鸡胚胎微量血采集和其血红蛋白叶酸盐水平测定及意义*
作者：李勇 陈星 李竹
单位：李勇 陈星 李竹(北京医科大学中国妇婴保健中心，北京 100083)
关键词：胚胎；叶酸；血红蛋白叶酸盐；纸血片
卫生研究990114 摘要 建立了10日龄鸡胚胎微量血采集方法，尿绒膜血管采血量约为100μl/胚胎，制成的纸血片再用微生物法测定其血红蛋白叶酸盐含量(叶酸盐/血红蛋白；μg/g)。实验结果表明，滴至在鸡胚胎内壳膜表面的叶酸(folic acid, FA)和同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)均能在短期内迅速通过内壳膜和尿绒膜而被吸收入血。滴注5μgFA后，血红蛋白叶酸盐吸收高峰时间点为60min时，剂量为22.26μg/g。单纯滴注HCY(8μ mol/胚胎)对胚胎血红蛋白叶酸盐水平影响不大(P>0.05)。FA和HCY联合给药60min后，胚胎血红蛋白的叶酸盐水平明显下降(P<0.001)，呈拮抗作用。此外，还评价了实验方法的优缺点。
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中图分类号 T5916 Q592.1
Significance of collection of chick embryo blood specimen
for the determination of hemoglobin folate
Li Yong, Chen Xing, Li Zhu
National Center for Maternal and Infant Health, Beijing Medical University, Beijing 100083, China
A method for embryo-blood collection (about 100μl/embryo) from chorioallantoic blood vessels of day 10 White Leghorn chick embryo was developed and the embryonic hemoglobin folate concentrations (folate/hemoglobin, μg/g) were measured by the microbiological assay on microtitre dried blood spots to test the hypothesis whether homocysteine (HCY) would increase in folate depletion during early development stage of embryo. The results showed folic acid (FA) and HCY having been placed in the enlarged air cell could quickly pass through inner shell membrane and chorioallantoic membrane, and enter into blood, on the highly vascularized membrane of chick embryo aged 10 days. After 5 μg FA were placed on the inner shell membrane, there was a striking increase of hemoglobin folate with a peak in 60 min at 22.26 μg/g, followed by a decline. In contrast, 8 μmol of D.L-HCY did not result in the obvious increase of embryonic hemoglobin folate during the total transient time course (0～480 min). By 60 min posttreatment the hemoglobin folate concentration for joint group (HCY 8μmol+FA 5μg/embryo) had obviously decreased in comparison with single FA group (P<0.001). The results supported the above hypothesis mentioned. Moreover, both advantages and disadvantages of this method were evaluated.
, 百拇医药
Key words:embryo, folic acid, hemoglobin folate, dried blood spot
叶酸(folic acid, FA)属必需营养元素，是一碳基团代谢中的重要辅酶，参与机体内的许多生物学过程，具有防治出生缺陷疾病(尤其是神经管畸形)、老年性痴呆和保护心脏等重要功能[1～3]。近年大量流行病学调查发现同型半胱氨酸是一种新的致畸因子，具有损伤细胞作用，并可引起胚胎发育异常[4，5]。导致同型半胱氨酸在体内蓄积的主要原因可能是叶酸及代谢酶体系的缺乏或相关基因表达异常[6，7]，然而，有关动物实验研究的证据甚少为探讨在胚胎器官形成期外源性FA和同型半胱氨酸单独和联合对胚胎血红蛋白叶酸盐含量的影响，本研究建立了一种鸡胚胎微量血采集方法，并用美国CDC引进的滤纸血片法探讨FA和同型半胱氨酸对10日龄鸡胚胎血红蛋白叶酸盐药代动力学的影响，以期阐明它们之间的相互关系。
