彗星试验检测细胞凋亡的研究*
作者：李 蕊 衡正昌 张遵真
单位：华西医科大学公共卫生学院，成都 610041
关键词：彗星试验；细胞凋亡
摘要 彗星试验是近十年发展起来的在单细胞水平上检测DNA断裂的方法摘要 彗星试验是近十年发展起来的在单细胞水平上检测DNA断裂的方法，理论上可检测含有大量DNA碎片的凋亡细胞。本文在建立地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡模型的基础上，探索了彗星试验检测凋亡的实验方法，并与Giemsa染色、琼脂糖凝胶电泳、TUNEL法等几种常用的检测凋亡细胞的方法进行了比较研究。结果表明：凋亡细胞在彗星试验中呈现特征性的彗星形态，很小的彗星头，大而圆的彗星尾；以彗星试验检测细胞凋亡的最适电泳条件为20V，15min；其检测灵敏度与Giemsa染色法和TUNEL法相当。因此彗星试验是一种灵敏、准确、简便、既可定性又可定量检测细胞凋亡的新方法。
, http://www.100md.com
中图分类号 Q2-33
Detection of apoptotic cells by comet assay
Li Rui, Heng Zhengchang, Zhang Zunzhen
School of Public Health, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041， China
Comet assay is a method measuring DNA strand breaks on single cell level, which has been developed for about 10 years. Theoretically, apoptotic cells with extensive DNA internucleosomal fragments can be detected by this method. On the basis that apoptosis in immature mice thymocytes could be induced by dexamethasone(DEX), the detection of apoptotic cells by comet assay was studied and compared with agarose gel electrophoresis, morphological observations with Giemsa staining and TUNEL assay. Apoptotic cells showed a comet feature with a very small head, and a large and wide tail. The optimal conditions for electrophoresis in comet assay was 20 volt in 15 minutes. Comet assay is sensitive, valid, rapid and simple and is highly correlated with Giemsa staining and TUNEL assay in detecting apoptotic cells.
, 百拇医药
Key words: comet assay, apoptotic cell
目前凋亡细胞的检测主要有形态学观察法(Giemsa染色法、TUNEL法等)，琼脂糖凝胶电泳法，流式细胞检测法。这些方法各有其优缺点。彗星试验(comet assay)，又名单细胞凝胶电泳(Singel Cell Gel Electrophoresis, SCGE)1988年由Sigh及其同事加以完善，用于检测单细胞DNA断裂。彗星试验有其独特的优点：需样品量少，适用于任何真核细胞，方法灵敏、简便、快速[1]。因为细胞凋亡的特征是DNA链被切割成很小的片段，那么，能直接观察DNA断片出现的彗星试验检测凋亡细胞在理论上是可行的。本实验将以地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型，探索以彗星试验检测凋亡的实验方法，并与几种常用的检测凋亡细胞的方法进行比较，以期为凋亡细胞的检测提供新的手段。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 试剂
地塞米松磷酸钠(DEX)针剂，江苏方强药品厂生产；PBR322/HaeII Marker，华美生物制品公司生产，-20℃保存，临用前65℃变性5min；TUNEL药盒和成色反应液均为宝灵曼公司生产。
