱发脑和甲状腺细胞凋亡过程中起重要作用。
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Effects of excessive iodine on apoptosis and expression of bcl-2、bax genes in the cells of brain and thyroid gland in guinea pigs
YANG Changchun, YIN Guishan, CUI Lingguang, et al.
Department of Biochemistry, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China
Abstract：Objective To investigate the effects of excessive iodine intake on apoptosis and the expression of bcl-2、bax genes in the cells of brain and thyroid gland. Methods Guinea pigs, divided into two groups at random, were fed with distilled water containing iodine 50 μg/L (a control group with appropriate iodine) and 10 000 μg/L (a trial group with excessive iodine), respectively for six months. Apoptosis rate and expression of bcl-2、bax gene in the cells of cerebral cortex、hippocampus and thyroid gland in guinea pigs were quantitatively determined by flow cytometry and immunofluorescent techniques. Results The proportion of apoptosis in the cells of cerebral cortex, hippocampus and thyroid gland was significantly higher in the group with excessive iodine intake than that in the control one (P<0.01). The level of expression of bcl-2 gene was notably decreased (P<0.05), but that of bax was notably increased (P<0.01), in the cerebral cortex, hippocampus and thyroid gland in the group with excessive iodine than in the control one. The ratio of bcl-2 to bax in the cerebral cortex, hippocampus and thyroid gland of the group with excessive iodine was decreased significantly (P<0.01) than that of the control one. Conclusion Excessive iodine intake may induce apoptosis in the cells of cerebral cortex、hippocampus and thyroid gland. The over-expression of bax gene and the down-regulation of bcl-2, which can then cause the decrease in a ratio of bcl-2 to bax, appear to play an important role in the course of apoptosis induced by excessive iodine intake.
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Key words：Iodine；Brain；Thyroid gland；Apoptosis；Gene expression
细胞凋亡是由基因编程控制的不同于坏死的另一种细胞死亡形式,机体及外界多种因素都能影响细胞凋亡的发生,包括信息传导、基因表达、蛋白合成等。目前尚未见到高碘对脑细胞凋亡及基因调控影响的报道,本实验以高碘水喂养豚鼠6个月,研究高碘对脑和甲状腺细胞凋亡及bcl-2、bax基因表达的影响，以期对高碘引起脑和甲状腺损伤的机制做进一步探讨。
材料与方法
1.高碘甲状腺肿动物模型的复制:1月龄英国远交短毛豚鼠16只(购自军事医学科学院)，雌雄各半，体重200～250 g,按性别、体重随机分为适碘组和高碘组,分别以含碘量为50 μg/L和10 000 μg/L的蒸馏水和普通饲料喂养6个月。
2.标本采集:以2%戊巴比妥钠麻醉动物，分离甲状腺后断头处死动物,迅速分离大脑皮质和海马组织，于70%冷乙醇中做流式细胞检测及免疫荧光染色，留取甲状腺组织于10%甲醛中固定，石蜡包埋切片，HE染色光镜观察。
