血清谷胱甘肽S-转移酶在小鼠急性硫代乙酰胺肝损伤中的诊断价值
作者：汪 晖 彭仁琇 孔 锐 李 颖
单位：汪 晖 彭仁琇 孔 锐 李 颖 湖北医科大学药理教研室，武汉 430071
关键词：硫代乙酰胺；谷胱甘肽S-转移酶类；谷胱甘肽；谷胱甘肽过氧化酶/谷胱甘肽还原酶；超氧化物歧化酶
卫生研究990316 摘要：探讨了血清谷胱甘肽S-转移酶(GST)对硫代乙酰胺(TAA)所致小鼠急性肝损伤的早期诊断意义。结果表明，腹腔注射TAA 25～100mg/kg能增加小鼠血清GST活性，其活性改变与TAA之间存在量-效和时-效关系，与血清ALT变化间呈高度正相关。TAA致血清GST活性明显异常的同时，肝谷胱甘肽含量和GST、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性明显降低。提示肝脏抗氧化功能减退是TAA致肝损伤的主要机理之一，血清GST水平是反映TAA急性肝损伤的早期灵敏指标。
中图分类号：R575.04 R446.61
, 百拇医药
Serum glutathione S-transferase activity as an early marker
of thioacetimide-induced acute hepatotoxicity in mice
Wang Hui,Peng Renxiu,Kong Rui,Li Ying
Department of Pharmacology,Hubei Medical University,Wuhan 430071,China
The objective of this paper was to evaluate serum glutathione S-transferasethe (GST) in thioacetimide(TAA)-induced hepatotoxicity in mice.The results showed that intraperitoneal injection of TAA (25～100mg/kg)increased serum GST activity. The activity of GST was dose-and time-related to TAA.There was a good positive correlation between serum GST and serum alanine transaminase(ALT) activities.The content of reduced glutathione(GSH) and activites of GST,glutathione peroxidase(GSH-Px) and superoxide dismutase(SOD) were significantly decreased while serum GST activity induced by TAA was high. The results suggested that the reduced hepatic antioxidative function is one of the mechanism of TAA-induced hepatotoxicity, and serum GST activity is a sensitive and eraly marker in detecting TAA-induced hepatotoxicity.
, 百拇医药
Key words: thioacetimide, glutathione S-transferases, reduced glutathione, glutathione peroxidase/reductase, superoxide dismutase
越来越多的研究表明，血清谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)在对实验和临床肝病的诊断、预后判断和治疗效果的观察中具有特别重要的意义[1，2]。硫代乙酰胺(thioacetimide,TAA)作为肝损模型药，已广泛用于保肝新药的开发研究中。本文观察了TAA致小鼠急性肝损伤时血清GST的变化规律，以及它与血清丙氨酸转氨酶(alanine transaminase,ALT)之间的相关性，为进一步阐明血清GST的肝功能诊断价值提供实验依据。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 药品与试剂
TAA为北京市朝阳区旭东化工厂生产，分析纯，批号：930417。还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2,4-dinitrobenzene,CDNB)和硫代巴比妥酸(TBA)均为美国Sigma公司产品。
1.2 动物与处理
雄性昆明种小鼠18～24g，由湖北医科大学动物实验中心提供。第一批小鼠40只，分别经腹腔注射(ip)TAA 0，25，50和100mg/kg,以等容量生理盐水作对照，禁食而不禁水8h后断头处死，制备血清。第二批小鼠40只，分别腹腔注射TAA 100mg/kg,于给药后即刻，8，16和24h后断头处死，制备血清。每2只小鼠肝脏合为一标本，制备匀浆。-30℃冰箱保存，一周内测定。
1.3 生化分析及仪器
, 百拇医药