1.2 仪器
DYY-3型水平式电泳仪，北京市六一仪器厂生产；4XSJ-2荧光显微镜，重庆光学仪器厂生产。
1.3 小鼠胸腺细胞凋亡的诱导
BABL/C小鼠，雄性，4～6周龄，由华西医科大学实验动物中心提供。断颈法处死小鼠，胸腹部皮肤消毒后，开胸取下胸腺，D-Hanks液洗去血迹，用无菌眼科剪剪成小块，加入适量DMEM完全培养液，双层纱布过滤，细胞悬液分装于消毒的细胞培养瓶中，细胞浓度为1×107～2×107/ml。加入DEX，终浓度为0.1 μmol.L-1，37℃培养4小时后，收获细胞，离心，弃去上清液，0.5ml PBS重悬细胞。对照组不加DEX，其余步骤同前。
, 百拇医药
1.4 Giemsa染色法
细胞涂片，4%的甲醛固定30min，Giemsa染色10min，洗去多余的染液，光学显微镜下观察凋亡细胞，计算凋亡指数(凋亡细胞数/计数细胞总数)。
1.5 琼脂糖凝胶电泳法
0.1%蛋白酶K溶液消化细胞过夜，酚、氯仿、异戊醇抽提，盐和无水乙醇沉淀，12000r/min离心30min提取DNA，样品溶入20μl TE缓冲液(10mmol.L-1Tris-HCl, pH8.0， 0.2mol/L Na2EDTA)中，3μl RNase，37℃水浴30min，1.8%的琼脂糖进行凝胶电泳，观察DNA分带[2]。
1.6 彗星试验
按本实验室的改良方法[3]。混合于凝胶中的细胞经裂解、解旋、电泳后，溴化乙啶染色，荧光显微镜下观察凋亡细胞彗星形态，计算凋亡指数。
, 百拇医药
1.7 TUNEL法
经地塞米松诱导过的小鼠胸腺细胞离心、涂片，裂解、消化后，在TUNEL液、抗荧光素抗体中孵育，坚固红成色后，普通显微镜下观察[4]，计算凋亡指数。
统计方法：χ2检验。
2 结果与分析
2.1 细胞凋亡模型
10-7mol.L-1DEX作用于未成年小鼠胸腺细胞4小时后，经Giemsa染色，出现凋亡细胞特征性的形态学改变：细胞皱缩、核浓缩、聚集成团，染成深蓝色(图1)。
, http://www.100md.com
图1 Giemsa染色的小鼠胸腺凋亡细胞
A：对照，小鼠正常胸腺细胞；B：0.1 μmol.L-1DEX
诱导4小时的小鼠胸腺细胞，箭头示凋亡细胞
图2 小鼠胸腺凋亡细胞的DNA分带
A：Marker:PBR322/HaeⅢ，片段长度为587-434、267-184、124-8bp；B：小鼠胸腺细胞，阴性对照；C：0.1μmol.L-1DEX诱导的小鼠胸腺细胞
琼脂糖凝胶电泳结果，对照组小鼠胸腺细胞的DNA未迁移，DEX诱导过的胸腺细胞出现凋亡细胞特征性的DNA“梯”状带(图2)，证实DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡成功。
, http://www.100md.com
2.2 彗星试验检测凋亡细胞
2.2.1 凋亡细胞的彗星形态 0.1μmol.L-1DEX作用于小鼠胸腺细胞4小时后，进行彗星试验，只观察到两种细胞：凋亡细胞，彗星形态几乎一致，很小的彗星头，长而大的彗星尾；正常淋巴细胞，圆形，无拖尾(图3)。
2.2.2 彗星试验检测凋亡细胞的最适宜条件 电压、电泳时间对于彗星试验的结果影响较大。电压高，电泳时间要短，电压低，电泳时间要长。凋亡细胞彗星出现所需电泳时间要比常规条件短：25V时，2min就有部分凋亡细胞的彗星形态可以辨认(表1)。在实验中还发现，如果电泳时间太长，凋亡细胞DNA将迁移很远，头与尾分开很长一段距离。又由于凋亡细胞头很小，彗星尾荧光染色很淡，与背景不好区分，降低了凋亡细胞的检出率。结合本实验室实际，建议用电压20V，电泳15min作为凋亡细胞的彗星试验电泳条件。
表1 不同电泳时间、电压下观察到的小鼠胸腺细胞凋亡指数 %
, http://www.100md.com
电压
(V)
电泳时间(min)
2
5
10
15
20
25
15
0
0
0
25.6
, http://www.100md.com
84.5(1)
81.7(1)
20
0
0
0
81.6
85.0
81.0
25
19.4
80.3(2)
, http://www.100md.com
87.0(2)
83.6(2)
—(3)
—
(1)与15V、15min组相比，P<0.05 (2)与25V、2min组相比，P<0.05 (3)—：细胞拖尾难于辨认
图3 小鼠胸腺凋亡细胞的彗星形态
A：正常淋巴细胞 B：凋亡细胞
2.3 彗星试验与Giemsa染色法
, 百拇医药
用不同浓度DEX诱导的小鼠胸腺细胞进行彗星试验，所得的凋亡指数与同时所做的Giemsa染色所得的凋亡指数相比，有很好的一致性(图4)。在阴性组，Giemsa染色显示正常淋巴细胞，琼脂糖凝胶电泳未见特殊的“梯”时，彗星实验也几乎观察不到特征性的拖尾细胞。在0.01 μmol.L-1DEX浓度，彗星试验检测到的凋亡指数为1.5%，Giemsa染色为1%，两者差异无显著性(P>0.05)。