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1 材料与方法
1.1 材料
未经免疫的白色莱杭鸡种蛋购自北京家禽孵化实验场；D，L-同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)、叶酸、氯霉素、抗坏血酸、叠氮钠等均购自美国Sigma公司；乳酸杆菌氯霉素耐药株购自英国NCIMB公司；采血用滤纸片(下简称纸血片)购自美国Schleicher & Schuell公司。主要仪器包括：配置570nm滤光片及分析软件的酶标仪，美国Labsystems公司出品；超声波清洗器，美国Cole-Parmer公司出品；配置自动吸样器的U-2000紫外可见光分光光度计，日本HITACHI公司出品；配置自动翻蛋设备的孵化箱、恒温培养箱、照蛋器等为国产。
1.2 鸡胚微量血采集方法
1.2.1 鸡胚培养 种蛋经0.1%新洁尔灭清洗后入孵化箱，在温度为37.4℃和相对温度为60%的环境条件下孵化。孵化时种蛋大头朝上且每2h翻蛋一次[8]。第8天用照蛋器检出活胚，弃除未受精、壳钙化不全及气室异位蛋。第10天用牙科钻钻开一小口，无菌条件下进行气室内壳膜表面给药和溶蜡封口，继续培养至采血时间。
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1.2.2 实验分组和采血 实验分叶酸组、HCY组和叶酸+HCY组，每蛋注射剂量为叶酸5μg、HCY8μ mol(均为新鲜配制)，注射体积均为25 μl/蛋。采血时间：三组均为0、30、60、120、240和480min，每时间组8～10个鸡胚。采血方法：外壳用酒精消毒后，迅速用钟表镊子小心剥脱气室上面的全部卵壳，然后向对侧揭开内壳膜，暴露富含血管网的尿囊与绒毛膜结合而成的尿绒膜(主要采血部位)，眼科剪剪开细小动脉，用抗凝处理过的尖细嘴吸管收集血液；根据需要可打开胚胎心脏和颈动脉，继续采血；然后将血滴至具有采血环标志的纸血片上，每环用血量为60μl。血片经室温自然风干，干燥后的血片装入含有干燥剂的塑料袋内，-20℃保存待测。
1.3 微生物法测定纸血片血红蛋白叶酸盐
1.3.1 基本原理 检测用微生物为乳酸杆菌(NCIB 10463)，该菌生长依赖于叶酸的存在，其生长速度与叶酸含量相关。选择样品血红蛋白校正血液叶酸含量，因血液叶酸和血红蛋白关系是恒定的。
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1.3.2 叶酸盐和血红蛋白提取 用打孔器从纸血片血滴上打下完整的3个血环(每片约含全血12μl)作为一个样品，按1∶20比例用0.5%抗坏血酸/0.1%Triton洗脱液浸泡并超声洗脱(30℃，60min)，倾出提取液，弃去纸片。
1.3.3 血红蛋白叶酸盐含量计算法 96孔板微生物法检测纸血片提取液叶酸盐含量，紫外分光光度计535nm下检测出血红蛋白含量。检测结果为血红蛋白叶酸盐，计算公式为：
血红蛋白叶酸盐(μg/g)=
2 结果与讨论
2.1 外源性FA对10日龄鸡胚血红蛋白叶酸盐的影响
图1显示，10日龄胚胎经内壳膜滴注60min后，血红蛋白叶酸盐水平达最高峰(P<0.05)，然后随时间延长而呈持续性下降趋势，该结果与Rosenquist TH等人测定12天龄鸡胚血清叶酸盐水平的结果基本一致[9]。血清叶酸盐主要反映机体近期叶酸摄入水平，而纸血片血红蛋白叶酸盐能综合反映叶酸近期摄入量及机体储备水平[1，10]。
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图1 外源性FA(5μg/胚胎)致胚胎血红蛋白
叶酸盐水平变化(n=53)
2.2 外源性HCY对10日龄鸡胚血红蛋白叶酸盐的影响
图2显示，在HCY的刺激下，30min时血红蛋白叶酸盐水平升高1.9倍；120min时升高2.65倍，总体上看呈现波浪状变化，经方差分析各时间组均数间无统计学意义(F=2.334,P=0.0674)。
图2 外源性HCY(8μmol/胚胎)致胚胎血红蛋白
叶酸盐变化(n=69)
2.3 FA与HCY联合对10日龄鸡胚血红蛋白叶酸盐的影响
, 百拇医药
图3和表1显示，联合给药60min时，HCY能明显降低外源性FA所致胚胎血红蛋白叶酸盐水平(P<0.01)；120min后，与单纯叶酸组类同，呈现持续性缓慢下降趋势。HCY致血红蛋白叶酸盐含量降低的原因可能是HCY复甲基化形成甲硫氨酸的过程中要消耗叶酸和VB12的结果[1]。
图3 FA(5μg/胚胎)和HCY 8μmol/胚胎联合致胚胎
血红蛋白叶酸盐水平变化(n=48)
表1 10日龄鸡胚血红蛋白叶酸盐水平的动态变化
(叶酸盐/Hb=μg/g,
±s) t/min
, 百拇医药
FA(5μg/胚胎)
HCY
(8μmol/胚胎)
HCY+FA
(8μmol+5μg/胚胎)
0
2.83±0.85
2.83±0.85
2.83±0.85
30
10.86±5.76
5.38±0.05
, 百拇医药
10.94±2.63
60
22.26±9.98
4.32±2.24
11.82±3.24
120
13.03±4.62
