烟草甲基亚硝胺吡啶基丁酮诱发HPV-18永生化人类支气管上皮细胞恶性转化
作者：孙红琰 龚诒芬 王全立 陈君石 杨陟华 杜芝燕
单位：军事医学科学院输血研究所，北京 100850
关键词：烟草；甲基亚硝胺吡啶基丁酮；人类支气管上皮细胞；恶性转化
摘要 观察了烟草特异亚硝胺NNK诱发HPV摘要 观察了烟草特异亚硝胺NNK诱发HPV-18永生化人类支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化过程中细胞生物学特征的变化。500mg/L NNK处理BEP2D细胞一天后，细胞在体外可连续传代，第5代细胞显示抗血清生长；第15代细胞在半固体琼脂中的集落形成率(0.038%))为对照细胞(0.0033%)的11倍；第25代细胞在裸鼠体内成瘤，组织学证实为高分化鳞状细胞癌。以上结果表明NNK致BEP2D细胞恶性转化是一种多阶段的发展过程。该培养体系为深入研究人类支气管上皮细胞多阶段癌变的细胞和分子机制提供了一种理想的生物材料。
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中图分类号 R734.2 S572 TS411
Malignant transformation of HPV-18 immortalized human bronchial epithelial cells induced by tobacco-specific nitrosamine NNK
Sun Hongyan, Gong Yifen, Wang Quanli, Chen Junshi,et al.
Institute of Transfusion, Beijing 100850, China
The malignant transformation of HPV-18 immortalized human bronchial epithelial cell(BEP2D) induced by tobacco-specific nitrosamine NNK and its biological characteristics were investigated. BEP2D cells treated with NNK at the concentration of 500 μg/ml for 24 hours could be subcultured continuously in vitro. The 15th passage cells in soft agar (0.038%) increased 11 fold compared with that of control cells (0.0033%). The 25th passage cells could grow into tumor in nude mice. The tumor was a squamous cell carcinoma in morphology confirmed by histopathological examination. The results indicated that the malignant transformation induced by NNK was a sequential process. This culture system provides a potential tool for the study of cell and molecular mechanism in the multistage carcinogenesis of human bronchial epithelial cells.
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Key words:tobacco-specific nitrosamine NNK, immortalized human bronchial epithelial cell, malignant transformation
人类80%～90%的肺癌发生与吸烟有关。在目前已明确的五十多种烟草致癌物中，甲基亚硝胺吡啶基丁酮(NNK)含量多、致癌力强，是一种颇具代表性的烟草特异致癌物，被广泛应用于有关烟草致癌的研究。支气管上皮细胞是NNK代谢活化的主要场所及肺癌发生的重要起源，因此，支气管上皮细胞体外培养是研究NNK致肺癌机理的重要手段。近年来，为便于实验结果的外推，国内外先后建立了SV40、HPV-16和HPV-18永生化的多种人类支气管上皮细胞系[1，2]。由于HPV与人类呼吸系统的肿瘤发生关系密切，并和吸烟等有协同致癌效应[3，4]，因此，烟草特异性亚硝胺NNK诱发的HPV-18永生化人支气管上皮细胞系(BEP2D)恶性转化模型对于研究烟草致癌物与生物因素联合作用下人类肺癌的发生机理具有更重要的实际价值。
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1 材料与方法
1.1 材料
BEP2D细胞系由美国癌症研究所Harris教授馈赠；裸鼠(雄性，6周龄)购自卫生部生物制品检定所；NNK为chemsyn science lab.产品；LHC基础无血清培养液、细胞生长因子及所需无机元素的贮存液均购自美国Biofluid公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养与传代 BEP2D细胞用LHC-8完全培养液于37℃、5%CO2、95%湿度条件下培养，细胞大致按1.0×104/cm2密度接种。每2天换液一次，每4～6天传代一次。
