叶酸拮抗乙酰水杨酸致大鼠卵黄囊毒性作用的研究
作者：王筱芬 韩明勇
单位：筱芬 韩明勇 山东省劳动卫生职业病防治研究所，济南 250062
关键词：乙酰水杨酸；叶酸；卵黄囊；全胚胎培养；拮抗作用；致畸作用
卫生研究990317 摘要：以全胚胎培养模型结合免疫组化和电镜技术等探讨了乙酰水杨酸和叶酸对大鼠卵黄囊及胚胎的影响。结果表明：培养基含乙酰水杨酸300μg/ml组的卵黄囊直径和胚胎体长均显著低于阴性对照组，胚胎畸形率明显增高。组织学检查发现卵黄囊厚度变薄。间质层血岛、微血管数量明显减少，血管壁细胞不连续，血管发育不良。卵黄囊内皮层细胞顶端微绒毛少见。内皮层细胞的溶酶体、内质网及核蛋白体等结构和数量均有明显改变。而60mg/kg叶酸灌胃鼠血清与乙酰水杨酸联合应用后，则卵黄囊的上述毒性作用明显减轻或消失，提示叶酸能明显拮抗乙酰水杨酸致大鼠卵黄囊的毒性作用。
中图分类号：R971.1 Q593.4 Q319.33
, http://www.100md.com
Antagonism of folic acid on the
toxicity of aspirin in yolk sac of rats
Wang Xiaofen, Han Mingyong
Shandong Institute of Industrial Hygiene and Occupational Disease,Jinan 250062,China
The antagonistic effects of folic acid to aspirin on the development of rat yolk sac and embryos were studied during early organogenesis by using whole embryo culture technique and electron microscopy.The results showed that when treated with aspirin,the diameter of yolk sac and the body length of embryo were much shorter, the frequencies of abnormal embryos were significantly higher, and the yolk sac became thinner than those without treatment. The number of blood islands and capillaries decreased, the differentiation and development of blood vessel were retarded in the treated group.Ultrastructure observation also showed that the numbers of microvilli and capillaries were greatly decreased,and the structure and the numbers of lysosomes,endoplasmic reticula and ribosomes significantly changed in the treated group.When aspirin was added with high folic acid serum,the toxicity on yolk sac decreased or disappeared. The results suggested that the protection of yolk sac would be related to the antagonism of folic acid to aspirin.
, 百拇医药
Key words:aspirin, folic acid, yolk sac, whole embryo culture, antagonism, teratogenic effect
乙酰水杨酸是用于人解热镇痛的常用药。该药对人的致畸作用尚未肯定。但是动物实验已让明有强致畸作用[1，2]。本实验室利用乙酰水杨酸为阳性对照药物，采用致畸试验和大鼠全胚胎培养方法观察了叶酸的抗致畸作用和有效拮抗剂量。其试验结果已发表[3，4]。在此基础上，我们又对乙酰水杨酸单独给药、叶酸与乙酰水杨酸联合给药对卵黄囊的结构及功能影响情况进行了初步的探讨。
1 材料与方法
1.1 动物
Wistar大鼠，未育雌性大鼠体重180～240g，雄性大鼠200～250g。雌、雄性大鼠按2∶1合笼过夜。第二天早晨8点阴道涂片查精子。查到精子日定为妊娠第0天。妊娠第9天16点定为妊娠第9.5天。
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1.2 仪器与试剂
转动式培养床、气体供给系统及透射电镜。乙酰水杨酸(山东新华制药厂提供)，叶酸(上海生化所东风生化技术公司产品)，免疫组化染色SPTM试剂盒及第八因子相关抗原FVⅢ：Ag(北京中山生物制品公司产品)，IC血清(立刻离心血清，自制)，及Hanks液。
1.3 实验方法
1.3.1 实验分组 即乙酰水杨酸300μg/ml阳性对照组(B)、阴性对照组(A)及乙酰水杨酸300μg/ml加叶酸10、60mg/kg灌胃鼠血清两个实验组(C、D)。