以CDNB为底物，用UV-3000紫外分光光度仪测定血清和肝脏GST活性[3]。反应体系中含100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.5)、1mmol/L GSH、1mmol/L CDNB和0.05ml血清(或0.4—0.6mg肝组织蛋白)。反应总体积为1 ml。在波长为340nm，25℃时扫描1min。摩尔消光系数为9.6。
依文献方法测定肝脏谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性[4,5]。邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性[6]。TBA法测定肝脏MDA含量。血清ALT采用改良金氏法。
2 结果
, 百拇医药
2.1 TAA对小鼠血清GST和ALT的影响
TAA25～100mg/kg 腹腔注射 8h后引起血清GST活性增加，呈剂量依赖性。TAA 25mg/kg时血清GST已升高(P<0.05)，100mg/kg时血清GST为对照组的2.6倍(P<0.01)。同时血清ALT的增加与TAA间也存在量-效关系，TAA 100mg/kg时血清ALT为对照组的2.0倍(P<0.05)。
表1 硫代乙酰胺对小鼠血清GST和血清ALT活性的影响(
±s)
mmol/(min.L) C/mg.kg-1
GST
, 百拇医药 ALT
0
8±4
2.94±0.540
25
14±7(1)
3.83±2.40(1)
50
20±19
4.60±3.88
100
22±5(2)
, 百拇医药
5.79±1.83(2)
注：与对照组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01 从时效关系(表2)上看，TAA 100mg/kg 腹腔注射后24h内血清GST和血清ALT活性升高随时间递增。血清GST和血清ALT活性于16h已达高峰，分别为对照组的5.1和46.8倍(P<0.01)，24h时不再明显提高。
表2 硫代乙酰胺注射时间对小鼠血清GST
和ALT活性的影响(±s)
mmol/(min.L) t/h
GST
ALT
, 百拇医药
0
5±1
2.79±0.33
8
57±23(1)
7.79±4.35(1)
16
235±201(1)
14.18±0.20(1)
24
215±164(2)
, 百拇医药
14.22±0.12(1)
注：与对照组比较，(1)P<0.01 相关分析结果表明，血清GST与ALT活性变化间在量-效和时-效关系上皆呈正相关(=136.2+18.3X,r=0.958,P<0.025;=-68.9+0.2X,r=0.979,P<0.025。
2.2 TAA致小鼠肝脏生化指标的变化
与GPX对照组相比，TAA 100mg/kg腹腔注射16h后小鼠肝脏GSH含量明显减少和肝脏MDA生成量增加(P<0.01)，肝脏和GST活性显著降低(P<0.01)，对肝脏GR活性无明显影响。同时肝脏SOD活性明显降低(P<0.01)，对肝脏CAT活性无明显影响(表3)。
表3 硫代乙酰胺对小鼠肝脏抗氧化功能的影响(±s,n=5) 组别
, http://www.100md.com
MDA
(μmol/g)
GSH
(μmol/g)
GST
〔(mmol/(min.5mg)〕
GPX
(μmol/min)
GR
μmol/(min.mg)
SOD
〔mmol/(min.g)〕
, 百拇医药
CAT
(k/g)
对照组
72±6
29±8
96±19
17±5
21±2
4.8±0.6
31±6
硫代乙酰胺组
188±33(1)
, 百拇医药 15±8(1)
63±14(1)
9±2(1)
19±2
3.7±0.4(1)
34±2
注：与对照组相比 (1)P<0.013 讨论
研究表明，TAA肝毒性机理与其在体内主要经P-450代谢生成活性中间产物TSO(TAA-S-oxide)，后者经P-450继续氧化代谢生成极性中间产物，与细胞内大分子物质呈不可逆性结合最终导致肝细胞坏死有关[7]。本研究表明，TAA引起肝细胞损伤(导致血清ALT升高)的同时，肝脏GSH含量和多种抗氧化酶(GSH-Px、GST和SOD)活性降低，肝脏脂质过氧化产物MDA生成量明显增加。提示肝脏抗氧化功能减退是TAA导致急性肝损伤的主要机理之一。TAA引起肝脏抗氧化改变的同时，血清GST出现有意义的增高。该活性变化与TAA剂量成正比，在给TAA16h后达高峰，且与血清ALT变化一致。说明血清GST与血清ALT在小鼠TAA急性肝损害中具有同等早期诊断价值。
, 百拇医药
有文献提示[3]，由于血清GST(主要指α-GST)的分子量小、半衰期短、在肝细胞中含量丰富和均匀分布等特点，可用于肝功能诊断。CDNB作为GST的主要底物，它反映的是主要包括α-GST在内(约70%)的总体GST水平的改变。我们在多种急性实验性肝损伤模型上的研究发现，血清GST对化学物质所致的急性肝损伤的诊断价值是明确的[1，9](部分待发表)。但血清GST异常增高的幅度却因肝损模型不同而异。如在小鼠对乙酰氨基酚肝损模型中，不同剂量组的血清GST平均增高达58倍以上，个别甚至高达上万倍[1]，而大剂量乙醇致血清GST的平均增高值却不足一倍[9]。
湖北省自然科学基金(No:97J026)和湖北省卫生厅医药卫生科学研究项目(No:97403)
作者简介：汪 晖，女，博士，副教授
参考文献
, http://www.100md.com
1 汪晖，彭仁FDA1.对乙酰氨基酚对小鼠谷胱甘肽S-转移酶活性的影响.中国药理学报，1993，14(S)：41—44
