广西肝癌患者乙型肝炎病毒前C区基因的突变
作者：方钟燎 何并文 庄辉 Ling Ring Tim J Harrison
单位：方钟燎(530021 南宁市 广西壮族自治区卫生防疫站肝炎室)；何并文：(广西肿瘤病防治研究所)；庄辉：(北京医科大学)；；Ling Ring(Royal Free Hospital, University of London, England)；Tim J Harrison(Royal Free Hospital, University of London, England)
关键词：肝炎病毒，乙型；基因；突变；肝肿瘤
中华预防医学杂志000207 摘 要：目的 了解乙型肝炎病毒(HBV)前C区基因突变与HBeAg阴性的原发性肝癌患者HBV感染的关系。方法 应用套式PCR方法对广西16例原发性肝癌患者血清HBV DNA前C区进行扩增,对阳性者用Sanger DNA测序法分析。结果 16例肝癌患者中有14例HBV DNA阳性,阳性率为87.5%(14/16)。其中1例HBeAg阳性，1例虽然HBeAg为阴性，但其前C区序列正常；2例为HBV野毒株和突变株混合感染；其余8例为HBV突变株感染。该8例中，仅第4、5、12例的第28密码为终止密码, 有1例为HBV终止密码株和无终止密码突变株混合感染。结论 经典的1 896位核苷酸点突变株感染在广西原发性肝癌患者中并不常见,提示可能存在前C区以外的基因突变，并导致HBeAg阴性的HBV感染。
, http://www.100md.com
Mutation of hepatitis B virus DNA pre-C region in patients with primary hepatocellular carcinoma in Guangxi
FANG Zhongliao, HE Bingwen, ZHUANG Hui, et al.
Sanitation and Anti-epidemic Station of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China
Abstract：Objective To study the association between mutation of hepatitis B virus (HBV) pre-C gene and HBV infection in patients with primary hepatocellular carcinoma (PHC) but negative hepatitis B e antigen (HBeAg) in Guangxi Province, China. Methods Nested polymerase chain reaction (nPCR) was used for amplification of HBV DNA Pre C region in sera collected from 16 patients with PHC in Guangxi, and then their HBV DNA nPCR products were sequenced by Sanger method. Results Sera in fourteen of 16 patients showed positive HBV DNA, with a positive proportion of 87.5% (14/16). One (C23) of them was positive for HBeAg; one (C24) was negative HBeAg, but with normal sequence in his Pre C region; two (C7, C14) were co-infected with HBV wild and mutant strains; and the remainder eight cases (C3、 C4、 C5、 C8、 C10、 C11、 C12、 C13) were infected with mutant virus strains, but stop codon at codon 28 was only found in C4, C5 and C12. One case (C8) was co-infected with both HBV stop codon mutant and non-stop codon strains. Conclusion It is uncommon for patients with PHC in Guangxi infected with HBV mutant strain with classical mutation at nt 1 896, which suggests that maybe there exist other types of mutation other than that in pre-C region causing HBV infection without HBeAg.
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Key words Hepatitis B virus;Genes;Mutation;Liver neoplasms
广西是全球原发性肝癌高发区，90%以上病例的血清HBsAg阳性[1],HBsAg阳性者的HBeAg又常为阴性。此外，不少乙型肝炎病毒(HBV)携带者虽然HBeAg阴性，但HBV DNA仍为阳性，提示HBV变异株的出现可逃避宿主的免疫清除，从而引起慢性感染[2]。目前的研究认为，HBV变异株的产生与前C区的突变有关，1 896 位核苷酸由G→A，导致第28位密码子突变为终止密码，从而阻断HBeAg的合成。作者报道16例广西原发性肝癌患者血清HBV DNA前C区扩增及测序结果，以探讨与HBeAg阴性的原发性肝癌患者HBV感染的关系。
对象与方法
1.研究对象:血清采自南宁市各大医院经病理确诊为原发性肝癌的16例患者,其中男性10例,女性6例,除1例为HBeAg阳性外，其余13例均为HBeAg阴性。