1.2.2 细胞处理 处于指数生长期的BEP2D细胞在含有500μg/ml NNK的完全培养液中连续培养6小时，并以相应的BEP2D细胞平行传代培养作为对照细胞。
, 百拇医药
1.2.3 细胞的血清抗性试验 收获指数生长期p5代和相应的对照细胞，逐级稀释至每毫升60～70个细胞，分为2组。每组接种10皿，每组5皿，其中一组用含10%胎牛血清的LHC-8完全培养液培养，8天后中止实验。Giemsa染色，显微镜下计数细胞集落数。
1.2.4 软琼脂集落形成率测定 收集第10和15代细胞和相应的对照细胞，制备含细胞的0.35%琼脂糖液，并加到0.7%琼脂糖凝胶上，于37℃5%CO2和95%温度条件下培养。3周后，计算集落形成率。
1.2.5 裸鼠成瘤实验 收集NNK-500第p25代和对照BEP2D第38代细胞，在裸鼠脊柱左或右侧皮下注射，约8×106～10×106/部位，并观察裸鼠成瘤性。
2 结果
2.1 NNK-500细胞对血清促分化作用的抗性反应
, 百拇医药
BEP2D对照细胞仅能在无血清的培养体系中生长，NNK-500第5代细胞在含血清的培养液能够生长，其接种效率显著高于相应条件下的对照细胞的接种效率(表1)。
表1 NNK-500第5代细胞对血清促分化的抗性反应(1)
组别
细胞
培养液中含10%血清
接种效率(%)
1
BEP2D
-
15.0±2.0
, 百拇医药
2
BEP2D
+
1.6±0.9
3
NNK-500
-
8.6±2.0
4
NNK-500
+
11.0±1.1
注：(1)1与2组比较，P<0.001；2与4组比较，P<0.001；
, 百拇医药
1与3组比较，P<0.05；3与4组比较，P<0.05表2 NNK-500第15代细胞在半固体琼脂中集落形成率(1)
组别
皿数
集落形成率(%)
BEP2D
3
0.0033±0.0005
NNK-500
4
0.038 ±0.006
注：(1)P<0.001
, 百拇医药
表2结果显示，NNK-500组第15代细胞在半固体琼脂中的集落形成率比对照细胞高11.5倍，提示传至第15代的NNK-500细胞锚着独立性生长能力明显增强，已具有转化细胞的特性。
2.2 裸鼠成瘤性
3周后，接种NNK-500的一只裸鼠，观察到皮下结节(见附图)；而BEP2D对照细胞则未见结节的形成。组织病理学检查可见癌组织呈巢状排列，癌细胞呈多边形，核呈椭圆形，核大、深染，角化株多见，病理诊断为高分化鳞癌。
附图 NNK-500细胞在裸鼠体内成瘤的组织学观察(×100)
3 讨论
, 百拇医药
在致癌剂体外诱发细胞转化的实验模型中，靶细胞的选择是关键。90年代以来永生化的人类上皮细胞系已被广泛应用体外致癌的研究。在致癌剂诱发呼吸道上皮细胞癌变的研究领域里，人原代支气管上皮细胞，SV-40永生化的人支气管上皮细胞系(BEAS-2B)和HPV(16，18)永生化的人支气管上皮细胞分别建立并在高低LET辐射致突变和致癌中应用[5～7]。
本研究首选BEP2D细胞作为NNK致癌的靶细胞，其理由是：(1)人来源的支气管上皮细胞内富含p450代谢酶，是NNK代谢活化成为终致癌物所必需的条件；(2)BEP2D细胞是唯一由人类病毒转染后建立的永生化支气管上皮细胞系。在人类肺癌的发病过程中HPV感染者占一定比例。用此细胞作为靶，将环境中存在的生物与化学因素的联合作用有机地结合起来，在一定程度上模拟了人类致癌病毒感染后接触化学致癌剂的条件；(3)BEP2D细胞为近二倍体核型，在裸鼠体内无致瘤性，这对研究体外细胞癌变是至关重要的。
NNK诱发肺癌是一多步骤的发展过程，在烟草致癌物等各种环境致癌因素作用下，支气管上皮细胞增殖/鳞状分化过程的控制异常被认为是肺鳞癌多阶段发生过程中的重要步骤。本研究通过观察NNK诱发BEP2D恶性转化过程中细胞生物学特征的动态变化，发现对血清促分化作用的抗性反应是最早出现的细胞特性改变；随着传代次数的增加，第15代软琼脂集落形成率显著增高，说明转化细胞已初步表现出其恶性表型；25代细胞在接种裸鼠后可导致鳞癌的发生，表明细胞已经癌变。以上结果提示，NNK致BEP2D细胞恶性转化是一个渐进的发展过程。
, http://www.100md.com
总之，NNK诱发BEP2D细胞恶性转化模型为进一步探讨环境因素诱发人类支气管上皮细胞癌变的分子机理提供了理想的生物材料。
作者简介： 孙红琰，男，博士，助理研究员
龚诒芬 杨陟华 北京放射医学研究所，北京 100850
陈君石 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050
参考文献
[1] Willey JC.Immortalization of normal human bronchial epithelial cells by human papillomaviruses 16 or 18. Cancer Res, 1991, 51:5370—5377
[2] Reddel RR. Transformation of human bronchial epithelial cells by infection with Sv-40 or adenovirus-12 SV-40 hybrid virus, or transfection via strontium phosphate coprecipitation with a plasmid containing the SV-40 early region genes. Cancer Res, 1988, 48:1904—1909