图4 不同浓度DEX诱导的小鼠胸腺细胞凋亡指数
2.4 TUNEL法
是目前检测凋亡细胞常用的敏感的方法，0.1μmol.L-1DEX诱导小鼠胸腺细胞4小时后，凋亡细胞被染成深红色。凋亡指数为61.9%，彗星试验检测所得凋亡指数为64%，两者差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
3 讨论
细胞凋亡(apoptosis)，又名程序性细胞死亡，是一种细胞在内在基因调控下主动自杀的过程。已有资料表明，钙、锌等营养元素以及高温、辐射、尼古丁等理化因素可明显影响细胞凋亡，而后者又与恶性肿瘤、AIDS、中枢神经系统退行性疾病等的防治有着极为密切的关系[5，6]。因此，在预防医学研究中开展凋亡细胞的早期检测是十分重要的。
细胞凋亡的机理尚未完全阐明，但已知其最后的共同通道是激活了一种Ca2+-Mg2+依赖性核酸内切酶，把DNA链切割成180～200bp整数倍的片段。从理论上说，以不同诱因和不同靶细胞诱导的凋亡细胞在彗星试验中的表现应该是一致的。本实验所观察到的凋亡细胞的彗星形态与O1ive等用γ射线诱导的TK6凋亡细胞一致[4]。因此，本文用彗星试验检测DEX诱导的小鼠胸腺凋亡细胞的方法，应该适用于其他因素诱导的各种哺乳动物的凋亡细胞。
, http://www.100md.com
本研究结果表明，彗星试验检测细胞凋亡的灵敏度与Giemsa法和TUNEL法相近，说明彗星试验是检测细胞凋亡的灵敏方法之一。与已广泛应用的检测细胞凋亡的方法相比，彗星试验检测凋亡还具有如下优点：首先，它是一种既可定性又可定量分析的方法。以DEX诱导并经Giemsa染色法和琼脂糖凝胶电泳确定的凋亡细胞在彗星试验中呈现特征性的彗星形态(图3)，与DNA断裂剂诱发的彗星细胞易于区别(将另文报道)；同时彗星试验中的凋亡细胞与正常细胞也极易区别，便于记录凋亡细胞在某一细胞群体中的出现率。与之相比，琼脂糖凝胶电泳只能定性说明是否有凋亡细胞存在，而不能反应凋亡细胞出现的比例。TUNEL法是近年来发展起来的利用免疫组化原位标记DNA断端的方法，可以检测含有大量DNA双链断裂的凋亡细胞。但是对DNA断端的标记没有选择性，DNA断裂剂引起的细胞DNA断端(并非凋亡)，TUNEL法仍能标记上，因此会产生假阳性结果[7]。其次，彗星试验是一种准确、直观的方法。彗星试验利用电场的作用使DNA碎片迁移出去，形成一个个“彗星”尾，正常细胞则不拖尾。比起主要以观察核染色变化的Giemsa染色法和TUNEL法来说，要容易得多，观察者无需专门经验即可准确判断结果。而且，它是从DNA水平来观察凋亡细胞的变化。
, 百拇医药
综上所述，彗星试验是一种灵敏、准确、简便、既可定性又可定量检测细胞凋亡的新方法。
* 国家自然科学基金资助项目(39670625)
作者简介：李蕊，女，硕士，医师
参考文献
[1] Fairbairn D W. Comet assay, a comprehensive view. Mut Res, 1995, 339: 37-59
[2] 姜 泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996.176-177
[3] 衡正昌，张遵真.二氯胺基酚对V79细胞DNA损伤效应的研究.卫生毒理学杂志，1997，11(2)： 89-91
, 百拇医药
[4] Wojciech G, Gong JP. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays. Cancer Res, 1993， 53： 1945-1951
[5] Wyllie AH, Morris RG. Chromatin cleavage in apoptosis: association with condensed chromatin morphology and dependence on macromolecular synthesis. J Pathol, 1984, 142： 67-77
[6] 李正银.细胞凋谢及其生物学作用与卫生学研究.国外医学卫生学分册，1995，22：1-4
[7] Grasl K B, Ruttkay N B, Koudelka H. In situ detection of fragmented DNA (TUNEL assay) fails to discriminete among apoptosis, necroses, and autolytic cell death: a cautiontry note. Hepatology, 1995, 21: 1465-1468
