烟草致癌物诱发人支气管上皮恶性转化细胞中p16基因的变化
作者：孙红琰 龚诒芬 王全立 陈君石 杜芝燕 杨陟华
单位：孙红琰 王全立 杜芝燕 军事医学科学院野战输血研究所，北京 100850；龚诒芬 杨陟华 北京放射医学研究所，北京 100850；陈君石 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050
关键词：支气管上皮细胞；癌变；p16基因
卫生研究990303 摘要：采用银染PCR-SSCP方法检测NNK诱发BEP2D恶性转化细胞中p16基因变化。与对照组比较，转化细胞中p16基因的E1.β外显子带型出现变异，而第1～3外显子均未见泳动变位，提示E1.β外显子突变和/或缺失所致细胞周期失调是NNK诱发人类支气管上皮细胞癌变的可能原因之一。
中图分类号：R734 R730、231.1 Q319.33
, 百拇医药
Alterations of p16 gene in transformed BEP2D cells induced by NNK
Sun Hongyan,Gong Yifen,Wang Qualic,Chen Junshi,et al.
Institute of Transfusion Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China
Silver、staining PCR、SSCP method was used to detect the altrations of p16 gene in the transformed BEP2D cells induced by NNK.Compared with control cells,the abnormal shifting of the single、stranded DNA(ssDNA)in E1.β but not p16 Exon 1—3 was identified in transformed BEP2D cells.The results suggested that the mutation and/or deletion in p16 gene might be one cause of NNK、unduced carcinogenesis in human bronchial epichellium.
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Key words: bronchial epithelial cells carcinogenesis p16 gene
甲基亚硝胺吡啶基丁酮(NNK)是一种含量多、致癌力强的烟草特异致癌物，主要在支气管上皮细胞中代谢活化，因此，体外支气管上皮细胞培养是研究NNK致肺癌机理的重要手段。近年来先后建立的多种永生化人类支气管上皮细胞系，也更加方便了由体外实验结果向人类的外推。因此，NNK诱发HPV-18永生化人支气管上皮细胞系(BEP2D)恶性转化是研究烟草致癌物作用机理的理想途径。
肺癌形成是多步骤的发展过程，支气管上皮细胞增殖/分化的控制失调是其中的根本原因。p16作为一种重要的细胞周期抑制基因，可与cyclin D1/CDK4结合并抑制后者的活性，从而阻止pRB基因的磷酸化失活，研究表明，p16基因异常是人类肿瘤组织中最常见的遗传改变之一[1，2]。为了分析该基因在NNK诱发BEP2D细胞恶性转化中的作用，本研究采用非同位素PCR-SSCP方法检测了BEP2D恶性转化细胞中p16基因的异常变化。
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1 材料和方法
1.1 材料
BEP2D细胞系由美国癌症研究所Harris教授馈赠；裸鼠(雄性，6周龄)购自卫生部生物制品检定所；NNK为Chemsyn Science Lab.产品；LHC基础无血清培养液、细胞生长因子及所需无机元素的贮存液均购自美国Biofluid公司；p16INK4(C-21)兔多抗为Santa、Cruz产品；引物序列为：外显子1：F 5'、GGAATTCGGAGAGGGGGAGAACAG,R 5'、GAAGCTTTCCCCTTTTTCCGGAGAATCG;外显子2：F 5'、GGAATTCCTCTACACAAGCTTCCTTTCC,R 5'、GAA GCTTGGGCTGAACTTTCTGTGCTGG;外显子3：F 5'、GGAATTCTGTTCCACACATCTTTG,R 5'、AAAACTACGAAAGCGGG;E1.β:F 5'、AGTCTGCAGTTAAGG,R 5'、GGCTAGAGGCGAATTATA TCTGT,均由美国Gibco Life Inc.合成。
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1.2 方法
1.2.1 BEP2D细胞恶性转化模型的建立：参照文献[3]。
1.2.2 聚合酶链反应(PCR) 外显子1：94℃变性60秒，60℃退火90秒，72℃延伸60秒；外显子2：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒；外显子3：94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒；进行35个循环，最后72℃继续保温10分钟。
