反相高效液相色谱法测定化妆品中性激素*
作者：王骏 胡俊明 冯朝华
单位：王骏 胡俊明 冯朝华(中国预防医学科学院环境卫生监测所，北京 100021)
关键词：高效液相色谱法；化妆品；性激素
卫生研究990113 摘要 采用反相高效液相色谱法测定化妆品中雌三醇等7种性激素，以Zorbax C18为固定相，甲醇-水(80+20)为流动相，检测波长为254nm，样品用甲醇超声提取，回收率为86.6%～104.4%，相对标准偏差为1.2%～5.8%。
中图分类号 TQ658 Q579.1 R168
Determination of sexual hormones in cosmetics by using Re-HPLC method
, http://www.100md.com
Wang Jun, Hu Junming, Feng Chaohua
Institute of Environmental Health Monitoring, Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100021,China
A Re-HPLC method for the determination of seven kinds of sexual hormones, such as estriol in cosmetics was established. Zorbax C18 and Methanol-water were used as solid phase and liquid phase respectively. Methanol was used to extract the hormones in samples using a ultrasonic method. In the background with cosmetic samples, the relative standard deviations of those seven kinds of added sexual hormones were 1.2%～4.4% at low concentration and 2.1%～5.8% at high concentration. The recoveries rates of those hormones were 87.7%～103.1% and 86.6%～104.4%, respectively.
, 百拇医药
Key words:re-HPLC, cosmetics, sexual hormones
天然激素是一种量微而生理活性很强的有机化合物，添加于化妆品中可促进毛发生长，防治皮肤老化，有除皱、增加皮肤弹性之功效，但含激素的化妆品有一定的致癌性，长期使用影响人的身体健康。我国化妆品卫生标准GB7916-87中规定激素为禁用物质，为了保障消费者身体健康，我们参照文献建立了反相高效液相色谱法对7种性激素进行定性、定量分析的方法[1]。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器 SP8810高效液相色谱仪；SP100可变波长紫外检测器；SP积分仪；超声波清洗器(Cole-Parmer8891)。
1.1.2 试剂 本法所用试剂除另有说明外，均为优级纯试剂。所用水为去离子水。甲醇；饱和氯化钠溶液；环己烷；硫酸溶液[φ(H2SO4)=2%]。
, 百拇医药
激素标准溶液：通过称量、稀释，最后配成的混合溶液的浓度为：四种雌性激素(雌三醇、雌酮、己烯雌酚、雌二醇)1.0mg/ml、两种雄性激素(睾丸酮、甲基睾丸酮)30μg/ml、孕激素(黄体酮)30μg/ml。
1.2 色谱条件
色谱柱：Zorbax C18柱，4.6mm i.d.×250mm；流动相：甲醇+水=80+20；流速：1.0ml/min；柱温：室温；检测波长254nm；灵敏度：0.02AUFS。
1.3 实验步骤
1.3.1 样品处理[2] 液体样品：准确称取1～2g样品于10.0ml比色管中，在水浴上挥去溶剂，用甲醇稀释到10.0ml备用。
膏状、乳状样品：准确称取1～2g样品于100ml锥形瓶中，在水浴上挥去溶剂，分别加入50ml饱和氯化钠溶液，2ml硫酸溶液，振荡溶解后转移至100ml分液漏斗中，以30ml环己烷分三次萃取(必要时离心分离)，合并环己烷，在水浴上挥干。用甲醇溶解残留物，转移到10ml比色管中，用甲醇稀释到刻度备用。
, 百拇医药