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3.主要试剂及仪器:鼠抗人bcl-2单克隆抗体，兔抗人bax多克隆抗体，羊抗鼠FITC-IgG、羊抗兔FITC-IgG二抗均购自Santa Cruz公司；溴化乙锭、RNA酶购自Sigma公司；流式细胞仪为美国BD公司FACS 420型。
4.流式细胞检测的样品制备及检测方法:流式细胞检测样品制备、DNA荧光染色方法及bcl-2、bax基因蛋白间接免疫荧光标记方法参照文献[1];流式细胞检测方法参照文献[2]。
5.分析方法:细胞凋亡率以百分率计算;bcl-2、bax蛋白表达定量分析参照文献[3]，以荧光指数表示bcl-2、bax蛋白的相对含量。荧光指数=(实验样品的bcl-2或bax蛋白平均荧光强度-对照样品平均荧光强度)/正常对照组样品bcl-2或bax蛋白平均荧光强度。
6.数据处理：应用POMS医学统计软件做t检验。
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结果
1.甲状腺光镜形态学:适碘组甲状腺组织结构正常，高碘组甲状腺滤泡腔明显扩大，滤泡上皮受压变扁平，细胞核多呈细小梭形浓染，少数滤泡腔破裂融合成较大的滤泡，滤泡腔内充满深染的红色胶质,这表明高碘甲状腺肿模型已复制成功。
2.凋亡细胞:适碘组大脑皮质、海马和甲状腺细胞DNA直方图G0/G1期前无凋亡峰出现，而高碘组G0/G1期前出现低于2C含量的亚二倍体峰(凋亡峰)；适碘组大脑皮质、海马和甲状腺细胞凋亡率(%)分别为2.56±1.62、3.08±1.54和2.30±0.97,而在高碘组则分别为21.76±3.38、22.90±4.78和19.26±4.50。与适碘组比较，高碘组大脑皮质、海马和甲状腺细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。
3.bcl-2、bax蛋白免疫荧光指数检测(表1): 与适碘组比较高碘组大脑皮质、海马和甲状腺组织bcl-2荧光指数较适碘组明显降低(P<0.05),而bax荧光指数明显升高(P<0.01)。
, 百拇医药
4.bcl-2/bax比值:高碘组大脑皮质、海马和甲状腺组织bcl-2/bax比值为0.848±0.156、0.854±0.112和0.875±0.081；适碘组分别为1.116±0.102、1.254±0.219和1.244±0.108。与适碘组比较，高碘组大脑皮质、海马和甲状腺组织bcl-2/bax比值明显下降(P<0.01)。
表1 大脑皮质、海马和甲状腺组织中bcl-2、bax基因蛋白表达(
±s) 组别
大脑皮质
海马
甲状腺
bcl-2
bax
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bcl-2
bax
bcl-2
bax
适碘组
64.80±
3.70
55.80±
2.28
64.40±
5.13
50.20±
4.66
, 百拇医药
64.40±
4.22
52.80±
2.49
高碘组
52.80±
6.76*
64.80±
1.64*
55.60±
3.44**
66.40±
, http://www.100md.com
6.42*
54.66±
4.32*
62.60±
3.85*
t检验 * P<0.01，** P<0.05
讨论
许多基因通过自身编码的蛋白发挥诱导或抑制凋亡的作用，bcl-2和bax是一对正负凋亡调节基因，在中枢和外周神经系统的神经元及甲状腺组织中均有表达[4]。bcl-2基因能阻遏多系统及多种损伤和刺激引起的细胞凋亡,延长细胞的生存期[5]。bax蛋白既能和bcl-2形成异源二聚体使bcl-2蛋白失活,对细胞凋亡有促进作用，又可以自身形成同源二聚体,直接促进凋亡。bcl-2/bax的比值决定细胞对凋亡刺激的易感性,决定细胞的生与死。bcl-2表达下调，bax蛋白过量表达，bcl-2/bax下降则促进细胞凋亡，否则反之[6]。
, 百拇医药
已有研究表明，高碘水喂养豚鼠可以成功地复制出高碘甲状腺肿模型，并引起甲状腺重量、形态学、酶学及甲状腺激素水平的改变[7]，以小鼠复制出高碘甲状腺肿模型研究显示，高碘不但可以引起甲状腺损伤，同时还可引起脑损伤[8]。本实验结果显示，高碘组与适碘组大脑皮质、海马与甲状腺组织三者间细胞凋亡率差异无显著性。由于细胞凋亡对机体生长发育、维持细胞总体数量平衡及机体内稳态等具有重要作用，甲状腺及神经细胞过度凋亡必然会对其结构及功能造成损害，这不仅有助于阐明高碘甲状腺肿的发病机制，还可以对高碘引起的学习、记忆能力下降等病变进行解释。由于过量的碘不仅对甲状腺还可对中枢神经系统造成损伤，就更加提醒人们要科学补碘，勿盲目过量补碘及滥用碘剂。
本结果还表明，bcl-2及bax基因是参与高碘诱发脑和甲状腺细胞凋亡调控的重要基因，其表达量及比值的改变可能在高碘诱发脑和甲状腺细胞凋亡过程中发挥重要作用，当bax基因过度表达，bcl-2基因表达下调，bcl-2/bax比值降低时,细胞凋亡和存活信息平衡失调，从而导致细胞凋亡的发生,但二者作用谁主谁从仅从本实验尚难以判断,其详细机制还有待进一步研究。
, 百拇医药
深入研究高碘对脑和甲状腺细胞凋亡的基因调控机制，不仅有助于从基因水平认识高碘对甲状腺及中枢神经系统损伤的机制,还有望对其防治提出新的思路。
参考文献
[1]左连富，主编. 流式细胞术与生物医学. 沈阳：辽宁科学技术出版社, 1996. 69-265.
