苯作业工人血浆热应激蛋白水平研究
作者：陈胜 徐耘 肖成峰 杨春秀 王瑞波 邬堂春
单位：(陈胜 肖成峰 王瑞波 邬堂春)同济医科大学职业医学研究所，湖北 武汉 430030；(徐耘 杨春秀)宜昌市卫生防疫站，湖北 宜昌 443000
关键词：苯；热应激蛋白；生物标志物
中国工业医学杂志990502
摘要：目的 了解苯接触对热应激蛋白(HSPs)表达的影响以及HSPs在苯毒性机理中的作用，探讨HSPs作为接触苯工人分子生物标志物的可能性。方法 选择接触苯浓度≥40mg/m3工人42名为高暴露组，接触苯浓度<40mg/m3工人50名为低暴露组，不接触苯等职业有害因素工人42名为对照组。采用Western-dot-blot方法测定其血浆HSP27、HSP60、HSP70及HSP90水平。结果 发现高暴露组血浆HSP70水平明显高于对照组(P<0.05)，而HSP27、HSP60和HSP90在四组间差异无显著意义。结论 血浆HSP70水平能反映工人接触苯的水平及反应能力，作为分子生物标志物在苯作业工人健康监护中有一定价值。
, 百拇医药
A study on level of heat shock protein in
plasma of workers exposed to benzene
CHEN Sheng XIAO Cheng-feng WANG Rui-bo WU Tang-chun
Institute of Occupational Medicine，Tongji Medical University，Wuhan 430030，China；
XU Yun YANG Chun-xiu
Yichang Anti-epidemic Station，Yichang 443000，China
Abstract：Objective To investigate the effects of benzene-exposure on the expression of heat shock proteins(HSPs) and the probability of HSPs in plasma of workers as biomarkers.Method 144 workers were divided into three groups according to the concentration of benzene in working environment：the high-exposed group had 42 workers who exposed to a high benzene exposure(≥40mg/m3)，the low-exposed group had of 50 workers exposed to a low level benzene exposure(<40mg/m3)，and the control group consisted of 42 workers who neither had benzene nor other known harmful factors exposure.Using Western-dot-bloting，the levels of HSP27，HSP60，HSP70 and HSP90 in plasma were determined.Results The levels of plasma HSP70 in high-exposed groups were significantly higher than that in controls(P<0.05).Conclusion The level of plasma HSP70 might be used as an effective biomarker in the health monitoring of benzene workers.
, 百拇医药
Key words：Benzene；Heat shock proteins；Biomarker
热应激蛋白(heat stress proteins，HSPs)是原核和真核生物在各种应激条件下产生的具有高度保守性的蛋白质家族。由于其最开始被发现是在热处理即热应激条件下诱导产生的，故称为热应激蛋白，但随着研究的深入，人们发现不仅热应激能诱导HSPs的合成，其他各种应激如缺血、缺氧、毒物等也能诱导HSPs的合成，以保护机体免受热、毒物等的损害，产生热耐受和毒物耐受[1，2]。除此之外，HSPs还在正常细胞中参与蛋白质的折叠、装配、跨膜转运和降解等，起“分子伴侣”作用，在细胞的增殖、分化、凋亡等生理、生化过程中起重要作用[3]。另外，HSPs还与肿瘤的发生发展有关[4]。根据HSPs在SDS-PAGE上分布分子质量的不同，HSPs可分为HSP27、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110等家族，其中最主要、诱导性最强的是HSP70[5]。本研究检测了既往苯中毒工人和暴露于不同浓度苯作业工人血浆中HSP27、HSP60、HSP70、HSP90水平，以了解接触苯对HSPs水平的影响及HSPs在苯毒性机理中的作用，为研究苯致白血病机理及寻找接触苯作业工人生物标志物提供依据。
