氟中毒对小鼠学习记忆相关脑区突触结构的影响
作者：章子贵 许晓璐 申秀英 徐晓虹
单位：浙江师范大学生物系生理教研究，金华市321004
关键词：氟中毒；学习记忆；海马；电镜；突触结构
氟中毒对小鼠学习记忆相关脑区突触 结构的影响摘要 用Y-迷宫反应观察长期饮用不同浓度的氟化钠溶液对小鼠学习记忆行为的影响，然后用电镜和计算机图像分析仪观测小鼠脑内海马CA3区Gray Ⅰ突触结构的损伤效应。结果表明：饮用高浓度氟化钠溶液能显著降低小鼠的学习能力，并能引起小鼠海马CA3区突触后致密物质厚度极显著减小，和引起突触间隙宽度极显著变大等超微结构的变化。结果提示，慢性氟中毒对小鼠的学习能力的显著影响可能与其脑内突触界面结构的病理变化有关。
中图分类号 R599 Q593.2 R338.26 R995
, http://www.100md.com
Effect of fluoride exposure on synaptic structure of brain
areas related to learning-memory in mice
Zhang Zigui， Xu Xiaolu，Shen Xiuying，Xu Xiaohong
Department of Biology,Zhejiang Normal University,Jinhua 321004,China
The learning-memory behavior was tested in mice on a Y-maze after drinking different concentration of sodium fluoride. The impairment on the structure of Gray Ⅰ synaptic interface in the CA3 area of mice hippocampus were quantitatively analyzed by electron microscopy and computer image processing appliance. The main results are as follows:the learning ability of mice drinking high concentration of fluoride presented remarkable deterioration,the thickness of post-synaptic density (PSD) was decreased, and the width of synaptic cleft was remarkably increased. The results suggested that the impairment on the learning capability induced by fluorosis may be closely related with the pathological changes of synaptic structure in the brain of mice.
, 百拇医药
Key words: fluoride,ultrastructure,learning-memory capability,hippocampus,synaptic structure
氟虽是人体必需微量元素之一，但摄入量过多易导致氟斑牙及氟骨症，长期摄入高氟甚至对神经系统产生一定的影响和危害[1，2]。全国饮水卫生标准规定含氟量不超过1.0mg/L[3]，而金华地区氟污染较为严重，该地区污染点水质中的氟含量竟高达5mg/L，已形成较为严重的区域性氟污染[4]。为研究该地区氟污染是否已影响人体脑功能和脑组织结构，鉴于海马是学习记忆的重要脑区，突触是神经信息传递的关键部位，给予小鼠长期口服1～10mg/L浓度梯度的氟化钠溶液，来观察慢性氟中毒对小鼠学习记忆行为的影响。通过观察小鼠学习记忆相关脑区海马CA3区突触界面结构病理变化，为阐明氟中毒的机理和该地区氟中毒的防治提供基础资料。
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1 材料与方法1.1 实验动物及分组
实验选用金华市药物检定所实验动物饲养中心提供的1月龄ICR品系小白鼠28只，随机分成4组：对照组(n=8)、低氟组(n=7)、中氟组(n=7)、和高氟组(n=6)，分别饮用蒸馏水、1mg/L、5mg/L和10mg/L的氟化钠溶液，自由摄取饮水，共饲养10周。
1.2 分辨学习记忆能力的检测