7.50±2.18
8.81±1.98
240
9.52±2.64
3.01±1.99
, 百拇医药
8.95±3.40
480
7.74±1.46
5.87±2.43
5.72±3.28
P值
<0.001
>0.05
<0.001
2.4 实验方法的验证及优缺点
本研究结果和预实验结果完全一致。例如：每胚胎给FA5μg后，其血红蛋白叶酸盐测定最大值均发生在60min组，叶酸盐/血红蛋白分别为22.26μg/g和20.45μg/g(P>0.05)。给予致畸剂量的HCY (8μmol/胚胎)在实验时程范围(0～480min)对10日龄鸡胚的生长发育、胚胎外膜血管分化等均无肉眼可见的损害作用，胚胎发育良好。10日龄胚胎的实际采血率为90%(因内壳膜血管发育和分布存在个体差异所致)，尿绒膜血管采血量约为(100±20)μl/胚胎，完全能满足纸血片法所需的血量(60μl)。此外，在采血过程中，揭开的内壳膜要保持一定的倾斜角，这样可最大限度的减少尿囊液混入所采血液中。实践证明，我们建立的微量血采集方法，适于探讨胚胎的药(毒)代动力学和生化功能。具有花费低且实验周期短；易获得较好的剂量-反应关系；实际操作简单易行等优点。主要缺点是：本实验方法不适于检测早期鸡胚(<9天龄)的药代动力学且忽略了母体-胎盘-胚胎相互关系。
, 百拇医药
目前，我们已用鸡胚微量血采集方法制备了数百个胚胎的全血血浆和血清样品，拟用PCR法研究与叶酸代谢密切相关的胱硫脒合成酶和5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶等基因的表达情况，用HPLC法探讨血浆HCY的时程代谢变化，应用免疫学方法探讨血清HCY-2抗原的水平，为最终解决与叶酸和HCY有关疾病的发病机理和防治提供基础科学依据。
* 国家“863”计划(No.102100304)和国家自然科学基金资助项目(No.39870697)
作者简介：李勇，男，博士，副研究员
参考文献
1 Bailey LB. Folate in health and disease. New York: Marcel Dekken Inc, 1995
, 百拇医药
2 Fleming A, Copp AJ. Embryonic folate metabolism and mouse neural tube defects. Science, 1998,280:2107—2109
3 Appling DR. Compartmentation of folate-mediated one-carbon metabolism in eukaryotes. FASEB J, 1991,5:2645—2651
4 Mills JL, Scott JM, Kirke PN, et al. Homocysteine and neural tube defects. J Nutr.1996,126:7565—7605
5 Molulsky AG. Nutritional ecogenetics: homocysteine-related arteriosclerotic vascular disease, neural tube defects, and folic acid. AM J Hum Genet. 1996,58:17—20
, http://www.100md.com
6 Tremlath D, Sherbondy A, Vandyke D, et al. Analysis of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) as a candidate gene for neural tube defects (NTDs). Teratology.1997,55:41
7 Bjorke MAL, Ueland PM, Schneede J, et al. Elevated plasma total homocysteine and C677T mutation of the methylenetetrahydrofolate reductase gene in patients with spina bifida. QJM, 1997, 90:593—598
8 张天荫.动物胚胎学.济南：山东科学技术出版社，1996.23
, 百拇医药
9 Rosenquist TH, Ratashak SA, Selhub J. Homocysteine induces congenital defects of the heart and neural tube: effect of folic acid. Proc Natl Acad Sci USA， 1996，93:15227—15232
10 O'Broin SD, Kelleher BP, Gunter EW.Evaluation of factors influencing precision in the analysis of samples taken from blood spots on filter paper. Clin Lab Haem, 1995,17:185—188
1998-09-27收稿, 百拇医药
单位：李勇 陈星 李竹(北京医科大学中国妇婴保健中心，北京 100083)
关键词：胚胎；叶酸；血红蛋白叶酸盐；纸血片