2 Redl H,Schlag G,Paul E, et al. Plasma glutathione S-transferase as an early marker of posttraumatic hepatic injury in non-human primates.Shock,1995,3:395—397
3 Habig WH,Pabst MJ,Jakoby WB.Glutathione S-transferase:the first enzymatic step in mercapturic acid formation.J Biol Chem,1974,249:7130—7139
4 夏奕明，朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定方法.卫生研究，1987，16(4)：29—33
, 百拇医药
5 方允中，张嘉麟，刘智峰，等.几种血液病病人血液中谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活力观察.中华血液学杂志，1986，7：220—222
6 谢卫华、姚菊芳、袁勤生.连苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的改进.医药工业，1988，19(5)：217—220
7 Dyroff MC,Neal RA.Studies of the mechanism of metabolism of thioacetamide S-oxide by rat liver microsomes.Mol Pharmacol,1983,23:219—227
8 Hughes VF,Trull AK,Joshi O, et al. Monitoring eosinophil activation and liver function after liver transplantation.Transplantation,1998,65:1334—1339
9 汪晖，彭仁FDA1，王若琨，等.阿魏酸钠对乙醇所致小鼠肝脏抗氧化功能改变的拮抗作用.药学学报，1997，32：511—514
1998-10-19收稿, 百拇医药
单位：汪 晖 彭仁琇 孔 锐 李 颖 湖北医科大学药理教研室，武汉 430071
关键词：硫代乙酰胺；谷胱甘肽S-转移酶类；谷胱甘肽；谷胱甘肽过氧化酶/谷胱甘肽还原酶；超氧化物歧化酶
卫生研究990316 摘要：探讨了血清谷胱甘肽S-转移酶(GST)对硫代乙酰胺(TAA)所致小鼠急性肝损伤的早期诊断意义。结果表明，腹腔注射TAA 25～100mg/kg能增加小鼠血清GST活性，其活性改变与TAA之间存在量-效和时-效关系，与血清ALT变化间呈高度正相关。TAA致血清GST活性明显异常的同时，肝谷胱甘肽含量和GST、谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性明显降低。提示肝脏抗氧化功能减退是TAA致肝损伤的主要机理之一，血清GST水平是反映TAA急性肝损伤的早期灵敏指标。
中图分类号：R575.04 R446.61
, 百拇医药
Serum glutathione S-transferase activity as an early marker
of thioacetimide-induced acute hepatotoxicity in mice
Wang Hui,Peng Renxiu,Kong Rui,Li Ying
Department of Pharmacology,Hubei Medical University,Wuhan 430071,China
The objective of this paper was to evaluate serum glutathione S-transferasethe (GST) in thioacetimide(TAA)-induced hepatotoxicity in mice.The results showed that intraperitoneal injection of TAA (25～100mg/kg)increased serum GST activity. The activity of GST was dose-and time-related to TAA.There was a good positive correlation between serum GST and serum alanine transaminase(ALT) activities.The content of reduced glutathione(GSH) and activites of GST,glutathione peroxidase(GSH-Px) and superoxide dismutase(SOD) were significantly decreased while serum GST activity induced by TAA was high. The results suggested that the reduced hepatic antioxidative function is one of the mechanism of TAA-induced hepatotoxicity, and serum GST activity is a sensitive and eraly marker in detecting TAA-induced hepatotoxicity.