[2]齐凤英，段惠军. 流式细胞术检测胃癌前病变DNA及P21, P53含量. 生物化学与生物物理进展,1998，25:363-366.
[3]Morkve O，Laerum OD. Flow cytometric measurement of p53 protein expression and DNA content in paraffin-embedded tissue from bronchial carcinomas. Cytometry，1991，12:438-444.
, 百拇医药
[4]Krajewski S, Krajewska M, Shabaik A, et al. Immunohistrochemical determination of in vivo distribution of bax， a dominant inhibitor of bcl-2. Am J Pathol, 1994,145:1323-1336.
[5]Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide. Science，1995，267：1445-1449.
[6]Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, bax that accelerates programmed cell death. Cell, 1993,74:609-619.
[7]冯仁青，尹桂山. 高碘对豚鼠甲状腺中蛋白水解酶和过氧化物酶活性的影响. 河北医学院学报, 1991, 12:129-131.
[8]高博, 尹桂山. 高碘对小鼠脑发育的影响. 中华预防医学杂志，1997,31:134-136.
收稿日期：1999-03-29, http://www.100md.com
单位：杨长春(050017 石家庄市 河北医科大学生化教研室)；尹桂山(050017 石家庄市 河北医科大学生化教研室)；崔灵光(050017 石家庄市 河北医科大学生化教研室)；朱惠民(公共卫生学院)；左连富(河北省肿瘤研究所)
关键词：碘；脑；甲状腺；脱噬作用；基因表达
中华预防医学杂志000211 摘 要：目的 探讨高碘对脑和甲状腺细胞凋亡及bcl-2、bax基因表达的影响。方法 分别以含碘量为50 μg/L(适碘组)和10 000 μg/L(高碘组)的蒸馏水喂养两个实验组的豚鼠6个月，应用流式细胞术和免疫荧光技术检测豚鼠大脑皮质、海马和甲状腺细胞凋亡率，并对bcl-2、bax基因蛋白表达进行定量检测。结果 高碘组大脑皮质、海马和甲状腺细胞凋亡率明显高于适碘组；高碘组大脑皮质、海马和甲状腺组织bcl-2蛋白表达量较适碘组明显降低,而bax蛋白表达量则明显高于适碘组；高碘组大脑皮质、海马和甲状腺组织bcl-2/bax比值较适碘组明显降低。结论 高碘可以诱发大脑皮质、海马和甲状腺细胞凋亡,bax基因过度表达和bcl-2基因表达下调以及由此引起的bcl-2/bax比值降低可能在高碘诱发脑和甲状腺细胞凋亡过程中起重要作用。
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Effects of excessive iodine on apoptosis and expression of bcl-2、bax genes in the cells of brain and thyroid gland in guinea pigs
YANG Changchun, YIN Guishan, CUI Lingguang, et al.
Department of Biochemistry, Hebei Medical University, Shijiazhuang 050017, China
Abstract：Objective To investigate the effects of excessive iodine intake on apoptosis and the expression of bcl-2、bax genes in the cells of brain and thyroid gland. Methods Guinea pigs, divided into two groups at random, were fed with distilled water containing iodine 50 μg/L (a control group with appropriate iodine) and 10 000 μg/L (a trial group with excessive iodine), respectively for six months. Apoptosis rate and expression of bcl-2、bax gene in the cells of cerebral cortex、hippocampus and thyroid gland in guinea pigs were quantitatively determined by flow cytometry and immunofluorescent techniques. Results The proportion of apoptosis in the cells of cerebral cortex, hippocampus and thyroid gland was significantly higher in the group with excessive iodine intake than that in the control one (P<0.01). The level of expression of bcl-2 gene was notably decreased (P<0.05), but that of bax was notably increased (P<0.01), in the cerebral cortex, hippocampus and thyroid gland in the group with excessive iodine than in the control one. The ratio of bcl-2 to bax in the cerebral cortex, hippocampus and thyroid gland of the group with excessive iodine was decreased significantly (P<0.01) than that of the control one. Conclusion Excessive iodine intake may induce apoptosis in the cells of cerebral cortex、hippocampus and thyroid gland. The over-expression of bax gene and the down-regulation of bcl-2, which can then cause the decrease in a ratio of bcl-2 to bax, appear to play an important role in the course of apoptosis induced by excessive iodine intake.