, 百拇医药
[3] Syrjanen K. Human papillomavirus DNA in bronchial squamous cell carcinomas. Lancet, 1987, 1:168—169
[4] Bejui-Thivolet F. Detection of human papillomavirus DNA in bronchial metaplasia and squamous cell carcinomas of the lung by in situ hybridization using biotiny lated probes in paraffin-embedded speciman. Human Pathol, 1990, 21:111—116
[5] Hei TK. Malignant transformation of human bronchial epithelial cells by radon-simulated α-particles. Carcinogenesis, 1994, 15(3):431—437
, http://www.100md.com
[6] Suzuki K, Hei TK. Mutation induction in γ-irradiated primary human bronchial epithelial cells and molecular analysis of the HPRT-mutants. Mut Res, 1996, 349:33—41
[7] Hei Tk. Radon-induced neoplastic transformation of human bronchial epithelial cells. Radi Oncol Inv, 1996,3:398—404
(1998-08-12收稿), http://www.100md.com
单位：军事医学科学院输血研究所，北京 100850
关键词：烟草；甲基亚硝胺吡啶基丁酮；人类支气管上皮细胞；恶性转化
摘要 观察了烟草特异亚硝胺NNK诱发HPV摘要 观察了烟草特异亚硝胺NNK诱发HPV-18永生化人类支气管上皮细胞(BEP2D)恶性转化过程中细胞生物学特征的变化。500mg/L NNK处理BEP2D细胞一天后，细胞在体外可连续传代，第5代细胞显示抗血清生长；第15代细胞在半固体琼脂中的集落形成率(0.038%))为对照细胞(0.0033%)的11倍；第25代细胞在裸鼠体内成瘤，组织学证实为高分化鳞状细胞癌。以上结果表明NNK致BEP2D细胞恶性转化是一种多阶段的发展过程。该培养体系为深入研究人类支气管上皮细胞多阶段癌变的细胞和分子机制提供了一种理想的生物材料。
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中图分类号 R734.2 S572 TS411
Malignant transformation of HPV-18 immortalized human bronchial epithelial cells induced by tobacco-specific nitrosamine NNK
Sun Hongyan, Gong Yifen, Wang Quanli, Chen Junshi,et al.
Institute of Transfusion, Beijing 100850, China
The malignant transformation of HPV-18 immortalized human bronchial epithelial cell(BEP2D) induced by tobacco-specific nitrosamine NNK and its biological characteristics were investigated. BEP2D cells treated with NNK at the concentration of 500 μg/ml for 24 hours could be subcultured continuously in vitro. The 15th passage cells in soft agar (0.038%) increased 11 fold compared with that of control cells (0.0033%). The 25th passage cells could grow into tumor in nude mice. The tumor was a squamous cell carcinoma in morphology confirmed by histopathological examination. The results indicated that the malignant transformation induced by NNK was a sequential process. This culture system provides a potential tool for the study of cell and molecular mechanism in the multistage carcinogenesis of human bronchial epithelial cells.