, 百拇医药
Key words: thioacetimide, glutathione S-transferases, reduced glutathione, glutathione peroxidase/reductase, superoxide dismutase
越来越多的研究表明，血清谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)在对实验和临床肝病的诊断、预后判断和治疗效果的观察中具有特别重要的意义[1，2]。硫代乙酰胺(thioacetimide,TAA)作为肝损模型药，已广泛用于保肝新药的开发研究中。本文观察了TAA致小鼠急性肝损伤时血清GST的变化规律，以及它与血清丙氨酸转氨酶(alanine transaminase,ALT)之间的相关性，为进一步阐明血清GST的肝功能诊断价值提供实验依据。
1 材料与方法
, 百拇医药
1.1 药品与试剂
TAA为北京市朝阳区旭东化工厂生产，分析纯，批号：930417。还原型谷胱甘肽(GSH)、氧化型谷胱甘肽(GSSG)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、1-氯-2，4-二硝基苯(1-chloro-2,4-dinitrobenzene,CDNB)和硫代巴比妥酸(TBA)均为美国Sigma公司产品。
1.2 动物与处理
雄性昆明种小鼠18～24g，由湖北医科大学动物实验中心提供。第一批小鼠40只，分别经腹腔注射(ip)TAA 0，25，50和100mg/kg,以等容量生理盐水作对照，禁食而不禁水8h后断头处死，制备血清。第二批小鼠40只，分别腹腔注射TAA 100mg/kg,于给药后即刻，8，16和24h后断头处死，制备血清。每2只小鼠肝脏合为一标本，制备匀浆。-30℃冰箱保存，一周内测定。
1.3 生化分析及仪器
, 百拇医药
以CDNB为底物，用UV-3000紫外分光光度仪测定血清和肝脏GST活性[3]。反应体系中含100 mmol/L磷酸钾缓冲液(pH6.5)、1mmol/L GSH、1mmol/L CDNB和0.05ml血清(或0.4—0.6mg肝组织蛋白)。反应总体积为1 ml。在波长为340nm，25℃时扫描1min。摩尔消光系数为9.6。
依文献方法测定肝脏谷胱甘肽还原酶(glutathione reductase,GR)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)和过氧化氢酶(catalase,CAT)活性[4,5]。邻苯三酚法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性[6]。TBA法测定肝脏MDA含量。血清ALT采用改良金氏法。
2 结果
, 百拇医药
2.1 TAA对小鼠血清GST和ALT的影响
TAA25～100mg/kg 腹腔注射 8h后引起血清GST活性增加，呈剂量依赖性。TAA 25mg/kg时血清GST已升高(P<0.05)，100mg/kg时血清GST为对照组的2.6倍(P<0.01)。同时血清ALT的增加与TAA间也存在量-效关系，TAA 100mg/kg时血清ALT为对照组的2.0倍(P<0.05)。
表1 硫代乙酰胺对小鼠血清GST和血清ALT活性的影响(
±s)mmol/(min.L) C/mg.kg-1
GST
, 百拇医药 ALT
0
8±4
2.94±0.540
25
14±7(1)
3.83±2.40(1)
50
20±19
4.60±3.88
100
22±5(2)
, 百拇医药
5.79±1.83(2)
注：与对照组比较，(1)P<0.05，(2)P<0.01 从时效关系(表2)上看，TAA 100mg/kg 腹腔注射后24h内血清GST和血清ALT活性升高随时间递增。血清GST和血清ALT活性于16h已达高峰，分别为对照组的5.1和46.8倍(P<0.01)，24h时不再明显提高。
表2 硫代乙酰胺注射时间对小鼠血清GST
和ALT活性的影响(
±s)mmol/(min.L) t/h
GST
ALT
, 百拇医药
0
5±1
2.79±0.33
8
57±23(1)
7.79±4.35(1)
16
235±201(1)
14.18±0.20(1)
24
215±164(2)
, 百拇医药
14.22±0.12(1)
注：与对照组比较，(1)P<0.01 相关分析结果表明，血清GST与ALT活性变化间在量-效和时-效关系上皆呈正相关(=136.2+18.3X,r=0.958,P<0.025;=-68.9+0.2X,r=0.979,P<0.025。
2.2 TAA致小鼠肝脏生化指标的变化