1.2.3 SSCP分析 纯化的PCR产物经乙醇沉淀溶解于10μl 50%甲酰胺中，加2μl 6×上样缓冲液，98℃变性5分钟，冰浴冷却后进行中性聚丙烯酰胺凝胶电泳(凝胶浓度：外显子1和3为12%，外显子2和E1.β为8%)。电泳结束后，凝胶于固定液(10%乙酸)中固定30分钟；去离子水洗3分钟；加染色液(0.1%硝酸银，0.056%甲醛)40分钟；去离子水洗胶20秒；加显色液(30%碳酸钠，0.056%甲醛，0.02%硫代硫酸钠)10～15分钟；加固定液停止显色，并用去离子水充分洗涤，5分钟×3次；照相。
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2 结果
2.1 BEP2D细胞恶性转化中的生物学特性变化
BEP2D细胞经500μg/ml NNK处理后，在体外可连续传代，第5代细胞显示抗血清生长；第15代细胞在半固体琼脂中的集落形成率是对照细胞的11倍；第25代细胞在裸鼠体内成瘤，组织学证实为高分化鳞状细胞癌。
2.2 PCR-SSCP分析
分别以转化细胞及对照细胞的基因组DNA为模板，对p16的第1、2、3外显子进行扩增，特异性片段大小分别为200、475、190和375bp;经回收纯化后，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定纯化结果，如图1示，回收片段和预期相符。采用PCR-SSCP方法对p16基因的第1～3和E1.β外显子进行分析，结果显示：与对照相比，转化细胞有E1.β外显子带型出现变异，提出转化细胞中E1.β外显子存在异常。而第1～3外显子均未见泳动变位(图2、3)。
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Gel electrophoresis analysis of PCR products of p16/MTS1 exon1,2,3 and MTS1 E1.β in control BEP2D(Lane 1) and its transformed variants(Lane 2). M1:pBR322/Msp1; M2:pBR322/Hinfl图1 PCR产物的回收纯化结果鉴定
Non、isotopic PCR、SSCP analysis of p16/MTS1 exon 2 and 3 in control BEP2D cells(Lanes 1) and its transformed variants(Lanes 2).图2 转化细胞和对照细胞中p16基因的PCR-SSCP分析结果
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图3 转化细胞和对照细胞E1.β外显子的PCR-SSCP分析结果
3 讨论
细胞周期抑制基因的异常变化与细胞癌变的关系是当前肿瘤分子生物学研究的重点内容，NNK诱发HPV-18永生化人支气管上皮细胞恶性转化模型为深入探讨吸烟致癌的分子机理提供了理想的实验材料。迄今人们已发现Cip1/Kip1和Ink4两个家族的多种细胞周期负调节基因，p16INK4a则是其中最重要的成员之一，该基因定位于人类第9号染色体短臂(9p21)，编码一种分子量为16kd的细胞周期调控蛋白。已发现该基因在许多肿瘤中存在异常，包括基因缺失、基因突变和过度甲基化[4—7]。本研究采用银染PCR-SSCP方法检测了NNK诱发BEP2D恶性转化细胞中p16基因变化，观察到转化细胞中p16基因E1.β外显子带型出现变异，而第1～3外显子均未见泳动变位，提示E1.β外显子突变和/或缺失所致细胞周期失调是NNK诱发人类支气管上皮细胞癌变的可能原因之一。虽然PCR-SSCP方法未检测到恶性转化细胞中p16基因的结构变化，但由于该方法仅能分析基因中存在的重组、缺失或突变，因此尚不能排除因p16基因第1、2外显子CpG区甲基化而使其功能受到影响的可能性。
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p16基因的转录后剪接机制使其编码p16INK4a和F-p16/p19ARF两种不同产物。有关p16INK4a和F-p16/p19ARF之间的关系，人们推测两者的转录可能具有一定的先后顺序并相互参与对方的调节机制。与p16不同的是，F-p16/p19ARF不能与cyclin D1/CDK4结合并抑制后者的活性；而是通过另外一种机制调节细胞周期的进展。已发现p53通过下游效应基因mdm、2上调诱导p19ARF蛋白过度表达，从而使得它对细胞周期的控制已不仅局限于G1期，而扩展到G2/M期[8，9]。本研究检测到BEP2D恶性转化细胞中E1.β外显子有异常改变，提示功能异常的p19ARF蛋白对细胞DNA损伤不能有效作出反应，使得细胞周期不能及时终止于G1期和G2/M期，因而破坏了DNA复制的忠实性，并导致基因组的不稳定性。本研究结果为F-p16/p19ARF和吸烟致癌的关系提供了实验根据，但其中机理尚有待进一步探讨。
作者简介：孙红琰，男，博士，助理研究员
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参考文献
1 Serrano M,Hannon G and Beach D.A new regulatory motiff in cell、cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.Nature.1993,366:704—707
