椰毒假单胞菌酵米面亚种16S rDNA序列测定与分析
作者：焦振泉 刘秀梅 杨瑞馥 孟昭赫
单位：中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050
关键词：椰酵假单胞菌；16S rDNA序列；系统发育
椰毒假单胞菌酵米面亚种16S rDNA 序列测定与分析
摘要 本文对3种不同来源样品的4株椰酵假单胞菌的16S rDNA的序列进行了测定，以确定其系统发育位置及与其它菌种的遗传进化关系。实验中设计了7条引物，利用聚合酶链式反应(Polymase Chain Reaction,PCR)扩增4株细菌的16S rDNA，通过扩增产物的克隆测序或直接测序，获得了它们的16S rDNA序列，将测得的序列与伯克霍尔德氏菌属中其它菌种的16S rDNA序列进行了聚类分析，得到了系统发育进化树状图。树状图及不同菌种之间的同源性比值：椰酵假单胞菌(P.cocovenenans subsp.farinofermentans)与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)、椰毒伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cocovenenans)的亲缘关系非常近，与其它菌种的亲缘关系相对较远，椰酵假单胞菌、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌和椰毒伯克霍尔德氏菌可归属于一个独立的系统发育系。
, http://www.100md.com
中图分类号 R155.31 TS 207.4 Q939.110.1
Squencing and analysis of 16S rDNA sequences for
P.cocovenenans subsp farinofermentans
Jiao Zhenquan,Liu Xiumei,Yang Ruifu,Meng Zhaohe
Institute of Nutrition and Food Hygiene,Chinese Academy of Preventive Medicine Beijing 100050,China
In order to fix the phylogenetic taxonomic position of P.cocovenenans subsp.farinofermentans and describe its relationships with other closed species,seven primers were designed to amplify and sequence the 16S rDNA of 4 strains of it by using a clonal sequencing or direct sequencing method.The 16S rDNA sequence of the 4 strains were aligned with the 16S rDNA sequences of other species in genus Burkholderia,and the polygenetic tree was produced by using a Clustal V and treeview software.The results showed that P.cocovenenans subsp.farinofermentans was in a high homology with Burkholderia gladioli and Burkholderia cocovenenans， and they formed an independent phylogenetic clustal of genus Burkholderia.
, http://www.100md.com
Key words: P.cocovenenans subsp.farinofermentans,16S rDNA sequcence,phylogeny
椰毒假单胞菌酵米面亚种(Pseudomonas cocovenenans subsp.farinofermentans,简称椰酵假单胞菌)是我国学者于1977年在东北酵米面中毒食物中发现的一种新的食物中毒菌(曾暂命名为酵米面黄杆菌[1])。米酵菌酸和毒黄素是该菌产生的两种主要毒素，其中前者是引起食物中毒和死亡的主要毒性代谢产物，肝、脑、肾等主要实质性脏器是该毒素作用的靶器官。椰毒假单胞菌酵米面亚种可污染鲜银耳、酵米面、醋凉粉、汤圆粉和马铃薯粉等多种食品而变质发生食物中毒[2]。
近10多年来，我们研究室在有关椰酵假单胞菌的菌体抗原结构，生化鉴定和检测方法及米酵菌酸结构的鉴定、产毒机制和消毒，去毒等方面进行了广泛和深入的研究。刘秀梅在美国ATCC(America Type Culture Collection)所做的研究结果显示：椰假单胞菌在生物学性状上与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌更为接近。邱茂锋等在利用rDNA指纹图对椰酵假单胞菌、椰毒伯克霍尔德氏菌和唐菖蒲伯克霍尔德氏菌进行对比研究时发现：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的图谱谱形与椰酵假单胞菌的RT9型相同，而椰毒伯克霍尔德氏菌与椰酵假单胞菌在谱形上则存在差别，缺乏椰酵假单胞菌所共有的唯一杂交带，说明椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的亲缘关系更为接近[3]。
, http://www.100md.com
近几年来，细菌的分类学发展迅速，已经从单一的表型分类发展为系统分类、多相分类；即利用表型、遗传型和系统发育信息来区分细菌，进而阐述细菌的遗传进化关系。自从Woese根据16S rRNA序列将所有生命分成3个域后[4]，作为细菌分类的系统发育框架基础16S rRNA，以其作为“细菌化石”的高度保守特点而被越来越多的分类学家所重视，它使人们可以进一步了解细菌的生命进化关系。