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2.试剂:PCR试剂购自Promega公司;载体及感受态细胞购自Invitrogen公司;克隆DNA的提取试剂盒QIAspin prep 购自Qiagen公司;测序反应试剂盒购自Buckinghamshire公司。
3.研究方法:
(1)取10 μl血清加90 u磷酸盐缓冲液,煮沸15 min,13 000 r/min离心。取上清10 μl套式PCR,反应体积为50 μl。每份标本平行做2个PCR。第1轮扩增引物为B935(nt1 240～1 260 5′-GCG- CTGCAGAAGGTTTGTGGCTCCTCTG-3′) 和MDC1(nt 2 304～2 324 5′- TTGATAAGATAGGGGCATTTG- 3′)，反应条件为94℃变性1.5 min、50℃退火45 s、72 ℃延伸4 min,30个循环后继续循环(72℃ 10 min，22℃ 5 min)；第2轮扩增引物:XSEQ1(nt1 547～1 564 5′-CCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTG-3′)和HDB2(nt2 134～2 152 5′-GCGAAGCTTAGATCTCTGGATGCTGG
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A-3′)，反应条件：94℃变性45 s、50℃退火45 s、72 ℃延伸2 min,30个循环后继续上述循环。
(2)载体的连接及克隆的筛选：取第2轮扩增产物2 μl连接到PCR2.1载体,在4℃下过夜,次日转染感受态细胞,第3日挑选克隆并培养过夜,第4日用EcoR1酶消化，筛选阳性克隆,阳性克隆的剩余培养液提取DNA用于测序。每份标本取3个克隆。
(3)测序：5 μl纯化的DNA在1 μl NaOH和2 μl引物XSEQ3(nt 1 653～1 6725′-CATAAGAGGACT- CTTGGACT- 3′)中变性40 min,随后在2 μl测序酶缓冲液,1 μl HCl及1 μl Tris.HCl溶液中和25 min,测序反应按试剂盒说明书进行,测序酶为2.0版,同位素用35S。测序反应混合物在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳(80 V,3.5 h),用10%醋酸固定凝胶后,在80℃真空下烘干胶块,与X光片一起放入暗盒,次日洗片。
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结果
1.套式PCR结果:14例HBV DNA阳性,阳性率为87.5%。
2.测序结果:由图1可见，病例23、24为正常序列；病例7、14为野毒株和突变株混合感染；其余的标本为单独突变株感染。仅病例4、5、12第28密码子为终止密码, 病例8为有终止密码和无终止密码变异株混合感染。病例2、3、10、11、15的nt 1 858位由T→C；病例2、10、15的1 856位由C→T。病例8和病例13在nt 1 838位由A→G，从而导致异亮氨酸→缬氨酸；病例11的nt 1 850位由T→A，使该密码由丝氨酸变为苏氨酸；病例7的nt1 889位由T→C,由色氨酸变为精氨酸。此外, 病例3、5、11、14的nt1 846位由A→T，病例8的1 877位由C→T，病例3的1 879位G→A，均为无义突变。
-表示与野毒株相同的序列,括号内的数字表示用于测序的克隆数,+表示克隆来自不同的PCR产物
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图1 14例原发性肝癌患者HBV DNA前C区测序结果
讨论
HBV DNA前C区和C区在同一开放读码框内,各自有不同的起始密码,两者共同编码的产物为HBeAg前体。C区编码C抗原,前C区对病毒复制或C抗原的产生无影响,但能影响HBeAg的形成和分泌[3]。到目前为止,已发现前C区有3种类型突变(起始密码突变、移码突变和无义突变)均可阻断HBeAg的产生。无义突变最常见的是nt1 896 G→A,导致第28位密码子为终止密码,其他不常见的无义突变,包括第28密码nt1 897 G→A,即TGG→TAA,第2密码CAA→TAA，第21密码AAG→TAG 等[2]。骆抗先等[4]分析了13例原发性肝癌患者,发现10例有前C区nt1 896 G→A,导致第28密码子突变为终止密码。李晓芳等[5]在3例原发性肝癌患者中发现1例有此种突变。Takahashi等[6]分析21例日本原发性肝癌患者，也发现9例有此类突变；而Laskus等[7]发现52%的冈比亚原发性肝癌患者(14/27)有同样突变，其中8例伴有1 899位碱基点突变(G→A)。可见，国内外原发性肝癌患者乙型肝炎病毒前C区1 896位碱基点突变发生率在30%以上。本研究中广西原发性肝癌患者中此种突变的发生率较低，提示可能存在前C区以外的、可阻断HBeAg产生的突变。
, 百拇医药
在前C区和E信号突变的研究中，发现第28密码与第15密码的序列存在依赖关系。E信号第28密码的第2、3个碱基分别与第15密码的第2、3个碱基相对应, HBV多数基因型的第15密码序列为CCT,当第15密码的CCT突变为CCC或TCC时，即可抑制nt 1 896终止密码的产生[2,8]。本研究进一步支持了这一观察结果。
本研究表明, 经典的1 896位核苷酸点突变在广西原发性肝癌患者中并不常见,是否存在前C区以外的基因突变并导致HBeAg阴性的HBV感染，值得进一步研究。
基金项目：卫生部科研基金资助(98-1-351)
参考文献
[1]Yeh FS, Yu MC, Mo CC, et al. Hepatitis B virus,aflatoxins and hepatocellular carcinoma in southern Guangxi,China. Cancer Res，1989，49:2506-2509.
