甲基叔丁基醚对原癌基因和功能基因表达的影响
作者：周 伟 黄关麟 张 恒 叶舜华
单位：周 伟 叶舜华 上海医科大学环境卫生学教研室，上海 200032；黄关麟 张 恒 南京炼油厂职工医院
关键词：甲基叔丁基醚；cmyc基因；p21蛋白；GST-P基因
卫生研究990304 摘要：甲基叔丁基醚(MTBE)是一种新型的汽油添加剂，被用来提高汽油燃烧效率，减少汽车尾气中有害物质的排放。MTBE具有一定的动物致癌性，但其机制目前并不清楚。本研究采用免疫组织化学方法，检测了MTBE对体外培养的NIH3T3细胞中cmyc和p21蛋白表达的影响；采用点杂交方法，从RNA水平检测了MTBE亚慢性染毒大鼠肝组织中原癌基因cmyc基因和功能基因GST-P基因的表达情况。免疫组化结果显示，MTBE可诱导cmyc基因的高表达，对p21蛋白的表达未见明显影响。点杂交结果显示，MTBE可明显诱导大鼠肝组织中cmyc基因的高表达，而对GST-P基因的表达未见明显影响。上述结果提示，MTBE可诱导细胞中cmyc基因表达活性增高，可能是其动物致癌性的机制之一。
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中图分类号：R730.231.1 L473.5 Q623.423
Effect of methyl tertiary butyl ether on the expression
of protooncogenes and function genes
Zhou Wei,Huang Guanlin, Zhangheng et al.
Department of Environmental Health,Shanghai Medical University,Shanghai 200032,China
Methyl tertiary butyl ether (MTBE) is a new gasoline additive, which is used to increase the combustion of gasoline and to reduce the emission of harmful exhausts from automobile. The mechanism for the carcinogenesis of MTBE in animals is not clear.Immunohistochemistry method was used to detect the effect of MTBE on the expression of cmyc and p21 proteins in NIH3T3 cells. Dot hybridization method was used to explore the expression of cmyc gene and GSTP(glutathione StransferaseP) gene in the of MTBE treated rats.The results showed that MTBE could enhance the expression of cmyc protein,but had no effect on p21 protein. MTBE could induce high expression of cmyc gene,and had no effect on the expression of GSTP gene.These results suggest that the high expression of cmyc gene induced by MTBE might be one of the mechanisms of its carcinogenicity in animal.
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Key words: Methyl tertiary butyl ether, cmyc gene, p21 protein, GSTP gene
甲基叔丁基醚(methyl tertiary butyl ether,MTBE)是一种新型的汽油添加剂，被用来提高汽油燃烧效率，增加辛烷值，减少一氧化碳(CO)和其它一些有害物质的排放，并可替代铅用作汽油抗爆剂，在世界上已得到广泛应用。目前的研究结果显示，MTBE具有一定的动物致癌性，但其机制目前并不清楚[1]。不少研究表明，原癌基因(如cmyc、ras基因)和功能基因(谷胱甘肽S-转移酶P，GST-P基因)在细胞中受到某些化学致癌因子作用后，会在细胞中高表达，则细胞在以后的演变中可能形成肿瘤。为研究MTBE是否会影响原癌基因和功能基因的表达，进一步探讨MTBE动物致癌性的可能机制，作者采用免疫组织化学方法，检测了MTBE对体外培养的NIH3T3细胞中cmyc和p21蛋白表达的影响。采用点杂交方法，从RNA水平检测了MTBE亚慢性染毒大鼠肝细胞中原癌基因cmyc基因和功能基因GST-P基因的表达情况。
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1 材料和方法 MTBE由上海炼油厂提供，纯度为98.8%。主要杂质含量为三丁基醇(TBA)1.01%，二异丁烯(DIB)0.32%，C4 0.15%，C5 0.02%，和国外同类产品基本相同。
1.1 MTBE对NIH3T3细胞中cmyc、p21蛋白表达的影响
选用NIH3T3细胞(中国科学院上海细胞所提供)，按5×105密度接种于60mm培养瓶中。接种24小时后，加入不同浓度的MTBE，染毒72小时。染毒结束后，将细胞转种于含盖玻片的平皿中，继续培养72小时，当细胞生长至一定密度后，弃培养基，-20℃丙酮固定，ABC法检测cmyc和p21蛋白的表达情况。ABC试剂盒购自华美生物工程公司，鼠抗cmyc、p21购自Dako公司。未染毒细胞作阴性对照，正常鼠血清作替代对照。各剂量组中两种蛋白分别检测12张玻片，蛋白表达阳性判断标准为：阳性细胞<10%为-；10%～30%为+；30%～50%为；>50%为。