1.3.2 给药方法和途径 将乙酰水杨酸直接加入培养瓶中。叶酸按10、60mg/kg剂量给大鼠灌胃，1小时后取血按要求制备IC血清，作为叶酸两个不同剂量组的培养基。
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1.3.3 IC 血清制备 同种雄性大鼠，戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下腹主动脉采血，于血液凝固前立即离心(3000r/min,5min)。离心后静置60min，再离心(3000r/min,30min)。将制备的血清放入56℃水浴中30分钟，灭活补体，-20℃冰箱保存备用。
1.3.4 培养方法 将9.5天孕鼠脱颈椎处死。无菌条件下分离出胚胎，移入50ml培养瓶中。每瓶盛3只胚胎、3ml血清。将培养瓶放入培养床培养48小时。分别在培养开始时、第16小时和24小时充入混合气体3分钟，O2∶CO2∶N2混合气体比例依次为5∶5∶90，20∶5∶75，40∶5∶55。
1.4 指标测定
1.4.1 胚胎测定 将培养后的胚胎移入生理盐水中，在解剖显微镜下测量卵黄囊最大直径、胚胎顶臀长。并记录胚胎的发育、畸形等情况。
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1.4.2 组织检查 (1)卵黄囊组织结构观察：将部分卵黄囊用Bouin液固定，病理切片常规处理后，光镜下观察。(2)卵黄囊血管发育：采用SP法[4]，以第八因子相关抗原(FVⅢ∶Ag)标记卵黄囊内皮层细胞，以观察卵黄囊血管的发育及密度。(3)超微结构观察：部分卵黄囊按常规制备电镜标本，于透射电镜下观察。
2 结果
2.1 叶酸对乙酰水杨酸致卵黄囊和胚胎发育异常的影响
从附表中可见，乙酰水杨酸单独作用下，卵黄囊直径及胚胎顶臀长均明显低于阴性对照组(P<0.05)。胚胎畸形率亦明显增高。叶酸60mg/kg灌胃鼠血清与300μg/ml乙酰水杨酸联合作用，则卵黄囊直径和胚胎顶臀长均显著高于单独乙酰水杨酸组(P<0.05)，胚胎畸形率也明显降低(P<0.05)。
附表 叶酸对乙酰水杨酸致卵黄囊结构和胚胎发育异常的影响 组别
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胚胎数
卵黄囊直径
(mm)
胚胎顶臀长
(mm)
畸胎率
(%)
A
12
4.98±0.42
3.98±0.38
0
B
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12
3.48±0.30(1)
2.86±0.23(1)
66.67(2)
C
13
3.79±0.63
3.14±0.55
69.24
D
11
4.79±0.38(3)
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3.77±0.42(3)
18.18(3)
与阴性对照(A)组比较，(1) P<0.05 (2)P<0.001；与阳性对照(B)组比较，(3)P<0.05
2.2 卵黄囊组织结构改变
光镜检查，与阴性对照组(A)比较，发现单独乙酰水杨酸组(B)卵黄囊厚度明显变薄。卵黄囊内皮层细胞排列不整齐、疏松，有坏死细胞。间质层中血岛、微血管少见。血管壁细胞不连续。免疫组化染色显示：卵黄囊血管内皮细胞胞浆内棕黄色颗粒比阴性对照组明显减淡，甚至消失。反应强度约为(-～+)。而叶酸60mg/kg灌胃鼠血清与乙酰水杨酸300μg/ml联合应用组(D)卵黄囊组织结构显著不同于单独乙酰水杨酸组(B)。卵黄囊内皮层细胞排列整齐、密集，间质层血管较丰富，血管壁细胞连续，管腔内可见红细胞。免疫组化染色显示血管内皮细胞胞浆中棕黄色颗粒较密集、分布较均匀，基本类同于阴性对照组。反应强度可为(+++)。
, 百拇医药
电镜检查，B组卵黄囊有明显的超微结构改变。主要表现为：内皮层细胞顶端微绒毛减少。内皮层细胞内质网、高尔基体、核蛋白体、溶酶体数量显著减少，并且有肿胀、破损。而D组卵黄囊内皮层细胞顶端微绒毛较多、排列较整齐。内皮层细胞内质网、高尔基体、溶酶体及核蛋白体的结构和数量基本同于阴性对照组，未见有明显的肿胀和破损等改变。
3 讨论
本次实验发现单独乙酰水杨酸组胚胎卵黄囊直径和胚胎体长明显低于阴性对照组，而胚胎畸形发生率高达66.67%。上述结果是否与乙酰水杨酸引起的卵黄囊组织结构改变或损害有关，就这一问题进行如下讨论。
3.1 乙酰水杨酸影响卵黄囊的营养作用
单独乙酰水杨酸组卵黄囊于光镜下观察，其厚度明显比阴性对照组变薄，并且内皮层细胞排列疏松。电镜检查发现：内皮层细胞顶端微绒毛少见，内皮层细胞溶酶体、高尔基体、内质网及核蛋白体等有不同程度的肿胀、破损。上述组织学改变，可能影响卵黄囊内皮层细胞对营养物质的摄取、消化及代谢等功能，使核酸和蛋白质合成受阻，进而影响胚胎的生长、发育。
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3.2 乙酰水杨酸影响卵黄囊的造血和血循环功能
在所有脊椎动物中，血管发生首先开始于卵黄囊的中胚层，即间质层[6]。在此形成血岛，然后形成微血管和血循环。本实验病理和免疫组化检查所见：在乙酰水杨酸作用下，卵黄囊血岛、微血管少见，血管壁细胞不连续，血管发育不良，管腔内红细胞少见。表明卵黄囊造血和血循环的组织学改变或损害都将导致胚胎细胞缺氧和代谢紊乱，进而引起胚胎毒性作用，使胚胎发育异常。
3.3 叶酸保护作用观察