实验以三等分辐射式迷宫(即Y-迷宫)作为分辨学习记忆(Discrimination learning memory)能力的检测模型[5]。反应箱每一支臂顶端有信号灯。实验时，灯光信号表示安全区，不通电；另两支臂通电，训练小鼠学会分辨条件信号而主动逃避电击。灯光出现的方位按照随机次序变换。凡通电时小鼠主动跑向有灯光信号的支臂逃避电击为正确反应，否则就视为错误反应。实验采用分段训练法，即每训练10次后让小鼠休息1分钟，以连续10次训练中有9次(90%)正确反应即定为学会标准。记录每个小鼠在Y-迷宫中达到学会标准所需训练次数，训练次数越少说明小鼠学习能力越强或学习速度越快，比较各组学习能力的差异。在Y-迷宫中动物的分辨学习能力达到学会标准24小时后再检测其记忆力，连续检测10次，记录这10次反应中正确反应尚保持多少次，以保持记忆的百分数来表示。
, 百拇医药
1.3 脑区取材和突触界面结构参数的测量
行为检测结束后，选择对学习记忆行为有显著影响的小鼠(高氟组)以及对照组，各2只，迅速处死，取脑块固定于5%的戊二醛中，在4℃左右的冰箱中放置24小时，待脑块稍变硬后，参照边缘系统解剖图取海马CA3区[6]。按常规方法制备超薄切片，用JEM-1200EX型电镜观察和拍摄Gray Ⅰ型突触照片(见图1)，再按照罗兰等人的方法[7]，用CIA-Ⅰ型计算机图像分析仪对突触界面结构，即突触活性带长度、突触界面曲率、突触后致密物质(post-synaptic density,PSD)厚度和突触间隙宽度进行定量分析。
图1 Gray I 型结构示意图
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1.突触囊泡 2.突触前致密突起 3.突触间隙
4.突触后致密物质 5.线粒体
1.4 统计方法
本实验的观察和测量采用双盲法进行，所得数据用平均值表示，小鼠学习记忆行为检测数据和海马CA3区突触界面结构的观测所得数据分别用新复极差测验法(SSR)和t检验法进行统计处理。
2 实验结果
2.1 分辨学习记忆能力的检测结果
表1表明，随着氟浓度的增大，小鼠达到学会标准所需训练次数逐渐增多，高氟组小鼠训练次数比对照组多将近一倍(P<0.05)，说明氟中毒能显著降低小鼠的分辨学习能力。
从表1看来，各组的记忆保持率几乎无差异。
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表1 氟中毒对小鼠学习记忆能力的影响(x±s)
组别
饮水氟浓度(mg/L)
n
达到学会标准所需训练次数
24小时后记忆
保持率(%)
对照组
0
7
43.1± 7.6
71.3±7.2
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低氟组
1
7
61.1±10.2
70.0±4.9
中氟组
5
6
63.2±13.4
70.0±8.6
高氟组
10
6
, 百拇医药
77.9±10.3(1)
70.0±5.8
注：(1)与对照组相比P<0.052.2 氟中毒对小鼠海马CA3区突触界面结构的影响
对照组和高氟组小鼠海马CA3区Gray Ⅰ型 突触电镜照片见图2～5。图2和图3表明两组海马CA3区突触前膜内侧都有园形囊泡，突触后膜有明显加厚的突触致密物质(PSD)，突触间隙清晰可见，符合Gray Ⅰ型突触(即兴奋形突触)的结构特征。图4中对照组海马CA3区突触前膜内侧线粒体片状嵴清晰可见，而图5中高氟组突触前膜内侧线粒体片状嵴结构模糊。
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图2 对照组小鼠海马CA3区突触界面结构(×50，000)
氟中毒对小鼠海马CA3区突触界面结构的损伤效应的观测统计结果列入表2可知长期高氟摄入使小鼠海马CA3区PSD厚度极显著变小(P<0.01)，突触间隙宽度极显著变大(P<0.01)。
表2 小鼠海马CA3区突触界面结构(x±s)
组 别
n
突触活性带
长度(nm)
突触界面
曲率
, 百拇医药
突触间隙
宽度(nm)
PSD厚度
(nm)
对照组
49
315.84± 94.77
1.19±0.18
15.68 ± 1.70
55.57±12.61
高氟组
41
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278.27±102.43
1.17±0.19
17.16 ± 2.45(1)
39.56±0.97(1)
注：(1)与对照组比P<0.01
图3 高氟组小鼠海马CA3区突触界面结构(50，000)
(示较薄的PSD和较宽的突触间隙)
, 百拇医药
图4 对照组小鼠海马CA3区突触前线粒体结构(×50，000)
(示线粒体片状嵴清晰可见)