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1.2 MTBE对大鼠肝组织原癌基因和功能基因表达的影响
1.2.1 实验动物及处理
雄性SD大鼠40只，体重180～200g，由本校实验动物中心提供。将动物随机分成四组，每组10只。将MTBE溶于豆油中灌胃染毒，染毒剂量按体重分别为1000,600及200mg/kg；对照组给予等量豆油。每周5天，一天一次，共13周。各组动物于末次染毒后24h处死，迅速取出部分肝脏，液氮中速冻后-70℃保存。
1.2.2 探针的制备 含GST-P基因片断的PGP5质粒由中国医学科学院基础医学研究所左瑾惠赠。GST-P基因片断两端限制性内切酶的位点为EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ,片断长0.72kb。质粒的扩增、酶切鉴定和纯化及回收均按文献方法进行[2]。cmyc探针(华美公司)片断长0.85kb。随机引物法地高辛标记探针。探针标记试剂盒来自Boehringer Mannheim公司。
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1.2.3 RNA的提取和点杂交 分别合并各剂量组动物肝脏，一步法提取总RNA[3]。样品变性后，按每孔30μg RNA点膜。所用探针浓度为125μg/ml。经预杂交、杂交，洗膜，封闭，最后避光显色8h，颜色紫兰色判断为阳性。所用杂交试剂盒来自Boehringer Mannheim公司。各孔颜色深浅用Image Master VDS Software(Phamacia Biotech)进行图像分析，计算mass值。
2 结果
2.1 MTBE对培养细胞中原癌基因蛋白表达的影响
试验结果(见表1)显示，各染毒组细胞中cmyc蛋白表达和玻片阳性率较阴性对照组明显增高，提示MTBE具有诱导cmyc基因高表达的作用，但各剂量组结果相比无明显的剂量-反应关系。各染毒组细胞中p21蛋白表达未见明显增强。
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表1 MTBE染毒NIH3T3细胞免疫组化检测结果 C/g.L-1
蛋白
蛋白
-
+
++
+++
阳性率(%)
-
+
++
+++
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阳性率(%)
0.00
11
1
0
0
8.3
11
1
0
0
3.75
4
5
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2
1
66.7(1)
10
2
0
0
7.50
3
6
1
2
75.0(1)
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12
0
0
0
15.00
4
2
5
1
66.7(1)
11
1
0
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注：(1)和阴性对照相比，P<0.05
2.2 MTBE对大鼠肝组织中原癌基因和功能基因表达的影响
MTBE增强了大鼠肝组织cmyc基因的表达活性。点杂交结果显示，各剂量组肝组织中cmyc基因表达均较阴性对照组增强，且有一定的剂量关系。而GSTP基因的表达未见增高。表明MTBE可明显诱导大鼠肝组织中cmyc基因的高表达(表2)。
表2 MTBE对肝c-myc和GST-P基因点杂交影响(Mass值) 剂量(mg/kg)
cmyc基因
GST-基因
0
, http://www.100md.com 1.000
1.000
200
3.496
0.549
600
6.187
0.482
1000
6.863
0.658
探针
3.380
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6.201
3 讨论
原癌基因的表达失控在细胞转化中起重要作用，在肿瘤中也经常可见原癌基因的高表达。cmyc基因的产物是一种核蛋白，能影响基因转录和DNA复制，是调节细胞增殖和分化的关键物质之一。它的高表达可促进细胞增殖，抑制细胞分化。cmyc基因的高表达不仅可以出现在肿瘤组织中，也可以出现于肿瘤的形成过程中。通常cmyc蛋白在生长旺盛的细胞中表达较高，而在相对静止的细胞中表达较弱[4]。有资料显示仅提高cmyc蛋白的活性即可诱导静止细胞进入细胞周期[5]。本次研究分别采用了体外和体内试验，从蛋白水平和RNA水平均证明MTBE可诱导cmyc基因的高表达。可以认为，MTBE诱导细胞中cmyc基因表达活性增高，促进细胞增殖，是其使动物致癌的可能机制之一。
致癌物等代谢产生的亲电子物质与生物大分子，尤其是细胞中的DNA共价结合是肿瘤启动的关键因素。谷胱甘肽S-转移酶能够催化具有亲核位点的谷胱甘肽(GSH) 竞争性地与外来具有基因毒性的亲电子物质结合，保护生物大分子免受损伤，在细胞解毒中起着重要作用[6]。GST-P基因的表达与否，可作为某些肿瘤癌前诊断的指标。已知GST-P基因的表达增高，常与某些细胞癌变的早期启动有关[7]。本次实验中GST-P基因的表达活性未见升高，因此尚不能认为GST-P基因对MTBE的代谢有明显作用，也不能将GSH和酶活性的改变作为人体接触MTBE的标志。小鼠的急性和亚急性试验也显示，MTBE并未改变肝组织中谷胱甘肽的含量和谷胱甘肽-S-转移酶的活性[8]。
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国家自然科学基金资助课题(39670623)
作者简介：周伟，男，博士，讲师