(1998-07-09收稿), 百拇医药
单位：华西医科大学公共卫生学院，成都 610041
关键词：彗星试验；细胞凋亡
摘要 彗星试验是近十年发展起来的在单细胞水平上检测DNA断裂的方法摘要 彗星试验是近十年发展起来的在单细胞水平上检测DNA断裂的方法，理论上可检测含有大量DNA碎片的凋亡细胞。本文在建立地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡模型的基础上，探索了彗星试验检测凋亡的实验方法，并与Giemsa染色、琼脂糖凝胶电泳、TUNEL法等几种常用的检测凋亡细胞的方法进行了比较研究。结果表明：凋亡细胞在彗星试验中呈现特征性的彗星形态，很小的彗星头，大而圆的彗星尾；以彗星试验检测细胞凋亡的最适电泳条件为20V，15min；其检测灵敏度与Giemsa染色法和TUNEL法相当。因此彗星试验是一种灵敏、准确、简便、既可定性又可定量检测细胞凋亡的新方法。
, http://www.100md.com
中图分类号 Q2-33
Detection of apoptotic cells by comet assay
Li Rui, Heng Zhengchang, Zhang Zunzhen
School of Public Health, West China University of Medical Sciences, Chengdu 610041， China
Comet assay is a method measuring DNA strand breaks on single cell level, which has been developed for about 10 years. Theoretically, apoptotic cells with extensive DNA internucleosomal fragments can be detected by this method. On the basis that apoptosis in immature mice thymocytes could be induced by dexamethasone(DEX), the detection of apoptotic cells by comet assay was studied and compared with agarose gel electrophoresis, morphological observations with Giemsa staining and TUNEL assay. Apoptotic cells showed a comet feature with a very small head, and a large and wide tail. The optimal conditions for electrophoresis in comet assay was 20 volt in 15 minutes. Comet assay is sensitive, valid, rapid and simple and is highly correlated with Giemsa staining and TUNEL assay in detecting apoptotic cells.
, 百拇医药
Key words: comet assay, apoptotic cell
目前凋亡细胞的检测主要有形态学观察法(Giemsa染色法、TUNEL法等)，琼脂糖凝胶电泳法，流式细胞检测法。这些方法各有其优缺点。彗星试验(comet assay)，又名单细胞凝胶电泳(Singel Cell Gel Electrophoresis, SCGE)1988年由Sigh及其同事加以完善，用于检测单细胞DNA断裂。彗星试验有其独特的优点：需样品量少，适用于任何真核细胞，方法灵敏、简便、快速[1]。因为细胞凋亡的特征是DNA链被切割成很小的片段，那么，能直接观察DNA断片出现的彗星试验检测凋亡细胞在理论上是可行的。本实验将以地塞米松诱导的小鼠胸腺细胞凋亡模型，探索以彗星试验检测凋亡的实验方法，并与几种常用的检测凋亡细胞的方法进行比较，以期为凋亡细胞的检测提供新的手段。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 试剂
地塞米松磷酸钠(DEX)针剂，江苏方强药品厂生产；PBR322/HaeII Marker，华美生物制品公司生产，-20℃保存，临用前65℃变性5min；TUNEL药盒和成色反应液均为宝灵曼公司生产。
1.2 仪器