本研究的目的就是分析来源于3种不同样品的椰酵假单胞菌的16S rDNA序列，以确定它与椰毒伯克霍尔德氏菌和唐菖蒲伯克霍尔德氏及与伯克霍尔德氏菌属中其它菌种的遗传进化关系。
1 材料和方法
1.1 实验菌株
本实验选用椰毒假单胞菌酵米面亚种(Pseudomonas cocovenenans subsp.farinofermentans)的4个样品中的分离株进行16S rDNA序列测定：HN2y (CCTCCAB9725)1989年于银耳中分离，Co14 于1977年酵米面中分离，Sx8801于1987年由醋凉粉中分离，90-3于1990年由酵米面中分离。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 DNA的制备
菌株总DNA的提取：菌株用LB培养基培养至对数生长期，以8000r/min离心收集菌体，用SDS溶液进行裂解，再用酚/氯仿/异戊醇抽提和RNA酶消化，最后用乙醇沉淀，溶于TE(10mmol/L Tris-HCl,pH7.6及1mmol/L EDTA,pH8.0)中。
1.2.2 16S rRNA引物的设计
根据16S rRNA高度保守的特点，从其保守区域寻找引物位点，利用Oligo 4.1软件设计引物，共合成7条引物。
正向引物：
Primer 1:5'-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3'(对应于大肠杆菌的第8—27bp)，Primer 2:5'-GTA GTC CAC GCT GTA AAC GAT G-3'(对应于大肠杆菌的第774—795bp)反向引物：
, 百拇医药
Primer 6:5'-CTA CGT TTA CAG CGT GGA CTA C-3'(对应于大肠杆菌的第795—774bp)
Primer 7:5'-TAC GGT TAC CTT GTT ACG AC-3'(对应于大肠杆菌的第1504—1485bp)
其它的3条引物序列分别为：
Primer 3:5’-CTA CGG GAG GCA GCA GTG GG-3'
Primer 4:5'-CAG CAG CCG CGG TAA T-3'
Primer 5:5'-AAA CTT AAA GGA ATT GAC GG-3'。
1.2.3 16S rRNA基因扩增及序列测定
, 百拇医药
以总的DNA为模板，用引物P1，P7经PCR反应扩增出总的16S rDNA，PCR反应条件为：预变性94℃ 3min；变性94℃ 1min，退火55℃ 1min，复性72℃ 1min；最后延伸72℃ 10min，反应35个循环。对于HN2y和Co14,以总的16S rDNA为模板，用引物P1，P6及P2，P7进行PCR扩增，扩增产物用PGEM-T载体进行钝端连接后转化大肠杆菌JM109，经蓝白斑筛选及质粒大小比较后，以T7和SP6为测序引物利用A373 DNA自动测序仪进行测序。对于Sx8801和90-3则用总的16S rDNA为测序模板，用P1，P3，P4，P2及P5为测序引物在A373 DNA自动测序仪直接进行测序。
1.2.4 16S rDNA序列分析
将伯克霍尔得氏菌属(Burkholderia)中其它菌种的16S rDNA序列以GenBank/EMBL/DDBJ核酸序列库中检索出来[5]，它们包括唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(B.gladioli)、椰毒伯克霍尔德尔菌(B.cocovenenan)、洋葱伯克霍尔德氏菌(B.cepacia)、须芒草伯克霍尔德氏菌(B.andropogonis)、石竹伯克霍尔德氏菌(B.cariophylli)、植物伯克霍尔德氏菌(B.plantarii)、范氏伯克霍尔德氏菌(B.vandii)、越南伯克霍尔德氏菌(B.vienamiensis)、范氏伯克霍尔德菌(B.vandii)、越南伯克霍尔德尔菌(B.vienamiensis)、吡咯菌素伯克霍尔德氏菌(B.pyrrocinia)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.mallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.pseudomallei)、泰国伯克霍尔德氏菌(B.thailandensis)、格氏伯克霍尔德氏菌(B.glathei)、吩嗪伯克霍尔德氏菌(B.phenazinium)荚壳伯克霍尔德菌(B.glumae)及B.graminis,将这些菌株的16S rDNA序列与测得的四株椰酵假单胞菌的16S rDNA序列利用Clustal Ⅴ软件进行排列[6]，选用1307bp(相当于大肠杆的145-1452bp位置)进行比较，选取大肠杆菌(Escherchia coli,E.coli)作为系统发育进化树的根部，用Neighbor-Joining方法构建系统发良进行树状图[7]，用Treeview 3.2软件绘制系统发育进化树。各菌株的16S rDNA基因序列的核酸序列库中的索取号分别是：
, 百拇医药
B.gladioli X67038,B.cocovenenan U96934,B.cepacia U96927,B.andropogoni X 67037,B.cariophylli X 67039,B.plantarii U96933,B.vandii U96932,B.vienamiensis U96928,B.pyrrocinia U96930,B.mallei,B.pseudomallei BPU91839,B.thailandensis BSU91838,B.glathei Y17052,B.phenaxinium U9636,B.glumae U96931,B.graminis U96940,E.coli J01859.