, 百拇医药
[2]Harrison TJ, Zuckerman AJ. The molecular medicine of viral hepatitis. England: Chichester, 1997. 99-103.
[3]Carman WF, Ferrao M, Lok AS, et al. Precore sequence variation in Chinese isolates of hepatitis B virus. J Infect Dis,1992,165:127-133.
[4]骆抗先,杨洁,李秀惠,等. 前C区A83点突变在乙型肝炎病毒感染中的分布.中华医学杂志,1994,74:478-480.
[5]李晓芳,胡德昌,熊思东.慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒前C区基因突变与临床关系. 中华传染病学杂志,1996,14:15-19.
, 百拇医药
[6]Takahashi K,Aoyama K,Ohno N,et al.The precore/core promoter mutant (T1762A1764) of hepatitis B virus:clinical significance and an easy method for detection. J Gen Virol, 1995, 76 Pt 12:3159-3164.
[7]Laskus T,Radkowski M,Nowicki M,et al.Association between hepatitis B virus core promoter rearrangements and hepatocellular carcinoma.Biochem Biophys Res Commun, 1998, 244:812-814.
[8]Akarca US, Greene S, Lok AS. Detection of precore hepatitis B virus mutants in asymptomatic HBsAg-positive family members. Hepatology, 1994,19:1366-1370.
收稿日期：1999-05-04, 百拇医药
单位：方钟燎(530021 南宁市 广西壮族自治区卫生防疫站肝炎室)；何并文：(广西肿瘤病防治研究所)；庄辉：(北京医科大学)；；Ling Ring(Royal Free Hospital, University of London, England)；Tim J Harrison(Royal Free Hospital, University of London, England)
关键词：肝炎病毒，乙型；基因；突变；肝肿瘤
中华预防医学杂志000207 摘 要：目的 了解乙型肝炎病毒(HBV)前C区基因突变与HBeAg阴性的原发性肝癌患者HBV感染的关系。方法 应用套式PCR方法对广西16例原发性肝癌患者血清HBV DNA前C区进行扩增,对阳性者用Sanger DNA测序法分析。结果 16例肝癌患者中有14例HBV DNA阳性,阳性率为87.5%(14/16)。其中1例HBeAg阳性，1例虽然HBeAg为阴性，但其前C区序列正常；2例为HBV野毒株和突变株混合感染；其余8例为HBV突变株感染。该8例中，仅第4、5、12例的第28密码为终止密码, 有1例为HBV终止密码株和无终止密码突变株混合感染。结论 经典的1 896位核苷酸点突变株感染在广西原发性肝癌患者中并不常见,提示可能存在前C区以外的基因突变，并导致HBeAg阴性的HBV感染。
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Mutation of hepatitis B virus DNA pre-C region in patients with primary hepatocellular carcinoma in Guangxi
FANG Zhongliao, HE Bingwen, ZHUANG Hui, et al.