与GPX对照组相比，TAA 100mg/kg腹腔注射16h后小鼠肝脏GSH含量明显减少和肝脏MDA生成量增加(P<0.01)，肝脏和GST活性显著降低(P<0.01)，对肝脏GR活性无明显影响。同时肝脏SOD活性明显降低(P<0.01)，对肝脏CAT活性无明显影响(表3)。
表3 硫代乙酰胺对小鼠肝脏抗氧化功能的影响(±s,n=5) 组别
, http://www.100md.com
MDA
(μmol/g)
GSH
(μmol/g)
GST
〔(mmol/(min.5mg)〕
GPX
(μmol/min)
GR
μmol/(min.mg)
SOD
〔mmol/(min.g)〕
, 百拇医药
CAT
(k/g)
对照组
72±6
29±8
96±19
17±5
21±2
4.8±0.6
31±6
硫代乙酰胺组
188±33(1)
, 百拇医药 15±8(1)
63±14(1)
9±2(1)
19±2
3.7±0.4(1)
34±2
注：与对照组相比 (1)P<0.013 讨论
研究表明，TAA肝毒性机理与其在体内主要经P-450代谢生成活性中间产物TSO(TAA-S-oxide)，后者经P-450继续氧化代谢生成极性中间产物，与细胞内大分子物质呈不可逆性结合最终导致肝细胞坏死有关[7]。本研究表明，TAA引起肝细胞损伤(导致血清ALT升高)的同时，肝脏GSH含量和多种抗氧化酶(GSH-Px、GST和SOD)活性降低，肝脏脂质过氧化产物MDA生成量明显增加。提示肝脏抗氧化功能减退是TAA导致急性肝损伤的主要机理之一。TAA引起肝脏抗氧化改变的同时，血清GST出现有意义的增高。该活性变化与TAA剂量成正比，在给TAA16h后达高峰，且与血清ALT变化一致。说明血清GST与血清ALT在小鼠TAA急性肝损害中具有同等早期诊断价值。
, 百拇医药
有文献提示[3]，由于血清GST(主要指α-GST)的分子量小、半衰期短、在肝细胞中含量丰富和均匀分布等特点，可用于肝功能诊断。CDNB作为GST的主要底物，它反映的是主要包括α-GST在内(约70%)的总体GST水平的改变。我们在多种急性实验性肝损伤模型上的研究发现，血清GST对化学物质所致的急性肝损伤的诊断价值是明确的[1，9](部分待发表)。但血清GST异常增高的幅度却因肝损模型不同而异。如在小鼠对乙酰氨基酚肝损模型中，不同剂量组的血清GST平均增高达58倍以上，个别甚至高达上万倍[1]，而大剂量乙醇致血清GST的平均增高值却不足一倍[9]。
湖北省自然科学基金(No:97J026)和湖北省卫生厅医药卫生科学研究项目(No:97403)
作者简介：汪 晖，女，博士，副教授
参考文献
, http://www.100md.com
1 汪晖，彭仁FDA1.对乙酰氨基酚对小鼠谷胱甘肽S-转移酶活性的影响.中国药理学报，1993，14(S)：41—44
2 Redl H,Schlag G,Paul E, et al. Plasma glutathione S-transferase as an early marker of posttraumatic hepatic injury in non-human primates.Shock,1995,3:395—397
3 Habig WH,Pabst MJ,Jakoby WB.Glutathione S-transferase:the first enzymatic step in mercapturic acid formation.J Biol Chem,1974,249:7130—7139
4 夏奕明，朱莲珍.血和组织中谷胱甘肽过氧化物酶活力的测定方法.卫生研究，1987，16(4)：29—33
, 百拇医药
5 方允中，张嘉麟，刘智峰，等.几种血液病病人血液中谷胱甘肽过氧化物酶、超氧化物歧化酶和过氧化氢酶的活力观察.中华血液学杂志，1986，7：220—222
6 谢卫华、姚菊芳、袁勤生.连苯三酚自氧化法测定超氧化物歧化酶活性的改进.医药工业，1988，19(5)：217—220
7 Dyroff MC,Neal RA.Studies of the mechanism of metabolism of thioacetamide S-oxide by rat liver microsomes.Mol Pharmacol,1983,23:219—227
8 Hughes VF,Trull AK,Joshi O, et al. Monitoring eosinophil activation and liver function after liver transplantation.Transplantation,1998,65:1334—1339
9 汪晖，彭仁FDA1，王若琨，等.阿魏酸钠对乙醇所致小鼠肝脏抗氧化功能改变的拮抗作用.药学学报，1997，32：511—514
1998-10-19收稿, 百拇医药