参考文献
1 Stern BR,Kneiss JJ.Methyl Tertiarybutyl Ether(MTBE):Use as an Oxygenate in Fuels.J Appl Toxicol,1997,17(S1):1—2
2 宋后燕，朱运松主编.医用分子遗传学.上海：上海医科大学出版社，1990.205—214
3 Chomczynski P,Sacchi Nicoletta.Singlestep method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatephenolchloroform extraction.Analy Biochem,1987,162:156—159
, 百拇医药
4 Ferrari S,Calabretta B,Battini R et al.Expression of cmyc and induction of DNA synthesis by plateletpoor derived plasma in human diploid fibroblasts.Exp Cell Res,1988,174：25—33
5 Eilers M, Schirm S and Bishop,J M The Myc protein activates transcription of the alphaprothymosin gene.EMBOJ,1991,10:133—141
6 陈建敏，李春海.胎盘型谷胶甘肽S-转移酶研究新进展.生物化学与生物物理进展,1992，19(3)：177—180
7 杨俊保，谢大英，左瑾等.甲基丙烯酸环氧丙酯对金仓鼠胚胎细胞基因表达的影响.癌变.畸变.突变，1994，6(1)：6—10
8 Katoh T,Arashidani K,Kikuchi M et al.Effect of methyl tertiarybutyl ether on hepatic lipid peroxidation in mice.Nippon Eiseigaku Zasshi,1993,48(4):87—89A
修回1998-10-19, 百拇医药
单位：周 伟 叶舜华 上海医科大学环境卫生学教研室，上海 200032；黄关麟 张 恒 南京炼油厂职工医院
关键词：甲基叔丁基醚；cmyc基因；p21蛋白；GST-P基因
卫生研究990304 摘要：甲基叔丁基醚(MTBE)是一种新型的汽油添加剂，被用来提高汽油燃烧效率，减少汽车尾气中有害物质的排放。MTBE具有一定的动物致癌性，但其机制目前并不清楚。本研究采用免疫组织化学方法，检测了MTBE对体外培养的NIH3T3细胞中cmyc和p21蛋白表达的影响；采用点杂交方法，从RNA水平检测了MTBE亚慢性染毒大鼠肝组织中原癌基因cmyc基因和功能基因GST-P基因的表达情况。免疫组化结果显示，MTBE可诱导cmyc基因的高表达，对p21蛋白的表达未见明显影响。点杂交结果显示，MTBE可明显诱导大鼠肝组织中cmyc基因的高表达，而对GST-P基因的表达未见明显影响。上述结果提示，MTBE可诱导细胞中cmyc基因表达活性增高，可能是其动物致癌性的机制之一。
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中图分类号：R730.231.1 L473.5 Q623.423
Effect of methyl tertiary butyl ether on the expression
of protooncogenes and function genes
Zhou Wei,Huang Guanlin, Zhangheng et al.
Department of Environmental Health,Shanghai Medical University,Shanghai 200032,China
Methyl tertiary butyl ether (MTBE) is a new gasoline additive, which is used to increase the combustion of gasoline and to reduce the emission of harmful exhausts from automobile. The mechanism for the carcinogenesis of MTBE in animals is not clear.Immunohistochemistry method was used to detect the effect of MTBE on the expression of cmyc and p21 proteins in NIH3T3 cells. Dot hybridization method was used to explore the expression of cmyc gene and GSTP(glutathione StransferaseP) gene in the of MTBE treated rats.The results showed that MTBE could enhance the expression of cmyc protein,but had no effect on p21 protein. MTBE could induce high expression of cmyc gene,and had no effect on the expression of GSTP gene.These results suggest that the high expression of cmyc gene induced by MTBE might be one of the mechanisms of its carcinogenicity in animal.