Sanitation and Anti-epidemic Station of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Nanning 530021, China
Abstract：Objective To study the association between mutation of hepatitis B virus (HBV) pre-C gene and HBV infection in patients with primary hepatocellular carcinoma (PHC) but negative hepatitis B e antigen (HBeAg) in Guangxi Province, China. Methods Nested polymerase chain reaction (nPCR) was used for amplification of HBV DNA Pre C region in sera collected from 16 patients with PHC in Guangxi, and then their HBV DNA nPCR products were sequenced by Sanger method. Results Sera in fourteen of 16 patients showed positive HBV DNA, with a positive proportion of 87.5% (14/16). One (C23) of them was positive for HBeAg; one (C24) was negative HBeAg, but with normal sequence in his Pre C region; two (C7, C14) were co-infected with HBV wild and mutant strains; and the remainder eight cases (C3、 C4、 C5、 C8、 C10、 C11、 C12、 C13) were infected with mutant virus strains, but stop codon at codon 28 was only found in C4, C5 and C12. One case (C8) was co-infected with both HBV stop codon mutant and non-stop codon strains. Conclusion It is uncommon for patients with PHC in Guangxi infected with HBV mutant strain with classical mutation at nt 1 896, which suggests that maybe there exist other types of mutation other than that in pre-C region causing HBV infection without HBeAg.
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Key words Hepatitis B virus;Genes;Mutation;Liver neoplasms
广西是全球原发性肝癌高发区，90%以上病例的血清HBsAg阳性[1],HBsAg阳性者的HBeAg又常为阴性。此外，不少乙型肝炎病毒(HBV)携带者虽然HBeAg阴性，但HBV DNA仍为阳性，提示HBV变异株的出现可逃避宿主的免疫清除，从而引起慢性感染[2]。目前的研究认为，HBV变异株的产生与前C区的突变有关，1 896 位核苷酸由G→A，导致第28位密码子突变为终止密码，从而阻断HBeAg的合成。作者报道16例广西原发性肝癌患者血清HBV DNA前C区扩增及测序结果，以探讨与HBeAg阴性的原发性肝癌患者HBV感染的关系。
对象与方法
1.研究对象:血清采自南宁市各大医院经病理确诊为原发性肝癌的16例患者,其中男性10例,女性6例,除1例为HBeAg阳性外，其余13例均为HBeAg阴性。
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2.试剂:PCR试剂购自Promega公司;载体及感受态细胞购自Invitrogen公司;克隆DNA的提取试剂盒QIAspin prep 购自Qiagen公司;测序反应试剂盒购自Buckinghamshire公司。
3.研究方法:
(1)取10 μl血清加90 u磷酸盐缓冲液,煮沸15 min,13 000 r/min离心。取上清10 μl套式PCR,反应体积为50 μl。每份标本平行做2个PCR。第1轮扩增引物为B935(nt1 240～1 260 5′-GCG- CTGCAGAAGGTTTGTGGCTCCTCTG-3′) 和MDC1(nt 2 304～2 324 5′- TTGATAAGATAGGGGCATTTG- 3′)，反应条件为94℃变性1.5 min、50℃退火45 s、72 ℃延伸4 min,30个循环后继续循环(72℃ 10 min，22℃ 5 min)；第2轮扩增引物:XSEQ1(nt1 547～1 564 5′-CCCCGTCTGTGCCTTCTCATCTG-3′)和HDB2(nt2 134～2 152 5′-GCGAAGCTTAGATCTCTGGATGCTGG
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A-3′)，反应条件：94℃变性45 s、50℃退火45 s、72 ℃延伸2 min,30个循环后继续上述循环。
(2)载体的连接及克隆的筛选：取第2轮扩增产物2 μl连接到PCR2.1载体,在4℃下过夜,次日转染感受态细胞,第3日挑选克隆并培养过夜,第4日用EcoR1酶消化，筛选阳性克隆,阳性克隆的剩余培养液提取DNA用于测序。每份标本取3个克隆。