卫生研究990114 摘要 建立了10日龄鸡胚胎微量血采集方法，尿绒膜血管采血量约为100μl/胚胎，制成的纸血片再用微生物法测定其血红蛋白叶酸盐含量(叶酸盐/血红蛋白；μg/g)。实验结果表明，滴至在鸡胚胎内壳膜表面的叶酸(folic acid, FA)和同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)均能在短期内迅速通过内壳膜和尿绒膜而被吸收入血。滴注5μgFA后，血红蛋白叶酸盐吸收高峰时间点为60min时，剂量为22.26μg/g。单纯滴注HCY(8μ mol/胚胎)对胚胎血红蛋白叶酸盐水平影响不大(P>0.05)。FA和HCY联合给药60min后，胚胎血红蛋白的叶酸盐水平明显下降(P<0.001)，呈拮抗作用。此外，还评价了实验方法的优缺点。
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中图分类号 T5916 Q592.1
Significance of collection of chick embryo blood specimen
for the determination of hemoglobin folate
Li Yong, Chen Xing, Li Zhu
National Center for Maternal and Infant Health, Beijing Medical University, Beijing 100083, China
A method for embryo-blood collection (about 100μl/embryo) from chorioallantoic blood vessels of day 10 White Leghorn chick embryo was developed and the embryonic hemoglobin folate concentrations (folate/hemoglobin, μg/g) were measured by the microbiological assay on microtitre dried blood spots to test the hypothesis whether homocysteine (HCY) would increase in folate depletion during early development stage of embryo. The results showed folic acid (FA) and HCY having been placed in the enlarged air cell could quickly pass through inner shell membrane and chorioallantoic membrane, and enter into blood, on the highly vascularized membrane of chick embryo aged 10 days. After 5 μg FA were placed on the inner shell membrane, there was a striking increase of hemoglobin folate with a peak in 60 min at 22.26 μg/g, followed by a decline. In contrast, 8 μmol of D.L-HCY did not result in the obvious increase of embryonic hemoglobin folate during the total transient time course (0～480 min). By 60 min posttreatment the hemoglobin folate concentration for joint group (HCY 8μmol+FA 5μg/embryo) had obviously decreased in comparison with single FA group (P<0.001). The results supported the above hypothesis mentioned. Moreover, both advantages and disadvantages of this method were evaluated.
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Key words:embryo, folic acid, hemoglobin folate, dried blood spot
叶酸(folic acid, FA)属必需营养元素，是一碳基团代谢中的重要辅酶，参与机体内的许多生物学过程，具有防治出生缺陷疾病(尤其是神经管畸形)、老年性痴呆和保护心脏等重要功能[1～3]。近年大量流行病学调查发现同型半胱氨酸是一种新的致畸因子，具有损伤细胞作用，并可引起胚胎发育异常[4，5]。导致同型半胱氨酸在体内蓄积的主要原因可能是叶酸及代谢酶体系的缺乏或相关基因表达异常[6，7]，然而，有关动物实验研究的证据甚少为探讨在胚胎器官形成期外源性FA和同型半胱氨酸单独和联合对胚胎血红蛋白叶酸盐含量的影响，本研究建立了一种鸡胚胎微量血采集方法，并用美国CDC引进的滤纸血片法探讨FA和同型半胱氨酸对10日龄鸡胚胎血红蛋白叶酸盐药代动力学的影响，以期阐明它们之间的相互关系。