, http://www.100md.com
1 对象和方法
1.1 对象
根据作业环境空气中苯浓度选择某市橡胶厂成型、胶浆工人42名为高暴露组(苯浓度≥40mg/m3)，选择某市造船厂刷漆、喷漆工人50名为低暴露组(苯浓度<40mg/m3)。在上述工种作业中，苯均用作稀释剂，工人在作业过程中不戴或仅戴简单防尘口罩。选择两厂机械加工、木工等不接触苯等职业有害因素工种工人42名为对照组。三组工人在年龄、工龄、生活习惯等方面无明显差异，体检均未发现有急性感染性疾病者。
1.2 环境监测
按区域采样布点，用100ml注射器在苯作业工人呼吸带高度采现场空气100ml，气相色谱法测定苯、甲苯、二甲苯浓度。
1.3 样品收集和处理
, 百拇医药
上午空腹静脉采血5ml，肝素抗凝，分离血浆，分装成若干份，每份加入苯*****(PMSF)至lmmol/ml，-20℃保存备用。指尖采血，常规方法进行白细胞记数及测定血红蛋白含量。
1.4 HSPs测定
采用Western斑点印迹法检测血浆HSP27、HSP60、HSP70和HSP90水平[6]。第一抗体为兔抗人HSP27、HSP60、HSP70和HSP90(Prof.Tanguay惠赠)，第二抗体为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(Sigma，武汉博士德生物工程公司分装)，显色后用CS-930双波段色谱扫描仪(日本岛津)进行图象分析，用积分光密度大小反映HSPs水平。
1.5 统计分析
结果用SPSS 7.5软件进行统计分析。
, 百拇医药 2 结果
2.1 作业场所空气中苯浓度测定结果
由表1可见，橡胶厂采样点空气中苯浓度超过国家最高容许浓度(40mg/m3)[7]，最高者是国家最高容许浓度的7.2倍；造船厂采样点空气中苯浓度虽未超过国家最高容许浓度，但非常接近。空气中甲苯、二甲苯浓度在各采样点比较接近。
表1 作业环境空气中苯及同系物浓度 mg/m3 厂名
工种
苯
甲苯
二甲苯
橡胶厂
, http://www.100md.com
夹布成型
287.0
24.5
40.9
钻探成型
205.0
15.8
36.5
胶浆
135.0
21.4
54.3
造船厂
, 百拇医药
刷漆
39.0
18.6
27.8
喷漆
37.0
17.0
36.5
2.2 末梢血白细胞计数及血红蛋白测定结果
由表2可见，高暴露组工人末梢血白细胞计数明显低于对照组(P<0.05)，但仍在正常范围内；三组工人血红蛋白含量无显著性差异，且均在正常范围内。表2 四组工人末梢血白细胞计数
和血红蛋白含量(
±s) 组别
, 百拇医药
n
WBC(×109/L)
Hb(g/L)
高暴露组
42
6.52±0.84*
137.1±14.7
低暴露组
50
6.89±0.82
142.4±16.7
对照组
, http://www.100md.com
42
7.13±0.81
139.6±17.3
*P<0.05，与对照组相比2.3血浆HSPs检测结果
由表3可见，HSP70有随暴露水平的升高而升高的趋势，高暴露组血浆HSP70水平明显高于对照组(P<0.05)；但其他HSPs三组之间差异并无显著性。
表3 四组工人血浆HSPs水平(积分光密度，±s) 组别
n
HSP27
HSP60
, http://www.100md.com
HSP70
HSP90
高暴露组
42
2287.2±373.8
8101.7±1755.9
7680.1±950.2*
9413.0±1068.4
低暴露组
50
2343.1±401.3
8388.5±1472.9
, http://www.100md.com
6717.2±960.1
9291.4±1349.8
对照组
42
2245.1±341.4
8794.9±1283.6
6692.5±1000.1
9384.4±1086.1
*P<0.05，与对照组相比
3 讨论
热应激蛋白的发现使人们从某些方面认识到生物体在遭受环境不良因素的刺激时是如何产生反应，以保护机体免遭这些不良因素的损害。由于热应激基因的启动子极易被不良因素如毒物、缺血、高温等所激活，启动热应激基因的转录、翻译，增强HSP70的合成，在职业医学和毒理学领域，正在尝试作为评价机体接触不良因素水平及损伤程度的指标[8，9]。
, 百拇医药