2 Kamb A,Gruis N,Weaver、Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potentially involvd in genesis of many tumor type.Science.1994,264：436)438
3 孙红琰，龚治芬，王全立，等.烟草特异亚硝胺NNK诱发HPV-18永生化人类支气管上皮细胞恶性转化.卫生研究，1999,28(2):95—96
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4 Woloshcak M,Yu AQ,Xiao JQ,et al.Frequent loss of the p16INK4A gene product in human pituiary tumors.Cancer Res.1996,56:2493—2496
5 Maesawa C,Tamura G,Nishizuka S,et al.Inactivation of the CDKN2 gene by homozygous deletion and Novo methylation is associated with advanced stage esophageal squamous cell carcinoma.Cancer Res.1996,56:3875—3878
6 Pollock PM,Pearson J,Hayward N.Compilation of somatic mutations of the CDKN2 gene in the human cancers:non、random distribution of base substitutions.Genes Chromosomes Cancer.1996,15:77—88
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7 Fueyo J,Gomez、Manzano C.Hypermethylation of the CpG island of p16/CDKN2 correlates with gene inactivation in gliomas.Oncogene, 1996,13:1615—1619
8 Larsen C.p16INK4A:a gene with a dual capacity to encode unrelated proteins that inhibit cell cycle progression.Oncogene.1996,12:2041—2044
9 Quelle E,Zindy F,Ashumun R,et al.Alternative reading frames of the INK4a tumor suppressor gene encode two unrelated proteins capable of inducing cell cycel areast.Cell, 1995,83:993—1000
收稿1998-10-18, http://www.100md.com
单位：孙红琰 王全立 杜芝燕 军事医学科学院野战输血研究所，北京 100850；龚诒芬 杨陟华 北京放射医学研究所，北京 100850；陈君石 中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050
关键词：支气管上皮细胞；癌变；p16基因
卫生研究990303 摘要：采用银染PCR-SSCP方法检测NNK诱发BEP2D恶性转化细胞中p16基因变化。与对照组比较，转化细胞中p16基因的E1.β外显子带型出现变异，而第1～3外显子均未见泳动变位，提示E1.β外显子突变和/或缺失所致细胞周期失调是NNK诱发人类支气管上皮细胞癌变的可能原因之一。
中图分类号：R734 R730、231.1 Q319.33
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Alterations of p16 gene in transformed BEP2D cells induced by NNK
Sun Hongyan,Gong Yifen,Wang Qualic,Chen Junshi,et al.
Institute of Transfusion Medicine,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850,China
Silver、staining PCR、SSCP method was used to detect the altrations of p16 gene in the transformed BEP2D cells induced by NNK.Compared with control cells,the abnormal shifting of the single、stranded DNA(ssDNA)in E1.β but not p16 Exon 1—3 was identified in transformed BEP2D cells.The results suggested that the mutation and/or deletion in p16 gene might be one cause of NNK、unduced carcinogenesis in human bronchial epichellium.