2 结果与讨论
2.1 序列测定
我们利用8条引物，应用PCR扩增产物克隆后测定及直接测序两种方法获得了椰酵假单胞菌HN2y,Co14,90-3和Sx8801四个菌株的16S rDNA序列，大小分别为1484bp,1499bp,1352bp和1369bp,序列见GenBank。
, http://www.100md.com
2.2 序列分析 将椰酵假单胞菌的4株菌的16S rDNA序列与伯克霍尔得氏菌属中其它菌种的16S rDNA序列利用Clustal V软件进行比较、聚类，用Treeview软件获得了系统发育进化树状图，如附图所示。不同菌种之间的同源性比值及核苷酸替代率Knuc见表2[8]。
附图 椰毒假单胞菌酵米面亚种的系统发展进化树
(1)0.01代表每个核苷酸位置存在1%的突变率
表2 伯克霍尔德氏菌属中不同菌种之间的同源性比值和Knuc值
Species
, 百拇医药
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1.E.coli
0.175
0.176
0.179
, http://www.100md.com
0.180
0.181
0.179
0.177
0.186
0.180
2.B.gladioli ATCC 10248
82.5
0.004
0.007
0.005
0.004
, 百拇医药
0.020
0.002
0.035
0.009
3.HN2y
82.4
99.6
0.012
0.009
0.008
0.025
0.006
0.039
, http://www.100md.com
0.014
4.Co14
82.1
99.3
98.8
0.010
0.009
0.026
0.007
0.039
0.015
5.90-3
82.0
, 百拇医药
99.5
99.1
99.0
0.001
0.025
0.006
0.039
0.014
6.Sx8801
81.9
99.6
99.2
99.1
, 百拇医药
99.9
0.024
0.005
0.038
0.013
7.B.cepacia ATCC 25416
82.1
98.0
97.5
97.4
97.5
97.6
, 百拇医药 0.018
0.038
0.015
8.B.cocovenenans ATCC 3366
82.3
99.8
99.4
99.3
99.4
99.5
98.2
0.035
, http://www.100md.com 0.009
9.B.glathei ATCC 2915
81.4
96.5
96.1
96.1
96.1
96.2
96.2
96.5
0.035
10.B.glumae
, 百拇医药 82.0
99.1
98.6
98.5
98.6
98.7
98.5
99.1
96.5
11.B.graminis
82.0
95.1
94.7
, 百拇医药
94.6
94.7
94.8
95.1
95.2
95.7
95.2
12.B.phenazinium LMG 2247
81.4
96.2
95.7
95.6
, http://www.100md.com 95.7
95.8
96.1
96.2
96.9
96.3
13.B.plantarii JCM 5492
82.0
99.3
98.8
98.8
98.9
98.9
, 百拇医药
97.9
99.3
96.6
99.2
14.B.pseudomallei ATCC 233
82.1
97.8
97.3
97.2
97.3
97.4
98.0
, http://www.100md.com 97.8
96.3
98.1
15.B.pyrrocinia ATCC 15958
81.9
98.5
98.1
98.0
98.1
98.2
99.2
98.5
96.6
, 百拇医药
98.8
16.B.thailandensis E 264
82.0
97.8
97.4
97.3
97.4
97.5
98.3
97.8
96.3
98.2
, http://www.100md.com 17.B.vandii JCM 7957
81.9
99.2
98.7
98.6
98.7
98.8
98.1
99.2
96.6
99.5
18.B.vietnamiensis LMG 1092
, 百拇医药
82.1
98.2
97.8
97.7
97.8
97.9
99.5
98.2
96.2
98.7
19.B.andropogonis ATCC 230
83.0
, 百拇医药 97.0
96.6
96.5
96.5
96.6
95.8
96.9
95.9
96.8
20.B.caryophylli ATCC 25418
81.8
96.3
95.9
, 百拇医药
95.7
95.8
95.9
96.7
96.4
95.5
96.5
Species
11
12
13
14
15
, 百拇医药
16
17
18
19
20
1.E.coli
0.180
0.186
0.180
0.179
0.181
0.180
0.181
, 百拇医药
0.179
0.170
0.182
2.B.gladioli ATCC 10248
0.049
0.038
0.007
0.022
0.015
0.022
0.008
0.018
, 百拇医药
0.030
0.037
3.HN2y
0.053
0.043
0.012
0.027
0.019
0.026
0.013
0.022
0.034
0.041
, 百拇医药
4.Co14
0.054
0.044
0.012
0.028
0.020
0.027
0.014
0.023
0.035
0.043
5.90-3
0.053
, http://www.100md.com
0.043
0.012
0.027
0.019
0.026
0.013
0.022
0.035
0.042
6.Sx8801
0.052
0.042
0.011
, 百拇医药
0.026
0.018
0.025
0.012
0.021
0.034
0.041
7.B.cepacia ATCC 25416
0.049
0.039
0.021
0.020
, http://www.100md.com
0.008
0.017
0.019
0.005
0.042
0.033
8.B.cocovenenans ATCC 3366
0.048
0.038