(3)测序：5 μl纯化的DNA在1 μl NaOH和2 μl引物XSEQ3(nt 1 653～1 6725′-CATAAGAGGACT- CTTGGACT- 3′)中变性40 min,随后在2 μl测序酶缓冲液,1 μl HCl及1 μl Tris.HCl溶液中和25 min,测序反应按试剂盒说明书进行,测序酶为2.0版,同位素用35S。测序反应混合物在变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳(80 V,3.5 h),用10%醋酸固定凝胶后,在80℃真空下烘干胶块,与X光片一起放入暗盒,次日洗片。
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结果
1.套式PCR结果:14例HBV DNA阳性,阳性率为87.5%。
2.测序结果:由图1可见，病例23、24为正常序列；病例7、14为野毒株和突变株混合感染；其余的标本为单独突变株感染。仅病例4、5、12第28密码子为终止密码, 病例8为有终止密码和无终止密码变异株混合感染。病例2、3、10、11、15的nt 1 858位由T→C；病例2、10、15的1 856位由C→T。病例8和病例13在nt 1 838位由A→G，从而导致异亮氨酸→缬氨酸；病例11的nt 1 850位由T→A，使该密码由丝氨酸变为苏氨酸；病例7的nt1 889位由T→C,由色氨酸变为精氨酸。此外, 病例3、5、11、14的nt1 846位由A→T，病例8的1 877位由C→T，病例3的1 879位G→A，均为无义突变。
-表示与野毒株相同的序列,括号内的数字表示用于测序的克隆数,+表示克隆来自不同的PCR产物, 百拇医药
图1 14例原发性肝癌患者HBV DNA前C区测序结果
讨论
HBV DNA前C区和C区在同一开放读码框内,各自有不同的起始密码,两者共同编码的产物为HBeAg前体。C区编码C抗原,前C区对病毒复制或C抗原的产生无影响,但能影响HBeAg的形成和分泌[3]。到目前为止,已发现前C区有3种类型突变(起始密码突变、移码突变和无义突变)均可阻断HBeAg的产生。无义突变最常见的是nt1 896 G→A,导致第28位密码子为终止密码,其他不常见的无义突变,包括第28密码nt1 897 G→A,即TGG→TAA,第2密码CAA→TAA，第21密码AAG→TAG 等[2]。骆抗先等[4]分析了13例原发性肝癌患者,发现10例有前C区nt1 896 G→A,导致第28密码子突变为终止密码。李晓芳等[5]在3例原发性肝癌患者中发现1例有此种突变。Takahashi等[6]分析21例日本原发性肝癌患者，也发现9例有此类突变；而Laskus等[7]发现52%的冈比亚原发性肝癌患者(14/27)有同样突变，其中8例伴有1 899位碱基点突变(G→A)。可见，国内外原发性肝癌患者乙型肝炎病毒前C区1 896位碱基点突变发生率在30%以上。本研究中广西原发性肝癌患者中此种突变的发生率较低，提示可能存在前C区以外的、可阻断HBeAg产生的突变。
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在前C区和E信号突变的研究中，发现第28密码与第15密码的序列存在依赖关系。E信号第28密码的第2、3个碱基分别与第15密码的第2、3个碱基相对应, HBV多数基因型的第15密码序列为CCT,当第15密码的CCT突变为CCC或TCC时，即可抑制nt 1 896终止密码的产生[2,8]。本研究进一步支持了这一观察结果。
本研究表明, 经典的1 896位核苷酸点突变在广西原发性肝癌患者中并不常见,是否存在前C区以外的基因突变并导致HBeAg阴性的HBV感染，值得进一步研究。
基金项目：卫生部科研基金资助(98-1-351)
参考文献
[1]Yeh FS, Yu MC, Mo CC, et al. Hepatitis B virus,aflatoxins and hepatocellular carcinoma in southern Guangxi,China. Cancer Res，1989，49:2506-2509.
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[2]Harrison TJ, Zuckerman AJ. The molecular medicine of viral hepatitis. England: Chichester, 1997. 99-103.
[3]Carman WF, Ferrao M, Lok AS, et al. Precore sequence variation in Chinese isolates of hepatitis B virus. J Infect Dis,1992,165:127-133.
[4]骆抗先,杨洁,李秀惠,等. 前C区A83点突变在乙型肝炎病毒感染中的分布.中华医学杂志,1994,74:478-480.
[5]李晓芳,胡德昌,熊思东.慢性乙型肝炎患者乙型肝炎病毒前C区基因突变与临床关系. 中华传染病学杂志,1996,14:15-19.
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[6]Takahashi K,Aoyama K,Ohno N,et al.The precore/core promoter mutant (T1762A1764) of hepatitis B virus:clinical significance and an easy method for detection. J Gen Virol, 1995, 76 Pt 12:3159-3164.
[7]Laskus T,Radkowski M,Nowicki M,et al.Association between hepatitis B virus core promoter rearrangements and hepatocellular carcinoma.Biochem Biophys Res Commun, 1998, 244:812-814.
[8]Akarca US, Greene S, Lok AS. Detection of precore hepatitis B virus mutants in asymptomatic HBsAg-positive family members. Hepatology, 1994,19:1366-1370.
收稿日期：1999-05-04, 百拇医药