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Key words: bronchial epithelial cells carcinogenesis p16 gene
甲基亚硝胺吡啶基丁酮(NNK)是一种含量多、致癌力强的烟草特异致癌物，主要在支气管上皮细胞中代谢活化，因此，体外支气管上皮细胞培养是研究NNK致肺癌机理的重要手段。近年来先后建立的多种永生化人类支气管上皮细胞系，也更加方便了由体外实验结果向人类的外推。因此，NNK诱发HPV-18永生化人支气管上皮细胞系(BEP2D)恶性转化是研究烟草致癌物作用机理的理想途径。
肺癌形成是多步骤的发展过程，支气管上皮细胞增殖/分化的控制失调是其中的根本原因。p16作为一种重要的细胞周期抑制基因，可与cyclin D1/CDK4结合并抑制后者的活性，从而阻止pRB基因的磷酸化失活，研究表明，p16基因异常是人类肿瘤组织中最常见的遗传改变之一[1，2]。为了分析该基因在NNK诱发BEP2D细胞恶性转化中的作用，本研究采用非同位素PCR-SSCP方法检测了BEP2D恶性转化细胞中p16基因的异常变化。
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1 材料和方法
1.1 材料
BEP2D细胞系由美国癌症研究所Harris教授馈赠；裸鼠(雄性，6周龄)购自卫生部生物制品检定所；NNK为Chemsyn Science Lab.产品；LHC基础无血清培养液、细胞生长因子及所需无机元素的贮存液均购自美国Biofluid公司；p16INK4(C-21)兔多抗为Santa、Cruz产品；引物序列为：外显子1：F 5'、GGAATTCGGAGAGGGGGAGAACAG,R 5'、GAAGCTTTCCCCTTTTTCCGGAGAATCG;外显子2：F 5'、GGAATTCCTCTACACAAGCTTCCTTTCC,R 5'、GAA GCTTGGGCTGAACTTTCTGTGCTGG;外显子3：F 5'、GGAATTCTGTTCCACACATCTTTG,R 5'、AAAACTACGAAAGCGGG;E1.β:F 5'、AGTCTGCAGTTAAGG,R 5'、GGCTAGAGGCGAATTATA TCTGT,均由美国Gibco Life Inc.合成。
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1.2 方法
1.2.1 BEP2D细胞恶性转化模型的建立：参照文献[3]。
1.2.2 聚合酶链反应(PCR) 外显子1：94℃变性60秒，60℃退火90秒，72℃延伸60秒；外显子2：94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸40秒；外显子3：94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸30秒；进行35个循环，最后72℃继续保温10分钟。
1.2.3 SSCP分析 纯化的PCR产物经乙醇沉淀溶解于10μl 50%甲酰胺中，加2μl 6×上样缓冲液，98℃变性5分钟，冰浴冷却后进行中性聚丙烯酰胺凝胶电泳(凝胶浓度：外显子1和3为12%，外显子2和E1.β为8%)。电泳结束后，凝胶于固定液(10%乙酸)中固定30分钟；去离子水洗3分钟；加染色液(0.1%硝酸银，0.056%甲醛)40分钟；去离子水洗胶20秒；加显色液(30%碳酸钠，0.056%甲醛，0.02%硫代硫酸钠)10～15分钟；加固定液停止显色，并用去离子水充分洗涤，5分钟×3次；照相。
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2 结果
2.1 BEP2D细胞恶性转化中的生物学特性变化
BEP2D细胞经500μg/ml NNK处理后，在体外可连续传代，第5代细胞显示抗血清生长；第15代细胞在半固体琼脂中的集落形成率是对照细胞的11倍；第25代细胞在裸鼠体内成瘤，组织学证实为高分化鳞状细胞癌。
2.2 PCR-SSCP分析
分别以转化细胞及对照细胞的基因组DNA为模板，对p16的第1、2、3外显子进行扩增，特异性片段大小分别为200、475、190和375bp;经回收纯化后，1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定纯化结果，如图1示，回收片段和预期相符。采用PCR-SSCP方法对p16基因的第1～3和E1.β外显子进行分析，结果显示：与对照相比，转化细胞有E1.β外显子带型出现变异，提出转化细胞中E1.β外显子存在异常。而第1～3外显子均未见泳动变位(图2、3)。
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Gel electrophoresis analysis of PCR products of p16/MTS1 exon1,2,3 and MTS1 E1.β in control BEP2D(Lane 1) and its transformed variants(Lane 2). M1:pBR322/Msp1; M2:pBR322/Hinfl图1 PCR产物的回收纯化结果鉴定
Non、isotopic PCR、SSCP analysis of p16/MTS1 exon 2 and 3 in control BEP2D cells(Lanes 1) and its transformed variants(Lanes 2).图2 转化细胞和对照细胞中p16基因的PCR-SSCP分析结果
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图3 转化细胞和对照细胞E1.β外显子的PCR-SSCP分析结果
3 讨论
