DNA指纹片段长度的计算方法
作者：黎黎 方积乾 伍新尧
单位：黎黎(510089 广州市 中山医科大学卫生统计教研室)；方积乾(510089 广州市 中山医科大学卫生统计教研室)；伍新尧(法医学系)
关键词：
DNA指纹片段长度的计算方法 DNA指纹实验得到的原始数据是各DNA片段在凝胶上的迁移距离，而我们通常感兴趣的则是各DNA片段的长度，因此需要通过迁移距离来计算其片段长度。由于DNA片段越长，在凝胶上的迁移距离越短，将一组已知长度的标记(marker)在一块凝胶上电泳就为这块凝胶提供了校正的手段。如果将长度标记简单地用于鉴别与之迁移同样距离的其他片段，则几乎不存在什么问题。但如要估计与之迁移距离不同的其他片段的长度，则需要采用一些其他的计算方法。
一、材料与方法
本实验采用片段长度已知的标记λ-DNA/ECoRⅠ+ HindⅢ作为实验材料。选取长度为125 bp～5 148 bp范围内的12条片段进行研究。取1 μg DNA长度标记λ-DNA/ECoRⅠ+ HindⅢ，与1 μl上样缓冲液混匀后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(电泳时间16 h，每厘米电压8～10 V,电泳缓冲液0.5×TBE)、银染色后采用凝胶专用分析软件Phoretix 1D standard 3.0分析，得到各标准DNA片段的迁移距离，共100例样本。
, 百拇医药
二、结果与分析
迁移距离与片段长度间的关系不是线性的，除非在非常小的范围内(图1)。因此仅简单地给标准片段画一个标准曲线不能令人满意。长度标记对迁移距离的非线性拟合可用于计算片段长度[1]。
图1 DNA片段长度与迁移距离的关系
由于许多因素的影响，如凝胶不均匀、温度及电压的波动、电极缓冲液中的离子强度、溶液pH值的波动等均导致DNA片段长度的迁移距离与通过简单的理论模型得到的估计值不同[2]。将凝胶迁移距离转换成相应的片段长度的方法对于凝胶电泳中DNA片段长度测量的精确程度有重要的影响。
, 百拇医药
我们曾采用指数曲线、对数曲线和双曲线等6种目前较为常用的模型[3]，分别对实验数据进行拟合，效果均不理想。其中，常用的指数曲线模型拟合的误差分布有明显的趋势；对数曲线模型的误差在个别点处过大，双曲线模型的误差在分子量较小处较大，而在分子量较大处较小，与理论背景不符。因此均不能用于计算片段长度。
为改善拟合效果并考虑到DNA指纹数据中迁移距离与片段长度之间的关系，采用以下模型拟合，即：Ln(L)=a0+a1m。拟合曲线见图2。
图2 片段长度与迁移距离的拟合曲线
改进模型的误差图见图3。误差分布无特定的趋势且较小，与常用的6种模型相比，作者采用的模型拟合的效果有明显提高。
, http://www.100md.com
图3 改进后拟合模型的误差图
三、讨论
DNA指纹技术的出现使法医生物学的发展进入了一个全新的阶段，而片段长度的计算是对DNA指纹实验结果进行分析的前提和基础，其计算方法的优劣直接影响结果的准确性，如果选用的方法不当，则会人为地造成错误。因此必须谨慎地选用拟合模型。本文采用目前较为常用的6种拟合模型对实验数据进行分析，发现结果并不能令人满意。因此采用改进模型，其拟合效果较其他方法有明显的提高。
基金项目：国家自然科学基金资助(39770676)
参考文献
[1]Elder JK, Amos A, Southern EM，et al. Measurement of DNA length by gel electrophoresisⅠ. Improved accuracy of mobility measurements using a digital microdensitometer and computer processing. Anal Biochem,1983,128: 223-226.
[2]杨庆恩. DNA在法庭科学中的应用. 北京：中国人民公安大学出版社，1994. 85-86.
[3]Elder JK，Southern EM. Measurement of DNA length by gel electrophoresis Ⅱ. Comparison of methods for relating mobility to fragment length. Anal Biochem, 1983, 128:227-231.