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1 材料与方法
1.1 材料
未经免疫的白色莱杭鸡种蛋购自北京家禽孵化实验场；D，L-同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)、叶酸、氯霉素、抗坏血酸、叠氮钠等均购自美国Sigma公司；乳酸杆菌氯霉素耐药株购自英国NCIMB公司；采血用滤纸片(下简称纸血片)购自美国Schleicher & Schuell公司。主要仪器包括：配置570nm滤光片及分析软件的酶标仪，美国Labsystems公司出品；超声波清洗器，美国Cole-Parmer公司出品；配置自动吸样器的U-2000紫外可见光分光光度计，日本HITACHI公司出品；配置自动翻蛋设备的孵化箱、恒温培养箱、照蛋器等为国产。
1.2 鸡胚微量血采集方法
1.2.1 鸡胚培养 种蛋经0.1%新洁尔灭清洗后入孵化箱，在温度为37.4℃和相对温度为60%的环境条件下孵化。孵化时种蛋大头朝上且每2h翻蛋一次[8]。第8天用照蛋器检出活胚，弃除未受精、壳钙化不全及气室异位蛋。第10天用牙科钻钻开一小口，无菌条件下进行气室内壳膜表面给药和溶蜡封口，继续培养至采血时间。
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1.2.2 实验分组和采血 实验分叶酸组、HCY组和叶酸+HCY组，每蛋注射剂量为叶酸5μg、HCY8μ mol(均为新鲜配制)，注射体积均为25 μl/蛋。采血时间：三组均为0、30、60、120、240和480min，每时间组8～10个鸡胚。采血方法：外壳用酒精消毒后，迅速用钟表镊子小心剥脱气室上面的全部卵壳，然后向对侧揭开内壳膜，暴露富含血管网的尿囊与绒毛膜结合而成的尿绒膜(主要采血部位)，眼科剪剪开细小动脉，用抗凝处理过的尖细嘴吸管收集血液；根据需要可打开胚胎心脏和颈动脉，继续采血；然后将血滴至具有采血环标志的纸血片上，每环用血量为60μl。血片经室温自然风干，干燥后的血片装入含有干燥剂的塑料袋内，-20℃保存待测。
1.3 微生物法测定纸血片血红蛋白叶酸盐
1.3.1 基本原理 检测用微生物为乳酸杆菌(NCIB 10463)，该菌生长依赖于叶酸的存在，其生长速度与叶酸含量相关。选择样品血红蛋白校正血液叶酸含量，因血液叶酸和血红蛋白关系是恒定的。
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1.3.2 叶酸盐和血红蛋白提取 用打孔器从纸血片血滴上打下完整的3个血环(每片约含全血12μl)作为一个样品，按1∶20比例用0.5%抗坏血酸/0.1%Triton洗脱液浸泡并超声洗脱(30℃，60min)，倾出提取液，弃去纸片。
1.3.3 血红蛋白叶酸盐含量计算法 96孔板微生物法检测纸血片提取液叶酸盐含量，紫外分光光度计535nm下检测出血红蛋白含量。检测结果为血红蛋白叶酸盐，计算公式为：
血红蛋白叶酸盐(μg/g)=
2 结果与讨论
2.1 外源性FA对10日龄鸡胚血红蛋白叶酸盐的影响
图1显示，10日龄胚胎经内壳膜滴注60min后，血红蛋白叶酸盐水平达最高峰(P<0.05)，然后随时间延长而呈持续性下降趋势，该结果与Rosenquist TH等人测定12天龄鸡胚血清叶酸盐水平的结果基本一致[9]。血清叶酸盐主要反映机体近期叶酸摄入水平，而纸血片血红蛋白叶酸盐能综合反映叶酸近期摄入量及机体储备水平[1，10]。
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图1 外源性FA(5μg/胚胎)致胚胎血红蛋白
叶酸盐水平变化(n=53)
2.2 外源性HCY对10日龄鸡胚血红蛋白叶酸盐的影响
图2显示，在HCY的刺激下，30min时血红蛋白叶酸盐水平升高1.9倍；120min时升高2.65倍，总体上看呈现波浪状变化，经方差分析各时间组均数间无统计学意义(F=2.334,P=0.0674)。
图2 外源性HCY(8μmol/胚胎)致胚胎血红蛋白
叶酸盐变化(n=69)
2.3 FA与HCY联合对10日龄鸡胚血红蛋白叶酸盐的影响
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图3和表1显示，联合给药60min时，HCY能明显降低外源性FA所致胚胎血红蛋白叶酸盐水平(P<0.01)；120min后，与单纯叶酸组类同，呈现持续性缓慢下降趋势。HCY致血红蛋白叶酸盐含量降低的原因可能是HCY复甲基化形成甲硫氨酸的过程中要消耗叶酸和VB12的结果[1]。
图3 FA(5μg/胚胎)和HCY 8μmol/胚胎联合致胚胎
血红蛋白叶酸盐水平变化(n=48)
表1 10日龄鸡胚血红蛋白叶酸盐水平的动态变化
(叶酸盐/Hb=μg/g,
±s) t/min, 百拇医药
FA(5μg/胚胎)
HCY
(8μmol/胚胎)
HCY+FA
(8μmol+5μg/胚胎)
0
2.83±0.85
2.83±0.85
2.83±0.85
30
10.86±5.76
5.38±0.05
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10.94±2.63
60
22.26±9.98
4.32±2.24
11.82±3.24
120