1.3.2 标准曲线 取激素标准使用溶液1.0、2.0、5.0ml于10ml比色管中，加甲醇至刻度，取5μl进样测定，以各激素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制各激素的标准曲线。通过计算可知，各激素的回归方程的相关系数为0.9995～0.9999，满足测定要求。
2 结果与讨论
2.1 精密度和回收率
以化妆品作为本底，加入高低两种浓度的各种性激素，按照实验条件和步骤测定其精密度及回收率，6次测定的结果见附表。附表 精密度及回收率测定结果(n=6) 激素名称
测 定 值(μg/ml)
±s
(μg/ml)
, 百拇医药
RSD
(%)
回收率
范围(%)
1
2
3
4
5
6
雌三醇
低浓度
152.5
140.6
, 百拇医药
148.9
155.7
151.1
145.0
149.0±5.4
3.6
88.6～102.0
高浓度
455.7
465.9
473.2
483.1
470.5
, http://www.100md.com
460.3
468.1±9.8
2.1
87.8～101.0
雌 酮
低浓度
150.7
144.8
153.7
143.5
146.8
151.2
148.4±4.0
, http://www.100md.com
2.7
87.7～103.0
高浓度
448.9
460.3
473.6
457.7
477.1
480.6
466.4±12.5
2.7
89.2～99.6
, 百拇医药 己烯雌酚
低浓度
143.1
147.5
153.8
146.9
151.8
150.4
148.9±3.9
2.6
92.2～99.2
高浓度
461.2
, http://www.100md.com
476.8
440.2
489.9
468.1
457.7
465.6±17.0
3.7
90.2～104.0
雌二醇
低浓度
138.9
151.3
146.4
, 百拇医药
156.6
141.9
149.0
147.4±6.4
4.3
87.8～93.4
高浓度
470.0
487.6
466.1
460.1
445.5
458.8
, 百拇医药
464.7±14.0
3.0
86.6～102.0
睾丸酮
低浓度
3.11
2.97
2.90
2.99
3.06
2.95
3.00±0.08
2.5
, 百拇医药
86.2～96.9
高浓度
13.11
11.87
12.79
13.56
14.13
13.06
13.09±0.76
5.8
87.5～103.0
甲基睾丸酮
, 百拇医药 低浓度
3.17
3.10
2.92
2.88
3.09
3.12
3.05±0.12
3.9
89.1～98.7
高浓度
12.83
12.05
, 百拇医药
13.55
12.78
14.10
13.27
13.10±0.71
5.4
89.3～103.0
黄体酮
低浓度
5.86
5.97
6.05
5.93
, 百拇医药
6.03
5.95
5.96±0.07
1.2
88.0～95.5
高浓度
13.66
13.18
12.47
14.08
13.23
13.89
13.42±0.58
, 百拇医药
4.3
90.0～104.0
结果表明各激素的相对标准偏差范围是：低浓度为1.2%～4.4%，高浓度为2.1%～5.8%，回收率范围是：低浓度为87.7%～103.1%，高浓度为86.6%～104.4%，满足实验室测定要求。
2.2 讨论
实验中我们用甲醇和水的混合液作为流动相，并对其不同配比进行了实验，即在甲醇+水=60+40、70+30、80+20、90+10条件下进行测定，根据出峰情况，综合考虑灵敏度和分离度等因素，最后确定流动相为甲醇+水=80+20，该流动相既容易配制，又能保证各激素很好的分离，且出峰时间较为适中。混合标准出峰情况见附图。
, 百拇医药 附图 混合标准色谱图
1 雌三醇 2 雌酮 3 乙烯雌酚 4 雌二醇 5 睾丸酮
6 甲基睾丸酮 7 黄体酮
雌激素都带有苯环，在240nm和280nm有较强紫外吸收，为了同时测定的需要，实验中选择254nm作为最佳检测波长。
激素多不溶于水而溶于醇、醚、烷等有机溶剂。加入氯化钠起盐析作用，以便于环己烷从酸性样品混合物中萃取性激素。
*卫生部科研基金资助项目(化妆品卫生化学检验标准方法制定)
作者简介：王骏，男，大学，助理研究员
参考文献
1 郑星泉主编.化妆品卫生检验.天津：天津大学出版社，1994.206-226
2 王鹏.化妆品中雌二醇和雌酮的萃取净化.中国公共卫生，1993，46-48