DYY-3型水平式电泳仪，北京市六一仪器厂生产；4XSJ-2荧光显微镜，重庆光学仪器厂生产。
1.3 小鼠胸腺细胞凋亡的诱导
BABL/C小鼠，雄性，4～6周龄，由华西医科大学实验动物中心提供。断颈法处死小鼠，胸腹部皮肤消毒后，开胸取下胸腺，D-Hanks液洗去血迹，用无菌眼科剪剪成小块，加入适量DMEM完全培养液，双层纱布过滤，细胞悬液分装于消毒的细胞培养瓶中，细胞浓度为1×107～2×107/ml。加入DEX，终浓度为0.1 μmol.L-1，37℃培养4小时后，收获细胞，离心，弃去上清液，0.5ml PBS重悬细胞。对照组不加DEX，其余步骤同前。
, 百拇医药
1.4 Giemsa染色法
细胞涂片，4%的甲醛固定30min，Giemsa染色10min，洗去多余的染液，光学显微镜下观察凋亡细胞，计算凋亡指数(凋亡细胞数/计数细胞总数)。
1.5 琼脂糖凝胶电泳法
0.1%蛋白酶K溶液消化细胞过夜，酚、氯仿、异戊醇抽提，盐和无水乙醇沉淀，12000r/min离心30min提取DNA，样品溶入20μl TE缓冲液(10mmol.L-1Tris-HCl, pH8.0， 0.2mol/L Na2EDTA)中，3μl RNase，37℃水浴30min，1.8%的琼脂糖进行凝胶电泳，观察DNA分带[2]。
1.6 彗星试验
按本实验室的改良方法[3]。混合于凝胶中的细胞经裂解、解旋、电泳后，溴化乙啶染色，荧光显微镜下观察凋亡细胞彗星形态，计算凋亡指数。
, 百拇医药
1.7 TUNEL法
经地塞米松诱导过的小鼠胸腺细胞离心、涂片，裂解、消化后，在TUNEL液、抗荧光素抗体中孵育，坚固红成色后，普通显微镜下观察[4]，计算凋亡指数。
统计方法：χ2检验。
2 结果与分析
2.1 细胞凋亡模型
10-7mol.L-1DEX作用于未成年小鼠胸腺细胞4小时后，经Giemsa染色，出现凋亡细胞特征性的形态学改变：细胞皱缩、核浓缩、聚集成团，染成深蓝色(图1)。
, http://www.100md.com
图1 Giemsa染色的小鼠胸腺凋亡细胞
A：对照，小鼠正常胸腺细胞；B：0.1 μmol.L-1DEX
诱导4小时的小鼠胸腺细胞，箭头示凋亡细胞
图2 小鼠胸腺凋亡细胞的DNA分带
A：Marker:PBR322/HaeⅢ，片段长度为587-434、267-184、124-8bp；B：小鼠胸腺细胞，阴性对照；C：0.1μmol.L-1DEX诱导的小鼠胸腺细胞
琼脂糖凝胶电泳结果，对照组小鼠胸腺细胞的DNA未迁移，DEX诱导过的胸腺细胞出现凋亡细胞特征性的DNA“梯”状带(图2)，证实DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡成功。
, http://www.100md.com
2.2 彗星试验检测凋亡细胞
2.2.1 凋亡细胞的彗星形态 0.1μmol.L-1DEX作用于小鼠胸腺细胞4小时后，进行彗星试验，只观察到两种细胞：凋亡细胞，彗星形态几乎一致，很小的彗星头，长而大的彗星尾；正常淋巴细胞，圆形，无拖尾(图3)。
2.2.2 彗星试验检测凋亡细胞的最适宜条件 电压、电泳时间对于彗星试验的结果影响较大。电压高，电泳时间要短，电压低，电泳时间要长。凋亡细胞彗星出现所需电泳时间要比常规条件短：25V时，2min就有部分凋亡细胞的彗星形态可以辨认(表1)。在实验中还发现，如果电泳时间太长，凋亡细胞DNA将迁移很远，头与尾分开很长一段距离。又由于凋亡细胞头很小，彗星尾荧光染色很淡，与背景不好区分，降低了凋亡细胞的检出率。结合本实验室实际，建议用电压20V，电泳15min作为凋亡细胞的彗星试验电泳条件。
表1 不同电泳时间、电压下观察到的小鼠胸腺细胞凋亡指数 %
, http://www.100md.com
电压
(V)
电泳时间(min)
2
5
10
15
20
25
15
0
0
0
25.6
, http://www.100md.com
84.5(1)
81.7(1)
20
0
0
0
81.6
85.0
81.0
25
19.4
80.3(2)
, http://www.100md.com
87.0(2)
83.6(2)
—(3)
—
(1)与15V、15min组相比，P<0.05 (2)与25V、2min组相比，P<0.05 (3)—：细胞拖尾难于辨认
图3 小鼠胸腺凋亡细胞的彗星形态
A：正常淋巴细胞 B：凋亡细胞
2.3 彗星试验与Giemsa染色法
, 百拇医药
用不同浓度DEX诱导的小鼠胸腺细胞进行彗星试验，所得的凋亡指数与同时所做的Giemsa染色所得的凋亡指数相比，有很好的一致性(图4)。在阴性组，Giemsa染色显示正常淋巴细胞，琼脂糖凝胶电泳未见特殊的“梯”时，彗星实验也几乎观察不到特征性的拖尾细胞。在0.01 μmol.L-1DEX浓度，彗星试验检测到的凋亡指数为1.5%，Giemsa染色为1%，两者差异无显著性(P>0.05)。