0.007
0.022
0.015
, http://www.100md.com
0.022
0.008
0.018
0.031
0.036
9.B.glathei ATCC 2915
0.043
0.031
0.034
0.037
0.034
0.037
, http://www.100md.com
0.034
0.038
0.041
0.045
10.B.glumae
0.048
0.037
0.008
0.019
0.012
0.018
0.005
0.013
, http://www.100md.com
0.032
0.035
11.B.graminis
0.028
0.450
0.042
0.046
0.042
0.048
0.052
0.056
0.045
, http://www.100md.com 12.B.phenazinium LMG 2247
97.2
0.370
0.039
0.035
0.038
0.038
0.041
0.048
0.038
13.B.plantarii JCM 5492
95.5
, 百拇医药
96.3
0.020
0.015
0.022
0.005
0.017
0.030
0.036
14.B.pseudomallei ATCC 233
95.8
96.1
98.0
, 百拇医药
0.020
0.010
0.021
0.018
0.040
0.029
15.B.pyrrocna ATCC 15958
95.4
96.5
98.5
98.0
0.018
, 百拇医药
0.015
0.011
0.037
0.033
16.B.thailandensis E 264
95.8
96.2
97.8
99.0
98.2
0.021
0.018
, 百拇医药
0.041
0.029
17.B.vandill JCM 7957
95.2
96.2
99.5
97.9
98.5
97.9
0.017
0.031
0.038
, http://www.100md.com 18.B.vietnamiensis LMG 1092
94.8
95.9
98.3
98.2
98.9
98.2
98.3
0.038
0.035
19.B.andropogonis ATCC 230
94.4
, 百拇医药
95.2
97.0
96.0
96.3
95.9
96.9
96.2
0.049
20.B.caryophylli ATCC 25418
95.5
96.2
96.4
, http://www.100md.com 97.1
96.7
97.1
96.2
96.5
95.1
从附图中我们可以看出：伯克霍尔德氏菌属主要由7个分支组成，其中B.pseudomallei、B.mallei 与 B.thailandensis近缘，三者构成了第1个分支；B.cepacia 包含在第2个分支中，在这个分支中还有B.vietnamiensis与B.pyrrocinia,其中B.cepacia与B.vietnamiensis近缘；第3个分支由B.vandill、B.plantarii 与B.glumae 3个菌种组成；B.andropogonis与B.caryophylli分别占据第4，第5个分支；B.phenazinium、B.graminis与B.glathei构成了伯克霍尔德氏菌属的第6个分支；我们所要研究的椰酵假单细菌的4个菌株与B.gladioli、B.cocovenenans组成了第7个分支，它们在遗传距离非常接近，与第3个分支遗传关系非常近；所以从16S rDNA序列上来看，椰酵假单胞菌与B.gladioli、B.cocovenenans非常近缘。
, 百拇医药
任何一种细菌在它的进化过程中都与周围的其它细菌存在着各种各样的关系，在遗传距离上或远或近，从表2中可以看出：伯克霍德尔菌属中各个菌种与大肠杆菌的同源性比较低(81.4%～83.0%)，而它们之间的同源性非常高(94.4%～99.9%)，其中B.gladioli与B.cocovenenans 也具有很高的同源性(99.8%)，二者之间只有7个碱基不同，而且还包括在B.gladioli序列中存在3个“N”，B.cocovenenans序列中存在1个“N”，实际上只有2个碱基的不同，也就是说这2个菌种在16S rDNA序列上不可以区分。B.vandii与B.plantarii、B.glumae 的同源性比值均是99.5%，B.pseudomallei与B.mallei、B.thailandensis的同源性比值分别为99.8%和99.0%，它们在遗传进化关系上均比较近缘，椰酵假单胞菌的4个菌株与B.gladioli、B.cocovenenans的同源性比值分别为99.3%～99.6%和99.3%～99.5%，这说明从16S rRNA的分析来看，这4个菌株所代表的椰酵假单胞菌应该属于伯克霍尔德氏菌属，而且与B.gladioli、B.cocovenenans特别近缘。
, http://www.100md.com
从上述结果可以得出一个结论：根据16srRNA序列分析，我们所研究的椰酵假单胞菌与唐菖萍伯克霍尔德氏菌、椰毒伯克霍尔菌构成了伯克霍尔德氏菌属中的一个独立的发育系。3 16S rRNA基因序列的入库号
椰酵假单胞菌的4个菌株分析以下列入库号保存在核酸序列库(GenBank/EMBL/DDBG)k:HN2y AB 012916,Co14 AB 013111,Sx 8801 AB 023647,90-3 AB 023646。
* 国家自然科学基金资助项目(39570619)
作者简介：焦振泉，男，博士研究生
杨瑞馥 军事医学科学院微生物流行病研究所
参考文献
1.酵米面中毒病因协作组.酵米面中毒病因的研究—发现一种新的中毒菌：酵米面黄杆菌.中国医学科学院学报，1980，2(2)：77—85
, 百拇医药
2.刘秀梅.我国椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒流行趋势浅析.中华预防医学杂志，1996，30(6)：372—375
3.邱茂锋，刘秀梅，杨瑞馥，等.用rDNA指纹图分析我国部分椰酵假单胞菌的分子流行病学特征.卫生研究，1998，27(1)：57—60
4.Woese,CR.Bacterial evolution.Microbiol Rev.1987,51:221—227