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Key words:tobacco-specific nitrosamine NNK, immortalized human bronchial epithelial cell, malignant transformation
人类80%～90%的肺癌发生与吸烟有关。在目前已明确的五十多种烟草致癌物中，甲基亚硝胺吡啶基丁酮(NNK)含量多、致癌力强，是一种颇具代表性的烟草特异致癌物，被广泛应用于有关烟草致癌的研究。支气管上皮细胞是NNK代谢活化的主要场所及肺癌发生的重要起源，因此，支气管上皮细胞体外培养是研究NNK致肺癌机理的重要手段。近年来，为便于实验结果的外推，国内外先后建立了SV40、HPV-16和HPV-18永生化的多种人类支气管上皮细胞系[1，2]。由于HPV与人类呼吸系统的肿瘤发生关系密切，并和吸烟等有协同致癌效应[3，4]，因此，烟草特异性亚硝胺NNK诱发的HPV-18永生化人支气管上皮细胞系(BEP2D)恶性转化模型对于研究烟草致癌物与生物因素联合作用下人类肺癌的发生机理具有更重要的实际价值。
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1 材料与方法
1.1 材料
BEP2D细胞系由美国癌症研究所Harris教授馈赠；裸鼠(雄性，6周龄)购自卫生部生物制品检定所；NNK为chemsyn science lab.产品；LHC基础无血清培养液、细胞生长因子及所需无机元素的贮存液均购自美国Biofluid公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养与传代 BEP2D细胞用LHC-8完全培养液于37℃、5%CO2、95%湿度条件下培养，细胞大致按1.0×104/cm2密度接种。每2天换液一次，每4～6天传代一次。
1.2.2 细胞处理 处于指数生长期的BEP2D细胞在含有500μg/ml NNK的完全培养液中连续培养6小时，并以相应的BEP2D细胞平行传代培养作为对照细胞。
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1.2.3 细胞的血清抗性试验 收获指数生长期p5代和相应的对照细胞，逐级稀释至每毫升60～70个细胞，分为2组。每组接种10皿，每组5皿，其中一组用含10%胎牛血清的LHC-8完全培养液培养，8天后中止实验。Giemsa染色，显微镜下计数细胞集落数。
1.2.4 软琼脂集落形成率测定 收集第10和15代细胞和相应的对照细胞，制备含细胞的0.35%琼脂糖液，并加到0.7%琼脂糖凝胶上，于37℃5%CO2和95%温度条件下培养。3周后，计算集落形成率。
1.2.5 裸鼠成瘤实验 收集NNK-500第p25代和对照BEP2D第38代细胞，在裸鼠脊柱左或右侧皮下注射，约8×106～10×106/部位，并观察裸鼠成瘤性。
2 结果
2.1 NNK-500细胞对血清促分化作用的抗性反应
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BEP2D对照细胞仅能在无血清的培养体系中生长，NNK-500第5代细胞在含血清的培养液能够生长，其接种效率显著高于相应条件下的对照细胞的接种效率(表1)。
表1 NNK-500第5代细胞对血清促分化的抗性反应(1)
组别
细胞
培养液中含10%血清
接种效率(%)
1
BEP2D
-
15.0±2.0
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2
BEP2D
+
1.6±0.9
3
NNK-500
-
8.6±2.0
4
NNK-500
+
11.0±1.1
注：(1)1与2组比较，P<0.001；2与4组比较，P<0.001；
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1与3组比较，P<0.05；3与4组比较，P<0.05表2 NNK-500第15代细胞在半固体琼脂中集落形成率(1)
组别
皿数
集落形成率(%)
BEP2D
3
0.0033±0.0005
NNK-500
4
0.038 ±0.006
注：(1)P<0.001
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表2结果显示，NNK-500组第15代细胞在半固体琼脂中的集落形成率比对照细胞高11.5倍，提示传至第15代的NNK-500细胞锚着独立性生长能力明显增强，已具有转化细胞的特性。
2.2 裸鼠成瘤性
3周后，接种NNK-500的一只裸鼠，观察到皮下结节(见附图)；而BEP2D对照细胞则未见结节的形成。组织病理学检查可见癌组织呈巢状排列，癌细胞呈多边形，核呈椭圆形，核大、深染，角化株多见，病理诊断为高分化鳞癌。
附图 NNK-500细胞在裸鼠体内成瘤的组织学观察(×100)
3 讨论