在叶酸10mg/kg\,60mg/kg灌胃鼠血清与乙酰水杨酸联合应用的两个实验组中，叶酸10mg/kg灌胃血清(C)组各项观察指标测定结果类同于单独乙酰水杨酸组。而叶酸60mg/kg灌胃血清与乙酰水杨酸联合应用(D)组，使卵黄囊组织损害的各种表现明显减轻或消失。卵黄囊直径、胚胎体长均显著高于单独乙酰水杨酸组，基本同于阴性对照组。胚胎畸形率降至18.18%。试验结果提示含高剂量叶酸血清的培养基能拮抗乙酰水杨酸对卵黄囊组织的毒性作用，使卵黄囊发挥应有的生理功能。
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山东省卫生厅资助课题
作者简介：王筱芬，女，大学，副研究员
参考文献
1 Warkany JC.Expermental production of congenital malformations in rats by salycylate poisoning.Am J Pathol,1959,35:315—331
2 Greenaway JC.Sodium Salycylate tera togenicity in vitro.Teratology,1982,26:267—171
3 韩明勇.叶酸拮抗乙酰水杨酸致体外大鼠胚胎畸形的研究.山东医科大学学报，1997，35(4)：349—350
4 王筱芬.叶酸抗乙酰水杨酸致畸作用的实验研究.卫生研究，1998，27(1)：12—14
5 倪灿荣编.免疫组织化学实验新技术及应用.北京：北京科学技术出版社，1993，24
6 王爱平.啮齿类动物脏壁卵黄囊功能研究现状.卫生毒理学杂志，1993，(增刊)：7—9
(1998-11-13收稿), 百拇医药
单位：筱芬 韩明勇 山东省劳动卫生职业病防治研究所，济南 250062
关键词：乙酰水杨酸；叶酸；卵黄囊；全胚胎培养；拮抗作用；致畸作用
卫生研究990317 摘要：以全胚胎培养模型结合免疫组化和电镜技术等探讨了乙酰水杨酸和叶酸对大鼠卵黄囊及胚胎的影响。结果表明：培养基含乙酰水杨酸300μg/ml组的卵黄囊直径和胚胎体长均显著低于阴性对照组，胚胎畸形率明显增高。组织学检查发现卵黄囊厚度变薄。间质层血岛、微血管数量明显减少，血管壁细胞不连续，血管发育不良。卵黄囊内皮层细胞顶端微绒毛少见。内皮层细胞的溶酶体、内质网及核蛋白体等结构和数量均有明显改变。而60mg/kg叶酸灌胃鼠血清与乙酰水杨酸联合应用后，则卵黄囊的上述毒性作用明显减轻或消失，提示叶酸能明显拮抗乙酰水杨酸致大鼠卵黄囊的毒性作用。
中图分类号：R971.1 Q593.4 Q319.33
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Antagonism of folic acid on the
toxicity of aspirin in yolk sac of rats
Wang Xiaofen, Han Mingyong
Shandong Institute of Industrial Hygiene and Occupational Disease,Jinan 250062,China
The antagonistic effects of folic acid to aspirin on the development of rat yolk sac and embryos were studied during early organogenesis by using whole embryo culture technique and electron microscopy.The results showed that when treated with aspirin,the diameter of yolk sac and the body length of embryo were much shorter, the frequencies of abnormal embryos were significantly higher, and the yolk sac became thinner than those without treatment. The number of blood islands and capillaries decreased, the differentiation and development of blood vessel were retarded in the treated group.Ultrastructure observation also showed that the numbers of microvilli and capillaries were greatly decreased,and the structure and the numbers of lysosomes,endoplasmic reticula and ribosomes significantly changed in the treated group.When aspirin was added with high folic acid serum,the toxicity on yolk sac decreased or disappeared. The results suggested that the protection of yolk sac would be related to the antagonism of folic acid to aspirin.