5.王槐春主编.蛋白质与核酸序列分析基础.北京：人民军医出版社，1994
6.Higgins DG,Blessby AJ,et al. Clustal Ⅴ:improved software for multiple sequence alignment.Comput Appl Biosci,1992,8:1889—191
, 百拇医药
7.Saitou N,Nei M.The neighbor-joining method:a new method for reconstruction phylogenetic trees.Mol Biol Evol,1987,4:406—425
8.Kimura M.A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions throuth comparative studies of nucleotide sequences.J Mol Evol,1980,16:111—120
1999-05-10收稿, 百拇医药
单位：中国预防医学科学院营养与食品卫生研究所，北京 100050
关键词：椰酵假单胞菌；16S rDNA序列；系统发育
椰毒假单胞菌酵米面亚种16S rDNA 序列测定与分析
摘要 本文对3种不同来源样品的4株椰酵假单胞菌的16S rDNA的序列进行了测定，以确定其系统发育位置及与其它菌种的遗传进化关系。实验中设计了7条引物，利用聚合酶链式反应(Polymase Chain Reaction,PCR)扩增4株细菌的16S rDNA，通过扩增产物的克隆测序或直接测序，获得了它们的16S rDNA序列，将测得的序列与伯克霍尔德氏菌属中其它菌种的16S rDNA序列进行了聚类分析，得到了系统发育进化树状图。树状图及不同菌种之间的同源性比值：椰酵假单胞菌(P.cocovenenans subsp.farinofermentans)与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)、椰毒伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cocovenenans)的亲缘关系非常近，与其它菌种的亲缘关系相对较远，椰酵假单胞菌、唐菖蒲伯克霍尔德氏菌和椰毒伯克霍尔德氏菌可归属于一个独立的系统发育系。
, http://www.100md.com
中图分类号 R155.31 TS 207.4 Q939.110.1
Squencing and analysis of 16S rDNA sequences for
P.cocovenenans subsp farinofermentans
Jiao Zhenquan,Liu Xiumei,Yang Ruifu,Meng Zhaohe
Institute of Nutrition and Food Hygiene,Chinese Academy of Preventive Medicine Beijing 100050,China
In order to fix the phylogenetic taxonomic position of P.cocovenenans subsp.farinofermentans and describe its relationships with other closed species,seven primers were designed to amplify and sequence the 16S rDNA of 4 strains of it by using a clonal sequencing or direct sequencing method.The 16S rDNA sequence of the 4 strains were aligned with the 16S rDNA sequences of other species in genus Burkholderia,and the polygenetic tree was produced by using a Clustal V and treeview software.The results showed that P.cocovenenans subsp.farinofermentans was in a high homology with Burkholderia gladioli and Burkholderia cocovenenans， and they formed an independent phylogenetic clustal of genus Burkholderia.
, http://www.100md.com
Key words: P.cocovenenans subsp.farinofermentans,16S rDNA sequcence,phylogeny
椰毒假单胞菌酵米面亚种(Pseudomonas cocovenenans subsp.farinofermentans,简称椰酵假单胞菌)是我国学者于1977年在东北酵米面中毒食物中发现的一种新的食物中毒菌(曾暂命名为酵米面黄杆菌[1])。米酵菌酸和毒黄素是该菌产生的两种主要毒素，其中前者是引起食物中毒和死亡的主要毒性代谢产物，肝、脑、肾等主要实质性脏器是该毒素作用的靶器官。椰毒假单胞菌酵米面亚种可污染鲜银耳、酵米面、醋凉粉、汤圆粉和马铃薯粉等多种食品而变质发生食物中毒[2]。
近10多年来，我们研究室在有关椰酵假单胞菌的菌体抗原结构，生化鉴定和检测方法及米酵菌酸结构的鉴定、产毒机制和消毒，去毒等方面进行了广泛和深入的研究。刘秀梅在美国ATCC(America Type Culture Collection)所做的研究结果显示：椰假单胞菌在生物学性状上与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌更为接近。邱茂锋等在利用rDNA指纹图对椰酵假单胞菌、椰毒伯克霍尔德氏菌和唐菖蒲伯克霍尔德氏菌进行对比研究时发现：唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的图谱谱形与椰酵假单胞菌的RT9型相同，而椰毒伯克霍尔德氏菌与椰酵假单胞菌在谱形上则存在差别，缺乏椰酵假单胞菌所共有的唯一杂交带，说明椰酵假单胞菌与唐菖蒲伯克霍尔德氏菌的亲缘关系更为接近[3]。