13.03±4.62
7.50±2.18
8.81±1.98
240
9.52±2.64
3.01±1.99
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8.95±3.40
480
7.74±1.46
5.87±2.43
5.72±3.28
P值
<0.001
>0.05
<0.001
2.4 实验方法的验证及优缺点
本研究结果和预实验结果完全一致。例如：每胚胎给FA5μg后，其血红蛋白叶酸盐测定最大值均发生在60min组，叶酸盐/血红蛋白分别为22.26μg/g和20.45μg/g(P>0.05)。给予致畸剂量的HCY (8μmol/胚胎)在实验时程范围(0～480min)对10日龄鸡胚的生长发育、胚胎外膜血管分化等均无肉眼可见的损害作用，胚胎发育良好。10日龄胚胎的实际采血率为90%(因内壳膜血管发育和分布存在个体差异所致)，尿绒膜血管采血量约为(100±20)μl/胚胎，完全能满足纸血片法所需的血量(60μl)。此外，在采血过程中，揭开的内壳膜要保持一定的倾斜角，这样可最大限度的减少尿囊液混入所采血液中。实践证明，我们建立的微量血采集方法，适于探讨胚胎的药(毒)代动力学和生化功能。具有花费低且实验周期短；易获得较好的剂量-反应关系；实际操作简单易行等优点。主要缺点是：本实验方法不适于检测早期鸡胚(<9天龄)的药代动力学且忽略了母体-胎盘-胚胎相互关系。
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目前，我们已用鸡胚微量血采集方法制备了数百个胚胎的全血血浆和血清样品，拟用PCR法研究与叶酸代谢密切相关的胱硫脒合成酶和5，10-亚甲基四氢叶酸还原酶等基因的表达情况，用HPLC法探讨血浆HCY的时程代谢变化，应用免疫学方法探讨血清HCY-2抗原的水平，为最终解决与叶酸和HCY有关疾病的发病机理和防治提供基础科学依据。
* 国家“863”计划(No.102100304)和国家自然科学基金资助项目(No.39870697)
作者简介：李勇，男，博士，副研究员
参考文献
1 Bailey LB. Folate in health and disease. New York: Marcel Dekken Inc, 1995
, 百拇医药
2 Fleming A, Copp AJ. Embryonic folate metabolism and mouse neural tube defects. Science, 1998,280:2107—2109
3 Appling DR. Compartmentation of folate-mediated one-carbon metabolism in eukaryotes. FASEB J, 1991,5:2645—2651
4 Mills JL, Scott JM, Kirke PN, et al. Homocysteine and neural tube defects. J Nutr.1996,126:7565—7605
5 Molulsky AG. Nutritional ecogenetics: homocysteine-related arteriosclerotic vascular disease, neural tube defects, and folic acid. AM J Hum Genet. 1996,58:17—20
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6 Tremlath D, Sherbondy A, Vandyke D, et al. Analysis of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase(MTHFR) as a candidate gene for neural tube defects (NTDs). Teratology.1997,55:41
7 Bjorke MAL, Ueland PM, Schneede J, et al. Elevated plasma total homocysteine and C677T mutation of the methylenetetrahydrofolate reductase gene in patients with spina bifida. QJM, 1997, 90:593—598
8 张天荫.动物胚胎学.济南：山东科学技术出版社，1996.23
, 百拇医药
9 Rosenquist TH, Ratashak SA, Selhub J. Homocysteine induces congenital defects of the heart and neural tube: effect of folic acid. Proc Natl Acad Sci USA， 1996，93:15227—15232
10 O'Broin SD, Kelleher BP, Gunter EW.Evaluation of factors influencing precision in the analysis of samples taken from blood spots on filter paper. Clin Lab Haem, 1995,17:185—188
1998-09-27收稿, 百拇医药