1998-06-07收稿, 百拇医药
单位：王骏 胡俊明 冯朝华(中国预防医学科学院环境卫生监测所，北京 100021)
关键词：高效液相色谱法；化妆品；性激素
卫生研究990113 摘要 采用反相高效液相色谱法测定化妆品中雌三醇等7种性激素，以Zorbax C18为固定相，甲醇-水(80+20)为流动相，检测波长为254nm，样品用甲醇超声提取，回收率为86.6%～104.4%，相对标准偏差为1.2%～5.8%。
中图分类号 TQ658 Q579.1 R168
Determination of sexual hormones in cosmetics by using Re-HPLC method
, http://www.100md.com
Wang Jun, Hu Junming, Feng Chaohua
Institute of Environmental Health Monitoring, Chinese Academy of Preventive Medicine,Beijing 100021,China
A Re-HPLC method for the determination of seven kinds of sexual hormones, such as estriol in cosmetics was established. Zorbax C18 and Methanol-water were used as solid phase and liquid phase respectively. Methanol was used to extract the hormones in samples using a ultrasonic method. In the background with cosmetic samples, the relative standard deviations of those seven kinds of added sexual hormones were 1.2%～4.4% at low concentration and 2.1%～5.8% at high concentration. The recoveries rates of those hormones were 87.7%～103.1% and 86.6%～104.4%, respectively.
, 百拇医药
Key words:re-HPLC, cosmetics, sexual hormones
天然激素是一种量微而生理活性很强的有机化合物，添加于化妆品中可促进毛发生长，防治皮肤老化，有除皱、增加皮肤弹性之功效，但含激素的化妆品有一定的致癌性，长期使用影响人的身体健康。我国化妆品卫生标准GB7916-87中规定激素为禁用物质，为了保障消费者身体健康，我们参照文献建立了反相高效液相色谱法对7种性激素进行定性、定量分析的方法[1]。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
1.1.1 仪器 SP8810高效液相色谱仪；SP100可变波长紫外检测器；SP积分仪；超声波清洗器(Cole-Parmer8891)。
1.1.2 试剂 本法所用试剂除另有说明外，均为优级纯试剂。所用水为去离子水。甲醇；饱和氯化钠溶液；环己烷；硫酸溶液[φ(H2SO4)=2%]。
, 百拇医药
激素标准溶液：通过称量、稀释，最后配成的混合溶液的浓度为：四种雌性激素(雌三醇、雌酮、己烯雌酚、雌二醇)1.0mg/ml、两种雄性激素(睾丸酮、甲基睾丸酮)30μg/ml、孕激素(黄体酮)30μg/ml。
1.2 色谱条件
色谱柱：Zorbax C18柱，4.6mm i.d.×250mm；流动相：甲醇+水=80+20；流速：1.0ml/min；柱温：室温；检测波长254nm；灵敏度：0.02AUFS。
1.3 实验步骤
1.3.1 样品处理[2] 液体样品：准确称取1～2g样品于10.0ml比色管中，在水浴上挥去溶剂，用甲醇稀释到10.0ml备用。
膏状、乳状样品：准确称取1～2g样品于100ml锥形瓶中，在水浴上挥去溶剂，分别加入50ml饱和氯化钠溶液，2ml硫酸溶液，振荡溶解后转移至100ml分液漏斗中，以30ml环己烷分三次萃取(必要时离心分离)，合并环己烷，在水浴上挥干。用甲醇溶解残留物，转移到10ml比色管中，用甲醇稀释到刻度备用。
, 百拇医药