本研究发现HSP27、HSP60、HSP70、HSP90四种HSPs中除暴露组HSP70水平显著高于对照组(P<0.05)，且有剂量-反应关系外，其他各种HSP在四组之间差异均无显著意义，这与HSP70受毒物的诱导性最强，保护作用更为广泛一致。暴露高浓度苯作业工人血浆HSP70水平升高，可能是因为苯及其代谢产物直接诱导热应激基因的表达，或者是苯在体内代谢产生的多种反应氧类物质(reactive oxygen species，ROS)使机体处于过氧化应激之中[10]，而ROS可诱导热应激基因的表达，使细胞内HSP70水平升高[11]。ROS还可攻击细胞膜脂质双分子层，发生脂质过氧化，破坏细胞膜的结构和功能[12]，使细胞内的HSP70释放到血浆中，血浆中的HSP70水平升高。本研究中高、低暴露组工人作业场所空气中甲苯和二甲苯浓度比较接近，且王秀玲等人的研究表明甲苯、二甲苯作业工人血浆HSP70水平与对照组无明显差异[13]，因此可认为甲苯、二甲苯对本研究中高暴露组HSP70水平的升高影响较小。
, 百拇医药
综上所述，苯作业工人血浆HSP70水平的升高既可能是苯及其代谢产物诱导机体细胞内HSP70表达增加的结果，也可能是苯及其代谢产物损伤细胞膜结构或功能，使细胞内HSP70释放的结果。提示血浆HSP70能够反映机体对苯的反应能力及机体对苯的接触水平，故作为生物标志物在接触苯作业工人健康监护中有一定价值。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39370594)；卫生部科研基金资助项目(9810)
作者简介：陈胜(1971—)，男，同济医科大学助教，硕士，目前主要从事热应激蛋白在生物监测中作用的研究。
参考文献：
[1]Morimoto RI，Tissieres A，and Georgopoulous，C.The stress response，function of the proteins and perspective.In Stress Protein in Biology and Medicine(Morimoto，R I，Tissieres，A，and Georgopuslos，C Eds)Pp.1～36.Cold Spring Harbor Laboratory Press.(1990).
, 百拇医药
[2]Mosser DD，Bols NC.Relationship between heat-shock protein synthesis and thermotolerance in rainbow trout fibroblast[J].J Com Physiol 1988，158：457～467.
[3]Gething MJ.Protein folding in the cell[J].Nature，1992，355：33～45.
[4]Lindquist S.The heat shock response[J].Ann Rev Biochem，1986，55：1151～1191.
[5]Hotchkiss R，Nunnaly I，Lindquist S，et al.Hyperthermia protects mice against the lethal effects of endotoxin[J].Am J Physiol，1993，265：1447～1457.
, 百拇医药
[6]何骁生，潘秋萍，邬堂春，等.Western斑点印迹法检测主要热应激蛋白[J].中华劳动卫生职业病杂志，1996，14：376～377.
[7]王NE464兰，刚葆琪.现代劳动卫生学[M].北京：人民卫生出版社，1994.495～500.
[8]张国高，贺涵贞，邬堂春.热应激蛋白及其在职业卫生中应用研究的展望[J].中华劳动卫生职业病杂志，1998，16(2)：67～69.
[9]Carol P.Tracking toxicants[J].Environ Health Perspect.1997，105(1)：475～477.
[10]Smith MT，Yager JW，Steinmetz KL，et al.Peroxidase-dependent metabolism of benzenes phenolic metabilites and its potential role in benzene toxicity and carcinogenicity[J].Environ Health Perspect，1989，82：23～29.
, 百拇医药
[11]Jacquier-Sarlin MR，Fuller K，Dinh-Xuan AT，et al.Protective effects of HSP70 in inflammation[J].Experientia，1994，50：1031～1038.
[12]Chamulitrat W，Mason RD.Lipid peroxy radical intermediates in the peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lpioxygenase[J].J Biol Chem，1989，264：20968～20973.
[13]王秀玲，金锡鹏，周彤，等.苯系化合物对作业工人血浆热应激蛋白70抗体滴度及热应激蛋白70水平的影响[J].劳动医学，1998，15(2)：69～72.