, http://www.100md.com
近几年来，细菌的分类学发展迅速，已经从单一的表型分类发展为系统分类、多相分类；即利用表型、遗传型和系统发育信息来区分细菌，进而阐述细菌的遗传进化关系。自从Woese根据16S rRNA序列将所有生命分成3个域后[4]，作为细菌分类的系统发育框架基础16S rRNA，以其作为“细菌化石”的高度保守特点而被越来越多的分类学家所重视，它使人们可以进一步了解细菌的生命进化关系。
本研究的目的就是分析来源于3种不同样品的椰酵假单胞菌的16S rDNA序列，以确定它与椰毒伯克霍尔德氏菌和唐菖蒲伯克霍尔德氏及与伯克霍尔德氏菌属中其它菌种的遗传进化关系。
1 材料和方法
1.1 实验菌株
本实验选用椰毒假单胞菌酵米面亚种(Pseudomonas cocovenenans subsp.farinofermentans)的4个样品中的分离株进行16S rDNA序列测定：HN2y (CCTCCAB9725)1989年于银耳中分离，Co14 于1977年酵米面中分离，Sx8801于1987年由醋凉粉中分离，90-3于1990年由酵米面中分离。
, 百拇医药
1.2 实验方法
1.2.1 DNA的制备
菌株总DNA的提取：菌株用LB培养基培养至对数生长期，以8000r/min离心收集菌体，用SDS溶液进行裂解，再用酚/氯仿/异戊醇抽提和RNA酶消化，最后用乙醇沉淀，溶于TE(10mmol/L Tris-HCl,pH7.6及1mmol/L EDTA,pH8.0)中。
1.2.2 16S rRNA引物的设计
根据16S rRNA高度保守的特点，从其保守区域寻找引物位点，利用Oligo 4.1软件设计引物，共合成7条引物。
正向引物：
Primer 1:5'-AGA GTT TGA TCA TGG CTC AG-3'(对应于大肠杆菌的第8—27bp)，Primer 2:5'-GTA GTC CAC GCT GTA AAC GAT G-3'(对应于大肠杆菌的第774—795bp)反向引物：
, 百拇医药
Primer 6:5'-CTA CGT TTA CAG CGT GGA CTA C-3'(对应于大肠杆菌的第795—774bp)
Primer 7:5'-TAC GGT TAC CTT GTT ACG AC-3'(对应于大肠杆菌的第1504—1485bp)
其它的3条引物序列分别为：
Primer 3:5’-CTA CGG GAG GCA GCA GTG GG-3'
Primer 4:5'-CAG CAG CCG CGG TAA T-3'
Primer 5:5'-AAA CTT AAA GGA ATT GAC GG-3'。
1.2.3 16S rRNA基因扩增及序列测定
, 百拇医药
以总的DNA为模板，用引物P1，P7经PCR反应扩增出总的16S rDNA，PCR反应条件为：预变性94℃ 3min；变性94℃ 1min，退火55℃ 1min，复性72℃ 1min；最后延伸72℃ 10min，反应35个循环。对于HN2y和Co14,以总的16S rDNA为模板，用引物P1，P6及P2，P7进行PCR扩增，扩增产物用PGEM-T载体进行钝端连接后转化大肠杆菌JM109，经蓝白斑筛选及质粒大小比较后，以T7和SP6为测序引物利用A373 DNA自动测序仪进行测序。对于Sx8801和90-3则用总的16S rDNA为测序模板，用P1，P3，P4，P2及P5为测序引物在A373 DNA自动测序仪直接进行测序。
1.2.4 16S rDNA序列分析
将伯克霍尔得氏菌属(Burkholderia)中其它菌种的16S rDNA序列以GenBank/EMBL/DDBJ核酸序列库中检索出来[5]，它们包括唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(B.gladioli)、椰毒伯克霍尔德尔菌(B.cocovenenan)、洋葱伯克霍尔德氏菌(B.cepacia)、须芒草伯克霍尔德氏菌(B.andropogonis)、石竹伯克霍尔德氏菌(B.cariophylli)、植物伯克霍尔德氏菌(B.plantarii)、范氏伯克霍尔德氏菌(B.vandii)、越南伯克霍尔德氏菌(B.vienamiensis)、范氏伯克霍尔德菌(B.vandii)、越南伯克霍尔德尔菌(B.vienamiensis)、吡咯菌素伯克霍尔德氏菌(B.pyrrocinia)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.mallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(B.pseudomallei)、泰国伯克霍尔德氏菌(B.thailandensis)、格氏伯克霍尔德氏菌(B.glathei)、吩嗪伯克霍尔德氏菌(B.phenazinium)荚壳伯克霍尔德菌(B.glumae)及B.graminis,将这些菌株的16S rDNA序列与测得的四株椰酵假单胞菌的16S rDNA序列利用Clustal Ⅴ软件进行排列[6]，选用1307bp(相当于大肠杆的145-1452bp位置)进行比较，选取大肠杆菌(Escherchia coli,E.coli)作为系统发育进化树的根部，用Neighbor-Joining方法构建系统发良进行树状图[7]，用Treeview 3.2软件绘制系统发育进化树。各菌株的16S rDNA基因序列的核酸序列库中的索取号分别是：
, 百拇医药
B.gladioli X67038,B.cocovenenan U96934,B.cepacia U96927,B.andropogoni X 67037,B.cariophylli X 67039,B.plantarii U96933,B.vandii U96932,B.vienamiensis U96928,B.pyrrocinia U96930,B.mallei,B.pseudomallei BPU91839,B.thailandensis BSU91838,B.glathei Y17052,B.phenaxinium U9636,B.glumae U96931,B.graminis U96940,E.coli J01859.