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Key words: Methyl tertiary butyl ether, cmyc gene, p21 protein, GSTP gene
甲基叔丁基醚(methyl tertiary butyl ether,MTBE)是一种新型的汽油添加剂，被用来提高汽油燃烧效率，增加辛烷值，减少一氧化碳(CO)和其它一些有害物质的排放，并可替代铅用作汽油抗爆剂，在世界上已得到广泛应用。目前的研究结果显示，MTBE具有一定的动物致癌性，但其机制目前并不清楚[1]。不少研究表明，原癌基因(如cmyc、ras基因)和功能基因(谷胱甘肽S-转移酶P，GST-P基因)在细胞中受到某些化学致癌因子作用后，会在细胞中高表达，则细胞在以后的演变中可能形成肿瘤。为研究MTBE是否会影响原癌基因和功能基因的表达，进一步探讨MTBE动物致癌性的可能机制，作者采用免疫组织化学方法，检测了MTBE对体外培养的NIH3T3细胞中cmyc和p21蛋白表达的影响。采用点杂交方法，从RNA水平检测了MTBE亚慢性染毒大鼠肝细胞中原癌基因cmyc基因和功能基因GST-P基因的表达情况。
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1 材料和方法 MTBE由上海炼油厂提供，纯度为98.8%。主要杂质含量为三丁基醇(TBA)1.01%，二异丁烯(DIB)0.32%，C4 0.15%，C5 0.02%，和国外同类产品基本相同。
1.1 MTBE对NIH3T3细胞中cmyc、p21蛋白表达的影响
选用NIH3T3细胞(中国科学院上海细胞所提供)，按5×105密度接种于60mm培养瓶中。接种24小时后，加入不同浓度的MTBE，染毒72小时。染毒结束后，将细胞转种于含盖玻片的平皿中，继续培养72小时，当细胞生长至一定密度后，弃培养基，-20℃丙酮固定，ABC法检测cmyc和p21蛋白的表达情况。ABC试剂盒购自华美生物工程公司，鼠抗cmyc、p21购自Dako公司。未染毒细胞作阴性对照，正常鼠血清作替代对照。各剂量组中两种蛋白分别检测12张玻片，蛋白表达阳性判断标准为：阳性细胞<10%为-；10%～30%为+；30%～50%为；>50%为。
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1.2 MTBE对大鼠肝组织原癌基因和功能基因表达的影响
1.2.1 实验动物及处理
雄性SD大鼠40只，体重180～200g，由本校实验动物中心提供。将动物随机分成四组，每组10只。将MTBE溶于豆油中灌胃染毒，染毒剂量按体重分别为1000,600及200mg/kg；对照组给予等量豆油。每周5天，一天一次，共13周。各组动物于末次染毒后24h处死，迅速取出部分肝脏，液氮中速冻后-70℃保存。
1.2.2 探针的制备 含GST-P基因片断的PGP5质粒由中国医学科学院基础医学研究所左瑾惠赠。GST-P基因片断两端限制性内切酶的位点为EcoR Ⅰ和Sal Ⅰ,片断长0.72kb。质粒的扩增、酶切鉴定和纯化及回收均按文献方法进行[2]。cmyc探针(华美公司)片断长0.85kb。随机引物法地高辛标记探针。探针标记试剂盒来自Boehringer Mannheim公司。
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1.2.3 RNA的提取和点杂交 分别合并各剂量组动物肝脏，一步法提取总RNA[3]。样品变性后，按每孔30μg RNA点膜。所用探针浓度为125μg/ml。经预杂交、杂交，洗膜，封闭，最后避光显色8h，颜色紫兰色判断为阳性。所用杂交试剂盒来自Boehringer Mannheim公司。各孔颜色深浅用Image Master VDS Software(Phamacia Biotech)进行图像分析，计算mass值。
2 结果
2.1 MTBE对培养细胞中原癌基因蛋白表达的影响
试验结果(见表1)显示，各染毒组细胞中cmyc蛋白表达和玻片阳性率较阴性对照组明显增高，提示MTBE具有诱导cmyc基因高表达的作用，但各剂量组结果相比无明显的剂量-反应关系。各染毒组细胞中p21蛋白表达未见明显增强。
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表1 MTBE染毒NIH3T3细胞免疫组化检测结果 C/g.L-1
蛋白
蛋白
-
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阳性率(%)
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注：(1)和阴性对照相比，P<0.05
2.2 MTBE对大鼠肝组织中原癌基因和功能基因表达的影响