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Key words:aspirin, folic acid, yolk sac, whole embryo culture, antagonism, teratogenic effect
乙酰水杨酸是用于人解热镇痛的常用药。该药对人的致畸作用尚未肯定。但是动物实验已让明有强致畸作用[1，2]。本实验室利用乙酰水杨酸为阳性对照药物，采用致畸试验和大鼠全胚胎培养方法观察了叶酸的抗致畸作用和有效拮抗剂量。其试验结果已发表[3，4]。在此基础上，我们又对乙酰水杨酸单独给药、叶酸与乙酰水杨酸联合给药对卵黄囊的结构及功能影响情况进行了初步的探讨。
1 材料与方法
1.1 动物
Wistar大鼠，未育雌性大鼠体重180～240g，雄性大鼠200～250g。雌、雄性大鼠按2∶1合笼过夜。第二天早晨8点阴道涂片查精子。查到精子日定为妊娠第0天。妊娠第9天16点定为妊娠第9.5天。
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1.2 仪器与试剂
转动式培养床、气体供给系统及透射电镜。乙酰水杨酸(山东新华制药厂提供)，叶酸(上海生化所东风生化技术公司产品)，免疫组化染色SPTM试剂盒及第八因子相关抗原FVⅢ：Ag(北京中山生物制品公司产品)，IC血清(立刻离心血清，自制)，及Hanks液。
1.3 实验方法
1.3.1 实验分组 即乙酰水杨酸300μg/ml阳性对照组(B)、阴性对照组(A)及乙酰水杨酸300μg/ml加叶酸10、60mg/kg灌胃鼠血清两个实验组(C、D)。
1.3.2 给药方法和途径 将乙酰水杨酸直接加入培养瓶中。叶酸按10、60mg/kg剂量给大鼠灌胃，1小时后取血按要求制备IC血清，作为叶酸两个不同剂量组的培养基。
, 百拇医药
1.3.3 IC 血清制备 同种雄性大鼠，戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下腹主动脉采血，于血液凝固前立即离心(3000r/min,5min)。离心后静置60min，再离心(3000r/min,30min)。将制备的血清放入56℃水浴中30分钟，灭活补体，-20℃冰箱保存备用。
1.3.4 培养方法 将9.5天孕鼠脱颈椎处死。无菌条件下分离出胚胎，移入50ml培养瓶中。每瓶盛3只胚胎、3ml血清。将培养瓶放入培养床培养48小时。分别在培养开始时、第16小时和24小时充入混合气体3分钟，O2∶CO2∶N2混合气体比例依次为5∶5∶90，20∶5∶75，40∶5∶55。
1.4 指标测定
1.4.1 胚胎测定 将培养后的胚胎移入生理盐水中，在解剖显微镜下测量卵黄囊最大直径、胚胎顶臀长。并记录胚胎的发育、畸形等情况。
, 百拇医药
1.4.2 组织检查 (1)卵黄囊组织结构观察：将部分卵黄囊用Bouin液固定，病理切片常规处理后，光镜下观察。(2)卵黄囊血管发育：采用SP法[4]，以第八因子相关抗原(FVⅢ∶Ag)标记卵黄囊内皮层细胞，以观察卵黄囊血管的发育及密度。(3)超微结构观察：部分卵黄囊按常规制备电镜标本，于透射电镜下观察。
2 结果
2.1 叶酸对乙酰水杨酸致卵黄囊和胚胎发育异常的影响
从附表中可见，乙酰水杨酸单独作用下，卵黄囊直径及胚胎顶臀长均明显低于阴性对照组(P<0.05)。胚胎畸形率亦明显增高。叶酸60mg/kg灌胃鼠血清与300μg/ml乙酰水杨酸联合作用，则卵黄囊直径和胚胎顶臀长均显著高于单独乙酰水杨酸组(P<0.05)，胚胎畸形率也明显降低(P<0.05)。
附表 叶酸对乙酰水杨酸致卵黄囊结构和胚胎发育异常的影响 组别
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胚胎数
卵黄囊直径
(mm)
胚胎顶臀长
(mm)
畸胎率
(%)
A
12
4.98±0.42
3.98±0.38
0
B
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12
3.48±0.30(1)
2.86±0.23(1)
66.67(2)
C
13
3.79±0.63
3.14±0.55
69.24
D
11
4.79±0.38(3)
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3.77±0.42(3)