收稿日期：1998-11-12；修回日期：1999-04-30, http://www.100md.com
单位：(陈胜 肖成峰 王瑞波 邬堂春)同济医科大学职业医学研究所，湖北 武汉 430030；(徐耘 杨春秀)宜昌市卫生防疫站，湖北 宜昌 443000
关键词：苯；热应激蛋白；生物标志物
中国工业医学杂志990502
摘要：目的 了解苯接触对热应激蛋白(HSPs)表达的影响以及HSPs在苯毒性机理中的作用，探讨HSPs作为接触苯工人分子生物标志物的可能性。方法 选择接触苯浓度≥40mg/m3工人42名为高暴露组，接触苯浓度<40mg/m3工人50名为低暴露组，不接触苯等职业有害因素工人42名为对照组。采用Western-dot-blot方法测定其血浆HSP27、HSP60、HSP70及HSP90水平。结果 发现高暴露组血浆HSP70水平明显高于对照组(P<0.05)，而HSP27、HSP60和HSP90在四组间差异无显著意义。结论 血浆HSP70水平能反映工人接触苯的水平及反应能力，作为分子生物标志物在苯作业工人健康监护中有一定价值。
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A study on level of heat shock protein in
plasma of workers exposed to benzene
CHEN Sheng XIAO Cheng-feng WANG Rui-bo WU Tang-chun
Institute of Occupational Medicine，Tongji Medical University，Wuhan 430030，China；
XU Yun YANG Chun-xiu
Yichang Anti-epidemic Station，Yichang 443000，China
Abstract：Objective To investigate the effects of benzene-exposure on the expression of heat shock proteins(HSPs) and the probability of HSPs in plasma of workers as biomarkers.Method 144 workers were divided into three groups according to the concentration of benzene in working environment：the high-exposed group had 42 workers who exposed to a high benzene exposure(≥40mg/m3)，the low-exposed group had of 50 workers exposed to a low level benzene exposure(<40mg/m3)，and the control group consisted of 42 workers who neither had benzene nor other known harmful factors exposure.Using Western-dot-bloting，the levels of HSP27，HSP60，HSP70 and HSP90 in plasma were determined.Results The levels of plasma HSP70 in high-exposed groups were significantly higher than that in controls(P<0.05).Conclusion The level of plasma HSP70 might be used as an effective biomarker in the health monitoring of benzene workers.
, 百拇医药
Key words：Benzene；Heat shock proteins；Biomarker
热应激蛋白(heat stress proteins，HSPs)是原核和真核生物在各种应激条件下产生的具有高度保守性的蛋白质家族。由于其最开始被发现是在热处理即热应激条件下诱导产生的，故称为热应激蛋白，但随着研究的深入，人们发现不仅热应激能诱导HSPs的合成，其他各种应激如缺血、缺氧、毒物等也能诱导HSPs的合成，以保护机体免受热、毒物等的损害，产生热耐受和毒物耐受[1，2]。除此之外，HSPs还在正常细胞中参与蛋白质的折叠、装配、跨膜转运和降解等，起“分子伴侣”作用，在细胞的增殖、分化、凋亡等生理、生化过程中起重要作用[3]。另外，HSPs还与肿瘤的发生发展有关[4]。根据HSPs在SDS-PAGE上分布分子质量的不同，HSPs可分为HSP27、HSP60、HSP70、HSP90、HSP110等家族，其中最主要、诱导性最强的是HSP70[5]。本研究检测了既往苯中毒工人和暴露于不同浓度苯作业工人血浆中HSP27、HSP60、HSP70、HSP90水平，以了解接触苯对HSPs水平的影响及HSPs在苯毒性机理中的作用，为研究苯致白血病机理及寻找接触苯作业工人生物标志物提供依据。