MTBE增强了大鼠肝组织cmyc基因的表达活性。点杂交结果显示，各剂量组肝组织中cmyc基因表达均较阴性对照组增强，且有一定的剂量关系。而GSTP基因的表达未见增高。表明MTBE可明显诱导大鼠肝组织中cmyc基因的高表达(表2)。
表2 MTBE对肝c-myc和GST-P基因点杂交影响(Mass值) 剂量(mg/kg)
cmyc基因
GST-基因
0
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1.000
200
3.496
0.549
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0.482
1000
6.863
0.658
探针
3.380
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6.201
3 讨论
原癌基因的表达失控在细胞转化中起重要作用，在肿瘤中也经常可见原癌基因的高表达。cmyc基因的产物是一种核蛋白，能影响基因转录和DNA复制，是调节细胞增殖和分化的关键物质之一。它的高表达可促进细胞增殖，抑制细胞分化。cmyc基因的高表达不仅可以出现在肿瘤组织中，也可以出现于肿瘤的形成过程中。通常cmyc蛋白在生长旺盛的细胞中表达较高，而在相对静止的细胞中表达较弱[4]。有资料显示仅提高cmyc蛋白的活性即可诱导静止细胞进入细胞周期[5]。本次研究分别采用了体外和体内试验，从蛋白水平和RNA水平均证明MTBE可诱导cmyc基因的高表达。可以认为，MTBE诱导细胞中cmyc基因表达活性增高，促进细胞增殖，是其使动物致癌的可能机制之一。
致癌物等代谢产生的亲电子物质与生物大分子，尤其是细胞中的DNA共价结合是肿瘤启动的关键因素。谷胱甘肽S-转移酶能够催化具有亲核位点的谷胱甘肽(GSH) 竞争性地与外来具有基因毒性的亲电子物质结合，保护生物大分子免受损伤，在细胞解毒中起着重要作用[6]。GST-P基因的表达与否，可作为某些肿瘤癌前诊断的指标。已知GST-P基因的表达增高，常与某些细胞癌变的早期启动有关[7]。本次实验中GST-P基因的表达活性未见升高，因此尚不能认为GST-P基因对MTBE的代谢有明显作用，也不能将GSH和酶活性的改变作为人体接触MTBE的标志。小鼠的急性和亚急性试验也显示，MTBE并未改变肝组织中谷胱甘肽的含量和谷胱甘肽-S-转移酶的活性[8]。
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国家自然科学基金资助课题(39670623)
作者简介：周伟，男，博士，讲师
参考文献
1 Stern BR,Kneiss JJ.Methyl Tertiarybutyl Ether(MTBE):Use as an Oxygenate in Fuels.J Appl Toxicol,1997,17(S1):1—2
2 宋后燕，朱运松主编.医用分子遗传学.上海：上海医科大学出版社，1990.205—214
3 Chomczynski P,Sacchi Nicoletta.Singlestep method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanatephenolchloroform extraction.Analy Biochem,1987,162:156—159
, 百拇医药
4 Ferrari S,Calabretta B,Battini R et al.Expression of cmyc and induction of DNA synthesis by plateletpoor derived plasma in human diploid fibroblasts.Exp Cell Res,1988,174：25—33
5 Eilers M, Schirm S and Bishop,J M The Myc protein activates transcription of the alphaprothymosin gene.EMBOJ,1991,10:133—141
6 陈建敏，李春海.胎盘型谷胶甘肽S-转移酶研究新进展.生物化学与生物物理进展,1992，19(3)：177—180
7 杨俊保，谢大英，左瑾等.甲基丙烯酸环氧丙酯对金仓鼠胚胎细胞基因表达的影响.癌变.畸变.突变，1994，6(1)：6—10
8 Katoh T,Arashidani K,Kikuchi M et al.Effect of methyl tertiarybutyl ether on hepatic lipid peroxidation in mice.Nippon Eiseigaku Zasshi,1993,48(4):87—89A
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