18.18(3)
与阴性对照(A)组比较，(1) P<0.05 (2)P<0.001；与阳性对照(B)组比较，(3)P<0.05
2.2 卵黄囊组织结构改变
光镜检查，与阴性对照组(A)比较，发现单独乙酰水杨酸组(B)卵黄囊厚度明显变薄。卵黄囊内皮层细胞排列不整齐、疏松，有坏死细胞。间质层中血岛、微血管少见。血管壁细胞不连续。免疫组化染色显示：卵黄囊血管内皮细胞胞浆内棕黄色颗粒比阴性对照组明显减淡，甚至消失。反应强度约为(-～+)。而叶酸60mg/kg灌胃鼠血清与乙酰水杨酸300μg/ml联合应用组(D)卵黄囊组织结构显著不同于单独乙酰水杨酸组(B)。卵黄囊内皮层细胞排列整齐、密集，间质层血管较丰富，血管壁细胞连续，管腔内可见红细胞。免疫组化染色显示血管内皮细胞胞浆中棕黄色颗粒较密集、分布较均匀，基本类同于阴性对照组。反应强度可为(+++)。
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电镜检查，B组卵黄囊有明显的超微结构改变。主要表现为：内皮层细胞顶端微绒毛减少。内皮层细胞内质网、高尔基体、核蛋白体、溶酶体数量显著减少，并且有肿胀、破损。而D组卵黄囊内皮层细胞顶端微绒毛较多、排列较整齐。内皮层细胞内质网、高尔基体、溶酶体及核蛋白体的结构和数量基本同于阴性对照组，未见有明显的肿胀和破损等改变。
3 讨论
本次实验发现单独乙酰水杨酸组胚胎卵黄囊直径和胚胎体长明显低于阴性对照组，而胚胎畸形发生率高达66.67%。上述结果是否与乙酰水杨酸引起的卵黄囊组织结构改变或损害有关，就这一问题进行如下讨论。
3.1 乙酰水杨酸影响卵黄囊的营养作用
单独乙酰水杨酸组卵黄囊于光镜下观察，其厚度明显比阴性对照组变薄，并且内皮层细胞排列疏松。电镜检查发现：内皮层细胞顶端微绒毛少见，内皮层细胞溶酶体、高尔基体、内质网及核蛋白体等有不同程度的肿胀、破损。上述组织学改变，可能影响卵黄囊内皮层细胞对营养物质的摄取、消化及代谢等功能，使核酸和蛋白质合成受阻，进而影响胚胎的生长、发育。
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3.2 乙酰水杨酸影响卵黄囊的造血和血循环功能
在所有脊椎动物中，血管发生首先开始于卵黄囊的中胚层，即间质层[6]。在此形成血岛，然后形成微血管和血循环。本实验病理和免疫组化检查所见：在乙酰水杨酸作用下，卵黄囊血岛、微血管少见，血管壁细胞不连续，血管发育不良，管腔内红细胞少见。表明卵黄囊造血和血循环的组织学改变或损害都将导致胚胎细胞缺氧和代谢紊乱，进而引起胚胎毒性作用，使胚胎发育异常。
3.3 叶酸保护作用观察
在叶酸10mg/kg\,60mg/kg灌胃鼠血清与乙酰水杨酸联合应用的两个实验组中，叶酸10mg/kg灌胃血清(C)组各项观察指标测定结果类同于单独乙酰水杨酸组。而叶酸60mg/kg灌胃血清与乙酰水杨酸联合应用(D)组，使卵黄囊组织损害的各种表现明显减轻或消失。卵黄囊直径、胚胎体长均显著高于单独乙酰水杨酸组，基本同于阴性对照组。胚胎畸形率降至18.18%。试验结果提示含高剂量叶酸血清的培养基能拮抗乙酰水杨酸对卵黄囊组织的毒性作用，使卵黄囊发挥应有的生理功能。
, http://www.100md.com
山东省卫生厅资助课题
作者简介：王筱芬，女，大学，副研究员
参考文献
1 Warkany JC.Expermental production of congenital malformations in rats by salycylate poisoning.Am J Pathol,1959,35:315—331
2 Greenaway JC.Sodium Salycylate tera togenicity in vitro.Teratology,1982,26:267—171
3 韩明勇.叶酸拮抗乙酰水杨酸致体外大鼠胚胎畸形的研究.山东医科大学学报，1997，35(4)：349—350
4 王筱芬.叶酸抗乙酰水杨酸致畸作用的实验研究.卫生研究，1998，27(1)：12—14
5 倪灿荣编.免疫组织化学实验新技术及应用.北京：北京科学技术出版社，1993，24
6 王爱平.啮齿类动物脏壁卵黄囊功能研究现状.卫生毒理学杂志，1993，(增刊)：7—9
(1998-11-13收稿), 百拇医药