2 结果与讨论
2.1 序列测定
我们利用8条引物，应用PCR扩增产物克隆后测定及直接测序两种方法获得了椰酵假单胞菌HN2y,Co14,90-3和Sx8801四个菌株的16S rDNA序列，大小分别为1484bp,1499bp,1352bp和1369bp,序列见GenBank。
, http://www.100md.com
2.2 序列分析 将椰酵假单胞菌的4株菌的16S rDNA序列与伯克霍尔得氏菌属中其它菌种的16S rDNA序列利用Clustal V软件进行比较、聚类，用Treeview软件获得了系统发育进化树状图，如附图所示。不同菌种之间的同源性比值及核苷酸替代率Knuc见表2[8]。
附图 椰毒假单胞菌酵米面亚种的系统发展进化树
(1)0.01代表每个核苷酸位置存在1%的突变率
表2 伯克霍尔德氏菌属中不同菌种之间的同源性比值和Knuc值
Species
, 百拇医药
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1.E.coli
0.175
0.176
0.179
, http://www.100md.com
0.180
0.181
0.179
0.177
0.186
0.180
2.B.gladioli ATCC 10248
82.5
0.004
0.007
0.005
0.004
, 百拇医药
0.020
0.002
0.035
0.009
3.HN2y
82.4
99.6
0.012
0.009
0.008
0.025
0.006
0.039
, http://www.100md.com
0.014
4.Co14
82.1
99.3
98.8
0.010
0.009
0.026
0.007
0.039
0.015
5.90-3
82.0
, 百拇医药
99.5
99.1
99.0
0.001
0.025
0.006
0.039
0.014
6.Sx8801
81.9
99.6
99.2
99.1
, 百拇医药
99.9
0.024
0.005
0.038
0.013
7.B.cepacia ATCC 25416
82.1
98.0
97.5
97.4
97.5
97.6
, 百拇医药 0.018
0.038
0.015
8.B.cocovenenans ATCC 3366
82.3
99.8
99.4
99.3
99.4
99.5
98.2
0.035
, http://www.100md.com 0.009
9.B.glathei ATCC 2915
81.4
96.5
96.1
96.1
96.1
96.2
96.2
96.5
0.035
10.B.glumae
, 百拇医药 82.0
99.1
98.6
98.5
98.6
98.7
98.5
99.1
96.5
11.B.graminis
82.0
95.1
94.7
, 百拇医药
94.6
94.7
94.8
95.1
95.2
95.7
95.2
12.B.phenazinium LMG 2247
81.4
96.2
95.7
95.6
, http://www.100md.com 95.7
95.8
96.1
96.2
96.9
96.3
13.B.plantarii JCM 5492
82.0
99.3
98.8
98.8
98.9
98.9
, 百拇医药
97.9
99.3
96.6
99.2
14.B.pseudomallei ATCC 233
82.1
97.8
97.3
97.2
97.3
97.4
98.0
, http://www.100md.com 97.8
96.3
98.1
15.B.pyrrocinia ATCC 15958
81.9
98.5
98.1
98.0
98.1
98.2
99.2
98.5
96.6
, 百拇医药
98.8
16.B.thailandensis E 264
82.0
97.8
97.4
97.3
97.4
97.5
98.3
97.8
96.3
98.2
, http://www.100md.com 17.B.vandii JCM 7957
81.9
99.2
98.7
98.6
98.7
98.8
98.1
99.2
96.6
99.5
18.B.vietnamiensis LMG 1092
, 百拇医药
82.1
98.2
97.8
97.7
97.8
97.9
99.5
98.2
96.2
98.7
19.B.andropogonis ATCC 230
83.0
, 百拇医药 97.0
96.6
96.5
96.5
96.6
95.8
96.9
95.9
96.8
20.B.caryophylli ATCC 25418
81.8
96.3
95.9
, 百拇医药
95.7
95.8
95.9
96.7
96.4
95.5
96.5
Species
11
12
13
14
15
, 百拇医药
16
17
18
19
20
1.E.coli
0.180
0.186
0.180
0.179
0.181
0.180
0.181
, 百拇医药
0.179
0.170
0.182
2.B.gladioli ATCC 10248
0.049
0.038
0.007
0.022
0.015
0.022
0.008
0.018
, 百拇医药
0.030
0.037
3.HN2y
0.053
0.043
0.012
0.027
0.019
0.026
0.013
0.022
0.034
0.041
, 百拇医药
4.Co14
0.054
0.044
0.012
0.028
0.020
0.027
0.014
0.023
0.035
0.043
5.90-3
0.053
, http://www.100md.com
0.043
0.012
0.027
0.019
0.026
0.013
0.022
0.035
0.042
6.Sx8801
0.052
0.042
0.011
, 百拇医药
0.026
0.018
0.025
0.012
0.021
0.034
0.041
7.B.cepacia ATCC 25416
0.049
0.039
0.021
0.020
, http://www.100md.com
0.008
0.017
0.019
0.005
0.042
0.033
8.B.cocovenenans ATCC 3366
0.048
0.038
0.007
0.022
0.015
, http://www.100md.com
0.022
0.008
0.018
0.031
0.036
9.B.glathei ATCC 2915
0.043
0.031
0.034
0.037
0.034
0.037
, http://www.100md.com
0.034
0.038
0.041
0.045
10.B.glumae
0.048
0.037
0.008
0.019
0.012
0.018
0.005
0.013