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1 对象和方法
1.1 对象
根据作业环境空气中苯浓度选择某市橡胶厂成型、胶浆工人42名为高暴露组(苯浓度≥40mg/m3)，选择某市造船厂刷漆、喷漆工人50名为低暴露组(苯浓度<40mg/m3)。在上述工种作业中，苯均用作稀释剂，工人在作业过程中不戴或仅戴简单防尘口罩。选择两厂机械加工、木工等不接触苯等职业有害因素工种工人42名为对照组。三组工人在年龄、工龄、生活习惯等方面无明显差异，体检均未发现有急性感染性疾病者。
1.2 环境监测
按区域采样布点，用100ml注射器在苯作业工人呼吸带高度采现场空气100ml，气相色谱法测定苯、甲苯、二甲苯浓度。
1.3 样品收集和处理
, 百拇医药
上午空腹静脉采血5ml，肝素抗凝，分离血浆，分装成若干份，每份加入苯*****(PMSF)至lmmol/ml，-20℃保存备用。指尖采血，常规方法进行白细胞记数及测定血红蛋白含量。
1.4 HSPs测定
采用Western斑点印迹法检测血浆HSP27、HSP60、HSP70和HSP90水平[6]。第一抗体为兔抗人HSP27、HSP60、HSP70和HSP90(Prof.Tanguay惠赠)，第二抗体为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(Sigma，武汉博士德生物工程公司分装)，显色后用CS-930双波段色谱扫描仪(日本岛津)进行图象分析，用积分光密度大小反映HSPs水平。
1.5 统计分析
结果用SPSS 7.5软件进行统计分析。
, 百拇医药 2 结果
2.1 作业场所空气中苯浓度测定结果
由表1可见，橡胶厂采样点空气中苯浓度超过国家最高容许浓度(40mg/m3)[7]，最高者是国家最高容许浓度的7.2倍；造船厂采样点空气中苯浓度虽未超过国家最高容许浓度，但非常接近。空气中甲苯、二甲苯浓度在各采样点比较接近。
表1 作业环境空气中苯及同系物浓度 mg/m3 厂名
工种
苯
甲苯
二甲苯
橡胶厂
, http://www.100md.com
夹布成型
287.0
24.5
40.9
钻探成型
205.0
15.8
36.5
胶浆
135.0
21.4
54.3
造船厂
, 百拇医药
刷漆
39.0
18.6
27.8
喷漆
37.0
17.0
36.5
2.2 末梢血白细胞计数及血红蛋白测定结果
由表2可见，高暴露组工人末梢血白细胞计数明显低于对照组(P<0.05)，但仍在正常范围内；三组工人血红蛋白含量无显著性差异，且均在正常范围内。表2 四组工人末梢血白细胞计数
和血红蛋白含量(
±s) 组别, 百拇医药
n
WBC(×109/L)
Hb(g/L)
高暴露组
42
6.52±0.84*
137.1±14.7
低暴露组
50
6.89±0.82
142.4±16.7
对照组
, http://www.100md.com
42
7.13±0.81
139.6±17.3
*P<0.05，与对照组相比2.3血浆HSPs检测结果
由表3可见，HSP70有随暴露水平的升高而升高的趋势，高暴露组血浆HSP70水平明显高于对照组(P<0.05)；但其他HSPs三组之间差异并无显著性。
表3 四组工人血浆HSPs水平(积分光密度，
±s) 组别n
HSP27
HSP60
, http://www.100md.com
HSP70
HSP90
高暴露组
42
2287.2±373.8
8101.7±1755.9
7680.1±950.2*
9413.0±1068.4
低暴露组
50
2343.1±401.3
8388.5±1472.9
, http://www.100md.com
6717.2±960.1
9291.4±1349.8
对照组
42
2245.1±341.4
8794.9±1283.6
6692.5±1000.1
9384.4±1086.1
*P<0.05，与对照组相比
3 讨论
热应激蛋白的发现使人们从某些方面认识到生物体在遭受环境不良因素的刺激时是如何产生反应，以保护机体免遭这些不良因素的损害。由于热应激基因的启动子极易被不良因素如毒物、缺血、高温等所激活，启动热应激基因的转录、翻译，增强HSP70的合成，在职业医学和毒理学领域，正在尝试作为评价机体接触不良因素水平及损伤程度的指标[8，9]。
, 百拇医药
本研究发现HSP27、HSP60、HSP70、HSP90四种HSPs中除暴露组HSP70水平显著高于对照组(P<0.05)，且有剂量-反应关系外，其他各种HSP在四组之间差异均无显著意义，这与HSP70受毒物的诱导性最强，保护作用更为广泛一致。暴露高浓度苯作业工人血浆HSP70水平升高，可能是因为苯及其代谢产物直接诱导热应激基因的表达，或者是苯在体内代谢产生的多种反应氧类物质(reactive oxygen species，ROS)使机体处于过氧化应激之中[10]，而ROS可诱导热应激基因的表达，使细胞内HSP70水平升高[11]。ROS还可攻击细胞膜脂质双分子层，发生脂质过氧化，破坏细胞膜的结构和功能[12]，使细胞内的HSP70释放到血浆中，血浆中的HSP70水平升高。本研究中高、低暴露组工人作业场所空气中甲苯和二甲苯浓度比较接近，且王秀玲等人的研究表明甲苯、二甲苯作业工人血浆HSP70水平与对照组无明显差异[13]，因此可认为甲苯、二甲苯对本研究中高暴露组HSP70水平的升高影响较小。