收稿日期：1999-05-31, 百拇医药
单位：黎黎(510089 广州市 中山医科大学卫生统计教研室)；方积乾(510089 广州市 中山医科大学卫生统计教研室)；伍新尧(法医学系)
关键词：
DNA指纹片段长度的计算方法 DNA指纹实验得到的原始数据是各DNA片段在凝胶上的迁移距离，而我们通常感兴趣的则是各DNA片段的长度，因此需要通过迁移距离来计算其片段长度。由于DNA片段越长，在凝胶上的迁移距离越短，将一组已知长度的标记(marker)在一块凝胶上电泳就为这块凝胶提供了校正的手段。如果将长度标记简单地用于鉴别与之迁移同样距离的其他片段，则几乎不存在什么问题。但如要估计与之迁移距离不同的其他片段的长度，则需要采用一些其他的计算方法。
一、材料与方法
本实验采用片段长度已知的标记λ-DNA/ECoRⅠ+ HindⅢ作为实验材料。选取长度为125 bp～5 148 bp范围内的12条片段进行研究。取1 μg DNA长度标记λ-DNA/ECoRⅠ+ HindⅢ，与1 μl上样缓冲液混匀后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(电泳时间16 h，每厘米电压8～10 V,电泳缓冲液0.5×TBE)、银染色后采用凝胶专用分析软件Phoretix 1D standard 3.0分析，得到各标准DNA片段的迁移距离，共100例样本。
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二、结果与分析
迁移距离与片段长度间的关系不是线性的，除非在非常小的范围内(图1)。因此仅简单地给标准片段画一个标准曲线不能令人满意。长度标记对迁移距离的非线性拟合可用于计算片段长度[1]。
图1 DNA片段长度与迁移距离的关系
由于许多因素的影响，如凝胶不均匀、温度及电压的波动、电极缓冲液中的离子强度、溶液pH值的波动等均导致DNA片段长度的迁移距离与通过简单的理论模型得到的估计值不同[2]。将凝胶迁移距离转换成相应的片段长度的方法对于凝胶电泳中DNA片段长度测量的精确程度有重要的影响。
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我们曾采用指数曲线、对数曲线和双曲线等6种目前较为常用的模型[3]，分别对实验数据进行拟合，效果均不理想。其中，常用的指数曲线模型拟合的误差分布有明显的趋势；对数曲线模型的误差在个别点处过大，双曲线模型的误差在分子量较小处较大，而在分子量较大处较小，与理论背景不符。因此均不能用于计算片段长度。
为改善拟合效果并考虑到DNA指纹数据中迁移距离与片段长度之间的关系，采用以下模型拟合，即：Ln(L)=a0+a1m。拟合曲线见图2。
图2 片段长度与迁移距离的拟合曲线
改进模型的误差图见图3。误差分布无特定的趋势且较小，与常用的6种模型相比，作者采用的模型拟合的效果有明显提高。
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图3 改进后拟合模型的误差图
三、讨论
DNA指纹技术的出现使法医生物学的发展进入了一个全新的阶段，而片段长度的计算是对DNA指纹实验结果进行分析的前提和基础，其计算方法的优劣直接影响结果的准确性，如果选用的方法不当，则会人为地造成错误。因此必须谨慎地选用拟合模型。本文采用目前较为常用的6种拟合模型对实验数据进行分析，发现结果并不能令人满意。因此采用改进模型，其拟合效果较其他方法有明显的提高。
基金项目：国家自然科学基金资助(39770676)
参考文献
[1]Elder JK, Amos A, Southern EM，et al. Measurement of DNA length by gel electrophoresisⅠ. Improved accuracy of mobility measurements using a digital microdensitometer and computer processing. Anal Biochem,1983,128: 223-226.
[2]杨庆恩. DNA在法庭科学中的应用. 北京：中国人民公安大学出版社，1994. 85-86.
[3]Elder JK，Southern EM. Measurement of DNA length by gel electrophoresis Ⅱ. Comparison of methods for relating mobility to fragment length. Anal Biochem, 1983, 128:227-231.
收稿日期：1999-05-31, 百拇医药