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Key words：Iodine；Brain；Thyroid gland；Apoptosis；Gene expression
细胞凋亡是由基因编程控制的不同于坏死的另一种细胞死亡形式,机体及外界多种因素都能影响细胞凋亡的发生,包括信息传导、基因表达、蛋白合成等。目前尚未见到高碘对脑细胞凋亡及基因调控影响的报道,本实验以高碘水喂养豚鼠6个月,研究高碘对脑和甲状腺细胞凋亡及bcl-2、bax基因表达的影响，以期对高碘引起脑和甲状腺损伤的机制做进一步探讨。
材料与方法
1.高碘甲状腺肿动物模型的复制:1月龄英国远交短毛豚鼠16只(购自军事医学科学院)，雌雄各半，体重200～250 g,按性别、体重随机分为适碘组和高碘组,分别以含碘量为50 μg/L和10 000 μg/L的蒸馏水和普通饲料喂养6个月。
2.标本采集:以2%戊巴比妥钠麻醉动物，分离甲状腺后断头处死动物,迅速分离大脑皮质和海马组织，于70%冷乙醇中做流式细胞检测及免疫荧光染色，留取甲状腺组织于10%甲醛中固定，石蜡包埋切片，HE染色光镜观察。
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3.主要试剂及仪器:鼠抗人bcl-2单克隆抗体，兔抗人bax多克隆抗体，羊抗鼠FITC-IgG、羊抗兔FITC-IgG二抗均购自Santa Cruz公司；溴化乙锭、RNA酶购自Sigma公司；流式细胞仪为美国BD公司FACS 420型。
4.流式细胞检测的样品制备及检测方法:流式细胞检测样品制备、DNA荧光染色方法及bcl-2、bax基因蛋白间接免疫荧光标记方法参照文献[1];流式细胞检测方法参照文献[2]。
5.分析方法:细胞凋亡率以百分率计算;bcl-2、bax蛋白表达定量分析参照文献[3]，以荧光指数表示bcl-2、bax蛋白的相对含量。荧光指数=(实验样品的bcl-2或bax蛋白平均荧光强度-对照样品平均荧光强度)/正常对照组样品bcl-2或bax蛋白平均荧光强度。
6.数据处理：应用POMS医学统计软件做t检验。
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结果
1.甲状腺光镜形态学:适碘组甲状腺组织结构正常，高碘组甲状腺滤泡腔明显扩大，滤泡上皮受压变扁平，细胞核多呈细小梭形浓染，少数滤泡腔破裂融合成较大的滤泡，滤泡腔内充满深染的红色胶质,这表明高碘甲状腺肿模型已复制成功。
2.凋亡细胞:适碘组大脑皮质、海马和甲状腺细胞DNA直方图G0/G1期前无凋亡峰出现，而高碘组G0/G1期前出现低于2C含量的亚二倍体峰(凋亡峰)；适碘组大脑皮质、海马和甲状腺细胞凋亡率(%)分别为2.56±1.62、3.08±1.54和2.30±0.97,而在高碘组则分别为21.76±3.38、22.90±4.78和19.26±4.50。与适碘组比较，高碘组大脑皮质、海马和甲状腺细胞凋亡率明显升高(P<0.01)。
3.bcl-2、bax蛋白免疫荧光指数检测(表1): 与适碘组比较高碘组大脑皮质、海马和甲状腺组织bcl-2荧光指数较适碘组明显降低(P<0.05),而bax荧光指数明显升高(P<0.01)。
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4.bcl-2/bax比值:高碘组大脑皮质、海马和甲状腺组织bcl-2/bax比值为0.848±0.156、0.854±0.112和0.875±0.081；适碘组分别为1.116±0.102、1.254±0.219和1.244±0.108。与适碘组比较，高碘组大脑皮质、海马和甲状腺组织bcl-2/bax比值明显下降(P<0.01)。
表1 大脑皮质、海马和甲状腺组织中bcl-2、bax基因蛋白表达(
±s) 组别大脑皮质
海马
甲状腺
bcl-2
bax
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bcl-2
bax
bcl-2
bax
适碘组
64.80±
3.70
55.80±
2.28
64.40±
5.13
50.20±
4.66
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4.22
52.80±
2.49
高碘组
52.80±
6.76*
64.80±
1.64*
55.60±
3.44**
66.40±