图4 不同浓度DEX诱导的小鼠胸腺细胞凋亡指数
2.4 TUNEL法
是目前检测凋亡细胞常用的敏感的方法，0.1μmol.L-1DEX诱导小鼠胸腺细胞4小时后，凋亡细胞被染成深红色。凋亡指数为61.9%，彗星试验检测所得凋亡指数为64%，两者差异无显著性(P>0.05)。
, 百拇医药
3 讨论
细胞凋亡(apoptosis)，又名程序性细胞死亡，是一种细胞在内在基因调控下主动自杀的过程。已有资料表明，钙、锌等营养元素以及高温、辐射、尼古丁等理化因素可明显影响细胞凋亡，而后者又与恶性肿瘤、AIDS、中枢神经系统退行性疾病等的防治有着极为密切的关系[5，6]。因此，在预防医学研究中开展凋亡细胞的早期检测是十分重要的。
细胞凋亡的机理尚未完全阐明，但已知其最后的共同通道是激活了一种Ca2+-Mg2+依赖性核酸内切酶，把DNA链切割成180～200bp整数倍的片段。从理论上说，以不同诱因和不同靶细胞诱导的凋亡细胞在彗星试验中的表现应该是一致的。本实验所观察到的凋亡细胞的彗星形态与O1ive等用γ射线诱导的TK6凋亡细胞一致[4]。因此，本文用彗星试验检测DEX诱导的小鼠胸腺凋亡细胞的方法，应该适用于其他因素诱导的各种哺乳动物的凋亡细胞。
, http://www.100md.com
本研究结果表明，彗星试验检测细胞凋亡的灵敏度与Giemsa法和TUNEL法相近，说明彗星试验是检测细胞凋亡的灵敏方法之一。与已广泛应用的检测细胞凋亡的方法相比，彗星试验检测凋亡还具有如下优点：首先，它是一种既可定性又可定量分析的方法。以DEX诱导并经Giemsa染色法和琼脂糖凝胶电泳确定的凋亡细胞在彗星试验中呈现特征性的彗星形态(图3)，与DNA断裂剂诱发的彗星细胞易于区别(将另文报道)；同时彗星试验中的凋亡细胞与正常细胞也极易区别，便于记录凋亡细胞在某一细胞群体中的出现率。与之相比，琼脂糖凝胶电泳只能定性说明是否有凋亡细胞存在，而不能反应凋亡细胞出现的比例。TUNEL法是近年来发展起来的利用免疫组化原位标记DNA断端的方法，可以检测含有大量DNA双链断裂的凋亡细胞。但是对DNA断端的标记没有选择性，DNA断裂剂引起的细胞DNA断端(并非凋亡)，TUNEL法仍能标记上，因此会产生假阳性结果[7]。其次，彗星试验是一种准确、直观的方法。彗星试验利用电场的作用使DNA碎片迁移出去，形成一个个“彗星”尾，正常细胞则不拖尾。比起主要以观察核染色变化的Giemsa染色法和TUNEL法来说，要容易得多，观察者无需专门经验即可准确判断结果。而且，它是从DNA水平来观察凋亡细胞的变化。
, 百拇医药
综上所述，彗星试验是一种灵敏、准确、简便、既可定性又可定量检测细胞凋亡的新方法。
* 国家自然科学基金资助项目(39670625)
作者简介：李蕊，女，硕士，医师
参考文献
[1] Fairbairn D W. Comet assay, a comprehensive view. Mut Res, 1995, 339: 37-59
[2] 姜 泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1996.176-177
[3] 衡正昌，张遵真.二氯胺基酚对V79细胞DNA损伤效应的研究.卫生毒理学杂志，1997，11(2)： 89-91
, 百拇医药
[4] Wojciech G, Gong JP. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays. Cancer Res, 1993， 53： 1945-1951
[5] Wyllie AH, Morris RG. Chromatin cleavage in apoptosis: association with condensed chromatin morphology and dependence on macromolecular synthesis. J Pathol, 1984, 142： 67-77
[6] 李正银.细胞凋谢及其生物学作用与卫生学研究.国外医学卫生学分册，1995，22：1-4
[7] Grasl K B, Ruttkay N B, Koudelka H. In situ detection of fragmented DNA (TUNEL assay) fails to discriminete among apoptosis, necroses, and autolytic cell death: a cautiontry note. Hepatology, 1995, 21: 1465-1468
(1998-07-09收稿), 百拇医药