, http://www.100md.com
0.032
0.035
11.B.graminis
0.028
0.450
0.042
0.046
0.042
0.048
0.052
0.056
0.045
, http://www.100md.com 12.B.phenazinium LMG 2247
97.2
0.370
0.039
0.035
0.038
0.038
0.041
0.048
0.038
13.B.plantarii JCM 5492
95.5
, 百拇医药
96.3
0.020
0.015
0.022
0.005
0.017
0.030
0.036
14.B.pseudomallei ATCC 233
95.8
96.1
98.0
, 百拇医药
0.020
0.010
0.021
0.018
0.040
0.029
15.B.pyrrocna ATCC 15958
95.4
96.5
98.5
98.0
0.018
, 百拇医药
0.015
0.011
0.037
0.033
16.B.thailandensis E 264
95.8
96.2
97.8
99.0
98.2
0.021
0.018
, 百拇医药
0.041
0.029
17.B.vandill JCM 7957
95.2
96.2
99.5
97.9
98.5
97.9
0.017
0.031
0.038
, http://www.100md.com 18.B.vietnamiensis LMG 1092
94.8
95.9
98.3
98.2
98.9
98.2
98.3
0.038
0.035
19.B.andropogonis ATCC 230
94.4
, 百拇医药
95.2
97.0
96.0
96.3
95.9
96.9
96.2
0.049
20.B.caryophylli ATCC 25418
95.5
96.2
96.4
, http://www.100md.com 97.1
96.7
97.1
96.2
96.5
95.1
从附图中我们可以看出：伯克霍尔德氏菌属主要由7个分支组成，其中B.pseudomallei、B.mallei 与 B.thailandensis近缘，三者构成了第1个分支；B.cepacia 包含在第2个分支中，在这个分支中还有B.vietnamiensis与B.pyrrocinia,其中B.cepacia与B.vietnamiensis近缘；第3个分支由B.vandill、B.plantarii 与B.glumae 3个菌种组成；B.andropogonis与B.caryophylli分别占据第4，第5个分支；B.phenazinium、B.graminis与B.glathei构成了伯克霍尔德氏菌属的第6个分支；我们所要研究的椰酵假单细菌的4个菌株与B.gladioli、B.cocovenenans组成了第7个分支，它们在遗传距离非常接近，与第3个分支遗传关系非常近；所以从16S rDNA序列上来看，椰酵假单胞菌与B.gladioli、B.cocovenenans非常近缘。
, 百拇医药
任何一种细菌在它的进化过程中都与周围的其它细菌存在着各种各样的关系，在遗传距离上或远或近，从表2中可以看出：伯克霍德尔菌属中各个菌种与大肠杆菌的同源性比较低(81.4%～83.0%)，而它们之间的同源性非常高(94.4%～99.9%)，其中B.gladioli与B.cocovenenans 也具有很高的同源性(99.8%)，二者之间只有7个碱基不同，而且还包括在B.gladioli序列中存在3个“N”，B.cocovenenans序列中存在1个“N”，实际上只有2个碱基的不同，也就是说这2个菌种在16S rDNA序列上不可以区分。B.vandii与B.plantarii、B.glumae 的同源性比值均是99.5%，B.pseudomallei与B.mallei、B.thailandensis的同源性比值分别为99.8%和99.0%，它们在遗传进化关系上均比较近缘，椰酵假单胞菌的4个菌株与B.gladioli、B.cocovenenans的同源性比值分别为99.3%～99.6%和99.3%～99.5%，这说明从16S rRNA的分析来看，这4个菌株所代表的椰酵假单胞菌应该属于伯克霍尔德氏菌属，而且与B.gladioli、B.cocovenenans特别近缘。
, http://www.100md.com
从上述结果可以得出一个结论：根据16srRNA序列分析，我们所研究的椰酵假单胞菌与唐菖萍伯克霍尔德氏菌、椰毒伯克霍尔菌构成了伯克霍尔德氏菌属中的一个独立的发育系。3 16S rRNA基因序列的入库号
椰酵假单胞菌的4个菌株分析以下列入库号保存在核酸序列库(GenBank/EMBL/DDBG)k:HN2y AB 012916,Co14 AB 013111,Sx 8801 AB 023647,90-3 AB 023646。
* 国家自然科学基金资助项目(39570619)
作者简介：焦振泉，男，博士研究生
杨瑞馥 军事医学科学院微生物流行病研究所
参考文献
1.酵米面中毒病因协作组.酵米面中毒病因的研究—发现一种新的中毒菌：酵米面黄杆菌.中国医学科学院学报，1980，2(2)：77—85
, 百拇医药
2.刘秀梅.我国椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒流行趋势浅析.中华预防医学杂志，1996，30(6)：372—375
3.邱茂锋，刘秀梅，杨瑞馥，等.用rDNA指纹图分析我国部分椰酵假单胞菌的分子流行病学特征.卫生研究，1998，27(1)：57—60
4.Woese,CR.Bacterial evolution.Microbiol Rev.1987,51:221—227
5.王槐春主编.蛋白质与核酸序列分析基础.北京：人民军医出版社，1994
6.Higgins DG,Blessby AJ,et al. Clustal Ⅴ:improved software for multiple sequence alignment.Comput Appl Biosci,1992,8:1889—191
, 百拇医药
7.Saitou N,Nei M.The neighbor-joining method:a new method for reconstruction phylogenetic trees.Mol Biol Evol,1987,4:406—425
8.Kimura M.A simple method for estimating evolutionary rates of base substitutions throuth comparative studies of nucleotide sequences.J Mol Evol,1980,16:111—120
1999-05-10收稿, 百拇医药