细胞周期抑制基因的异常变化与细胞癌变的关系是当前肿瘤分子生物学研究的重点内容，NNK诱发HPV-18永生化人支气管上皮细胞恶性转化模型为深入探讨吸烟致癌的分子机理提供了理想的实验材料。迄今人们已发现Cip1/Kip1和Ink4两个家族的多种细胞周期负调节基因，p16INK4a则是其中最重要的成员之一，该基因定位于人类第9号染色体短臂(9p21)，编码一种分子量为16kd的细胞周期调控蛋白。已发现该基因在许多肿瘤中存在异常，包括基因缺失、基因突变和过度甲基化[4—7]。本研究采用银染PCR-SSCP方法检测了NNK诱发BEP2D恶性转化细胞中p16基因变化，观察到转化细胞中p16基因E1.β外显子带型出现变异，而第1～3外显子均未见泳动变位，提示E1.β外显子突变和/或缺失所致细胞周期失调是NNK诱发人类支气管上皮细胞癌变的可能原因之一。虽然PCR-SSCP方法未检测到恶性转化细胞中p16基因的结构变化，但由于该方法仅能分析基因中存在的重组、缺失或突变，因此尚不能排除因p16基因第1、2外显子CpG区甲基化而使其功能受到影响的可能性。
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p16基因的转录后剪接机制使其编码p16INK4a和F-p16/p19ARF两种不同产物。有关p16INK4a和F-p16/p19ARF之间的关系，人们推测两者的转录可能具有一定的先后顺序并相互参与对方的调节机制。与p16不同的是，F-p16/p19ARF不能与cyclin D1/CDK4结合并抑制后者的活性；而是通过另外一种机制调节细胞周期的进展。已发现p53通过下游效应基因mdm、2上调诱导p19ARF蛋白过度表达，从而使得它对细胞周期的控制已不仅局限于G1期，而扩展到G2/M期[8，9]。本研究检测到BEP2D恶性转化细胞中E1.β外显子有异常改变，提示功能异常的p19ARF蛋白对细胞DNA损伤不能有效作出反应，使得细胞周期不能及时终止于G1期和G2/M期，因而破坏了DNA复制的忠实性，并导致基因组的不稳定性。本研究结果为F-p16/p19ARF和吸烟致癌的关系提供了实验根据，但其中机理尚有待进一步探讨。
作者简介：孙红琰，男，博士，助理研究员
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参考文献
1 Serrano M,Hannon G and Beach D.A new regulatory motiff in cell、cycle control causing specific inhibition of cyclin D/CDK4.Nature.1993,366:704—707
2 Kamb A,Gruis N,Weaver、Feldhaus J,et al.A cell cycle regulator potentially involvd in genesis of many tumor type.Science.1994,264：436)438
3 孙红琰，龚治芬，王全立，等.烟草特异亚硝胺NNK诱发HPV-18永生化人类支气管上皮细胞恶性转化.卫生研究，1999,28(2):95—96
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4 Woloshcak M,Yu AQ,Xiao JQ,et al.Frequent loss of the p16INK4A gene product in human pituiary tumors.Cancer Res.1996,56:2493—2496
5 Maesawa C,Tamura G,Nishizuka S,et al.Inactivation of the CDKN2 gene by homozygous deletion and Novo methylation is associated with advanced stage esophageal squamous cell carcinoma.Cancer Res.1996,56:3875—3878
6 Pollock PM,Pearson J,Hayward N.Compilation of somatic mutations of the CDKN2 gene in the human cancers:non、random distribution of base substitutions.Genes Chromosomes Cancer.1996,15:77—88
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7 Fueyo J,Gomez、Manzano C.Hypermethylation of the CpG island of p16/CDKN2 correlates with gene inactivation in gliomas.Oncogene, 1996,13:1615—1619
8 Larsen C.p16INK4A:a gene with a dual capacity to encode unrelated proteins that inhibit cell cycle progression.Oncogene.1996,12:2041—2044
9 Quelle E,Zindy F,Ashumun R,et al.Alternative reading frames of the INK4a tumor suppressor gene encode two unrelated proteins capable of inducing cell cycel areast.Cell, 1995,83:993—1000
收稿1998-10-18, http://www.100md.com