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综上所述，苯作业工人血浆HSP70水平的升高既可能是苯及其代谢产物诱导机体细胞内HSP70表达增加的结果，也可能是苯及其代谢产物损伤细胞膜结构或功能，使细胞内HSP70释放的结果。提示血浆HSP70能够反映机体对苯的反应能力及机体对苯的接触水平，故作为生物标志物在接触苯作业工人健康监护中有一定价值。
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39370594)；卫生部科研基金资助项目(9810)
作者简介：陈胜(1971—)，男，同济医科大学助教，硕士，目前主要从事热应激蛋白在生物监测中作用的研究。
参考文献：
[1]Morimoto RI，Tissieres A，and Georgopoulous，C.The stress response，function of the proteins and perspective.In Stress Protein in Biology and Medicine(Morimoto，R I，Tissieres，A，and Georgopuslos，C Eds)Pp.1～36.Cold Spring Harbor Laboratory Press.(1990).
, 百拇医药
[2]Mosser DD，Bols NC.Relationship between heat-shock protein synthesis and thermotolerance in rainbow trout fibroblast[J].J Com Physiol 1988，158：457～467.
[3]Gething MJ.Protein folding in the cell[J].Nature，1992，355：33～45.
[4]Lindquist S.The heat shock response[J].Ann Rev Biochem，1986，55：1151～1191.
[5]Hotchkiss R，Nunnaly I，Lindquist S，et al.Hyperthermia protects mice against the lethal effects of endotoxin[J].Am J Physiol，1993，265：1447～1457.
, 百拇医药
[6]何骁生，潘秋萍，邬堂春，等.Western斑点印迹法检测主要热应激蛋白[J].中华劳动卫生职业病杂志，1996，14：376～377.
[7]王NE464兰，刚葆琪.现代劳动卫生学[M].北京：人民卫生出版社，1994.495～500.
[8]张国高，贺涵贞，邬堂春.热应激蛋白及其在职业卫生中应用研究的展望[J].中华劳动卫生职业病杂志，1998，16(2)：67～69.
[9]Carol P.Tracking toxicants[J].Environ Health Perspect.1997，105(1)：475～477.
[10]Smith MT，Yager JW，Steinmetz KL，et al.Peroxidase-dependent metabolism of benzenes phenolic metabilites and its potential role in benzene toxicity and carcinogenicity[J].Environ Health Perspect，1989，82：23～29.
, 百拇医药
[11]Jacquier-Sarlin MR，Fuller K，Dinh-Xuan AT，et al.Protective effects of HSP70 in inflammation[J].Experientia，1994，50：1031～1038.
[12]Chamulitrat W，Mason RD.Lipid peroxy radical intermediates in the peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lpioxygenase[J].J Biol Chem，1989，264：20968～20973.
[13]王秀玲，金锡鹏，周彤，等.苯系化合物对作业工人血浆热应激蛋白70抗体滴度及热应激蛋白70水平的影响[J].劳动医学，1998，15(2)：69～72.
收稿日期：1998-11-12；修回日期：1999-04-30, http://www.100md.com