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6.42*
54.66±
4.32*
62.60±
3.85*
t检验 * P<0.01，** P<0.05
讨论
许多基因通过自身编码的蛋白发挥诱导或抑制凋亡的作用，bcl-2和bax是一对正负凋亡调节基因，在中枢和外周神经系统的神经元及甲状腺组织中均有表达[4]。bcl-2基因能阻遏多系统及多种损伤和刺激引起的细胞凋亡,延长细胞的生存期[5]。bax蛋白既能和bcl-2形成异源二聚体使bcl-2蛋白失活,对细胞凋亡有促进作用，又可以自身形成同源二聚体,直接促进凋亡。bcl-2/bax的比值决定细胞对凋亡刺激的易感性,决定细胞的生与死。bcl-2表达下调，bax蛋白过量表达，bcl-2/bax下降则促进细胞凋亡，否则反之[6]。
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已有研究表明，高碘水喂养豚鼠可以成功地复制出高碘甲状腺肿模型，并引起甲状腺重量、形态学、酶学及甲状腺激素水平的改变[7]，以小鼠复制出高碘甲状腺肿模型研究显示，高碘不但可以引起甲状腺损伤，同时还可引起脑损伤[8]。本实验结果显示，高碘组与适碘组大脑皮质、海马与甲状腺组织三者间细胞凋亡率差异无显著性。由于细胞凋亡对机体生长发育、维持细胞总体数量平衡及机体内稳态等具有重要作用，甲状腺及神经细胞过度凋亡必然会对其结构及功能造成损害，这不仅有助于阐明高碘甲状腺肿的发病机制，还可以对高碘引起的学习、记忆能力下降等病变进行解释。由于过量的碘不仅对甲状腺还可对中枢神经系统造成损伤，就更加提醒人们要科学补碘，勿盲目过量补碘及滥用碘剂。
本结果还表明，bcl-2及bax基因是参与高碘诱发脑和甲状腺细胞凋亡调控的重要基因，其表达量及比值的改变可能在高碘诱发脑和甲状腺细胞凋亡过程中发挥重要作用，当bax基因过度表达，bcl-2基因表达下调，bcl-2/bax比值降低时,细胞凋亡和存活信息平衡失调，从而导致细胞凋亡的发生,但二者作用谁主谁从仅从本实验尚难以判断,其详细机制还有待进一步研究。
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深入研究高碘对脑和甲状腺细胞凋亡的基因调控机制，不仅有助于从基因水平认识高碘对甲状腺及中枢神经系统损伤的机制,还有望对其防治提出新的思路。
参考文献
[1]左连富，主编. 流式细胞术与生物医学. 沈阳：辽宁科学技术出版社, 1996. 69-265.
[2]齐凤英，段惠军. 流式细胞术检测胃癌前病变DNA及P21, P53含量. 生物化学与生物物理进展,1998，25:363-366.
[3]Morkve O，Laerum OD. Flow cytometric measurement of p53 protein expression and DNA content in paraffin-embedded tissue from bronchial carcinomas. Cytometry，1991，12:438-444.
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[4]Krajewski S, Krajewska M, Shabaik A, et al. Immunohistrochemical determination of in vivo distribution of bax， a dominant inhibitor of bcl-2. Am J Pathol, 1994,145:1323-1336.
[5]Steller H. Mechanisms and genes of cellular suicide. Science，1995，267：1445-1449.
[6]Oltvai ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog, bax that accelerates programmed cell death. Cell, 1993,74:609-619.
[7]冯仁青，尹桂山. 高碘对豚鼠甲状腺中蛋白水解酶和过氧化物酶活性的影响. 河北医学院学报, 1991, 12:129-131.
[8]高博, 尹桂山. 高碘对小鼠脑发育的影响. 中华预防医学杂志，1997,31:134-136.
收稿日期：1999-03-29, http://www.100md.com