1.3.2 标准曲线 取激素标准使用溶液1.0、2.0、5.0ml于10ml比色管中，加甲醇至刻度，取5μl进样测定，以各激素浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制各激素的标准曲线。通过计算可知，各激素的回归方程的相关系数为0.9995～0.9999，满足测定要求。
2 结果与讨论
2.1 精密度和回收率
以化妆品作为本底，加入高低两种浓度的各种性激素，按照实验条件和步骤测定其精密度及回收率，6次测定的结果见附表。附表 精密度及回收率测定结果(n=6) 激素名称
测 定 值(μg/ml)
±s(μg/ml)
, 百拇医药
RSD
(%)
回收率
范围(%)
1
2
3
4
5
6
雌三醇
低浓度
152.5
140.6
, 百拇医药
148.9
155.7
151.1
145.0
149.0±5.4
3.6
88.6～102.0
高浓度
455.7
465.9
473.2
483.1
470.5
, http://www.100md.com
460.3
468.1±9.8
2.1
87.8～101.0
雌 酮
低浓度
150.7
144.8
153.7
143.5
146.8
151.2
148.4±4.0
, http://www.100md.com
2.7
87.7～103.0
高浓度
448.9
460.3
473.6
457.7
477.1
480.6
466.4±12.5
2.7
89.2～99.6
, 百拇医药 己烯雌酚
低浓度
143.1
147.5
153.8
146.9
151.8
150.4
148.9±3.9
2.6
92.2～99.2
高浓度
461.2
, http://www.100md.com
476.8
440.2
489.9
468.1
457.7
465.6±17.0
3.7
90.2～104.0
雌二醇
低浓度
138.9
151.3
146.4
, 百拇医药
156.6
141.9
149.0
147.4±6.4
4.3
87.8～93.4
高浓度
470.0
487.6
466.1
460.1
445.5
458.8
, 百拇医药
464.7±14.0
3.0
86.6～102.0
睾丸酮
低浓度
3.11
2.97
2.90
2.99
3.06
2.95
3.00±0.08
2.5
, 百拇医药
86.2～96.9
高浓度
13.11
11.87
12.79
13.56
14.13
13.06
13.09±0.76
5.8
87.5～103.0
甲基睾丸酮
, 百拇医药 低浓度
3.17
3.10
2.92
2.88
3.09
3.12
3.05±0.12
3.9
89.1～98.7
高浓度
12.83
12.05
, 百拇医药
13.55
12.78
14.10
13.27
13.10±0.71
5.4
89.3～103.0
黄体酮
低浓度
5.86
5.97
6.05
5.93
, 百拇医药
6.03
5.95
5.96±0.07
1.2
88.0～95.5
高浓度
13.66
13.18
12.47
14.08
13.23
13.89
13.42±0.58
, 百拇医药
4.3
90.0～104.0
结果表明各激素的相对标准偏差范围是：低浓度为1.2%～4.4%，高浓度为2.1%～5.8%，回收率范围是：低浓度为87.7%～103.1%，高浓度为86.6%～104.4%，满足实验室测定要求。
2.2 讨论
实验中我们用甲醇和水的混合液作为流动相，并对其不同配比进行了实验，即在甲醇+水=60+40、70+30、80+20、90+10条件下进行测定，根据出峰情况，综合考虑灵敏度和分离度等因素，最后确定流动相为甲醇+水=80+20，该流动相既容易配制，又能保证各激素很好的分离，且出峰时间较为适中。混合标准出峰情况见附图。
, 百拇医药 附图 混合标准色谱图
1 雌三醇 2 雌酮 3 乙烯雌酚 4 雌二醇 5 睾丸酮
6 甲基睾丸酮 7 黄体酮
雌激素都带有苯环，在240nm和280nm有较强紫外吸收，为了同时测定的需要，实验中选择254nm作为最佳检测波长。
激素多不溶于水而溶于醇、醚、烷等有机溶剂。加入氯化钠起盐析作用，以便于环己烷从酸性样品混合物中萃取性激素。
*卫生部科研基金资助项目(化妆品卫生化学检验标准方法制定)
作者简介：王骏，男，大学，助理研究员
参考文献
1 郑星泉主编.化妆品卫生检验.天津：天津大学出版社，1994.206-226
2 王鹏.化妆品中雌二醇和雌酮的萃取净化.中国公共卫生，1993，46-48
1998-06-07收稿, 百拇医药