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在致癌剂体外诱发细胞转化的实验模型中，靶细胞的选择是关键。90年代以来永生化的人类上皮细胞系已被广泛应用体外致癌的研究。在致癌剂诱发呼吸道上皮细胞癌变的研究领域里，人原代支气管上皮细胞，SV-40永生化的人支气管上皮细胞系(BEAS-2B)和HPV(16，18)永生化的人支气管上皮细胞分别建立并在高低LET辐射致突变和致癌中应用[5～7]。
本研究首选BEP2D细胞作为NNK致癌的靶细胞，其理由是：(1)人来源的支气管上皮细胞内富含p450代谢酶，是NNK代谢活化成为终致癌物所必需的条件；(2)BEP2D细胞是唯一由人类病毒转染后建立的永生化支气管上皮细胞系。在人类肺癌的发病过程中HPV感染者占一定比例。用此细胞作为靶，将环境中存在的生物与化学因素的联合作用有机地结合起来，在一定程度上模拟了人类致癌病毒感染后接触化学致癌剂的条件；(3)BEP2D细胞为近二倍体核型，在裸鼠体内无致瘤性，这对研究体外细胞癌变是至关重要的。
NNK诱发肺癌是一多步骤的发展过程，在烟草致癌物等各种环境致癌因素作用下，支气管上皮细胞增殖/鳞状分化过程的控制异常被认为是肺鳞癌多阶段发生过程中的重要步骤。本研究通过观察NNK诱发BEP2D恶性转化过程中细胞生物学特征的动态变化，发现对血清促分化作用的抗性反应是最早出现的细胞特性改变；随着传代次数的增加，第15代软琼脂集落形成率显著增高，说明转化细胞已初步表现出其恶性表型；25代细胞在接种裸鼠后可导致鳞癌的发生，表明细胞已经癌变。以上结果提示，NNK致BEP2D细胞恶性转化是一个渐进的发展过程。
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总之，NNK诱发BEP2D细胞恶性转化模型为进一步探讨环境因素诱发人类支气管上皮细胞癌变的分子机理提供了理想的生物材料。
作者简介： 孙红琰，男，博士，助理研究员
龚诒芬 杨陟华 北京放射医学研究所，北京 100850
陈君石 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050
参考文献
[1] Willey JC.Immortalization of normal human bronchial epithelial cells by human papillomaviruses 16 or 18. Cancer Res, 1991, 51:5370—5377
[2] Reddel RR. Transformation of human bronchial epithelial cells by infection with Sv-40 or adenovirus-12 SV-40 hybrid virus, or transfection via strontium phosphate coprecipitation with a plasmid containing the SV-40 early region genes. Cancer Res, 1988, 48:1904—1909
, 百拇医药
[3] Syrjanen K. Human papillomavirus DNA in bronchial squamous cell carcinomas. Lancet, 1987, 1:168—169
[4] Bejui-Thivolet F. Detection of human papillomavirus DNA in bronchial metaplasia and squamous cell carcinomas of the lung by in situ hybridization using biotiny lated probes in paraffin-embedded speciman. Human Pathol, 1990, 21:111—116
[5] Hei TK. Malignant transformation of human bronchial epithelial cells by radon-simulated α-particles. Carcinogenesis, 1994, 15(3):431—437
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[6] Suzuki K, Hei TK. Mutation induction in γ-irradiated primary human bronchial epithelial cells and molecular analysis of the HPRT-mutants. Mut Res, 1996, 349:33—41
[7] Hei Tk. Radon-induced neoplastic transformation of human bronchial epithelial cells. Radi Oncol Inv, 1996,3:398—404
(1998-08-12收稿), http://www.100md.com