图5 高氟组小鼠海马CA3区突触前线粒体结构(×50，000)
(示线粒体片状嵴结构模糊)
3 讨论
本文观测结果表明，长期高氟摄入确能对动物的神经系统高级行为—学习能力造成一定程度的损伤，而对小鼠的记忆能力却无显著影响，这可能与染毒时间过短有关，也和有关学习和记忆在脑内可能有不同的神经机制的报道[8]相一致。
, 百拇医药
海马作为学习记忆的相关脑区，其突触界面结构的可塑性变化与学习记忆行为的相关性近年来已引起研究者们的关注，我们以前的研究已经表明，突触界面结构是敏感易变的指标，易受年龄、药物等影响而发生可塑性变化[9，10]，并且这种变化与宏观上学习记忆的变化相一致。本研究结果表明，氟中毒可引起小鼠分辨学习能力的显著损伤，并能引起海马区突触界面一些结构的明显病理性改变。提示慢性氟中毒对小鼠学习能力的显著影响可能与其脑内突触结构的病理性变化有关。已有文献表明，氟能透过血脑屏障，过量氟在脑内蓄积，可造成神经细胞某些受体或递质合成减少，导致神经细胞发育障碍或损伤[11]，突触后膜致密物质(PSD)内含有多种蛋白质，包括受体蛋白等。因此，氟中毒引起脑内神经细胞某些受体或递质合成减少，从而引起突触界面结构的病理性变化(如突触间隙变宽、PSD厚度变小和线粒体嵴结构崎变等)，而这些突触界面结构的变化必然会影响神经信息的传递，最终影响小鼠的学习记忆行为。
* 浙江省大型测试基金(No.98004)和省教委基金资助项目(No.961097)
, 百拇医药
作者简介：章子贵，男，硕士，讲师
参考文献
1.官志忠，于燕妮，刘家骝.慢性氟中毒大鼠所生仔鼠大脑形态学改变的研究.中华病理学杂志，1986，15(4)：297—299
2.官志忠，于燕妮，刘家骝.慢性氟中毒对大鼠DNA和RNA含量的影响.贵阳医学院学报，1985，10(4)：250—253
3.孙玉富，腾国兴，赵新华.地方性氟中毒病区划分指标与标准的研究进展.中国地方病学杂志，1996，15(3)：169—170
4.申秀英，许晓路，章子贵.金华地区氟污染成因危害及对策(Ⅱ).农业环境保护，1998，17(2)：65—70
5.陈蓉，萧信生，王新光.Org-2766对小鼠学习记忆的影响及其与脑内蛋白质合成的关系.心理学报，1990：3：306—311
, 百拇医药
6.陈宜张.大鼠边缘系统的解剖.上海：第二军医大学出版社，1979：50—58
7.罗兰，陆汉新，吴馥梅等.脱甘氨酰胺精氨酸加压素引起脑内突触可塑性变化的定量观察.解剖学报，1991，22：93—97
8.吴馥梅，萧信生.神经肽与学习记忆.见姚志彬等.脑研究前沿.广州：广东科技出版社，1995，268—290
9.章子贵，徐晓虹，吴馥梅.衰老过程中小鼠学习记忆与脑内突触结构参数变化的相关性.神经解剖学杂志，1998：14(2)：147—151
10.章子贵，徐晓虹，吴馥梅.东莨菪碱所致记忆障碍的脑内突触机制.心理学报，1998，30(3)：332—336
11.于燕妮，杨文秀.地方性氟病区胎儿大脑神经递质与受体的变化.中国地方病学杂志.1996，15(5)：257—259
1998-12-24收稿, 百拇医药
单位：浙江师范大学生物系生理教研究，金华市321004
关键词：氟中毒；学习记忆；海马；电镜；突触结构
氟中毒对小鼠学习记忆相关脑区突触 结构的影响摘要 用Y-迷宫反应观察长期饮用不同浓度的氟化钠溶液对小鼠学习记忆行为的影响，然后用电镜和计算机图像分析仪观测小鼠脑内海马CA3区Gray Ⅰ突触结构的损伤效应。结果表明：饮用高浓度氟化钠溶液能显著降低小鼠的学习能力，并能引起小鼠海马CA3区突触后致密物质厚度极显著减小，和引起突触间隙宽度极显著变大等超微结构的变化。结果提示，慢性氟中毒对小鼠的学习能力的显著影响可能与其脑内突触界面结构的病理变化有关。
中图分类号 R599 Q593.2 R338.26 R995
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Effect of fluoride exposure on synaptic structure of brain
areas related to learning-memory in mice
Zhang Zigui， Xu Xiaolu，Shen Xiuying，Xu Xiaohong
Department of Biology,Zhejiang Normal University,Jinhua 321004,China
The learning-memory behavior was tested in mice on a Y-maze after drinking different concentration of sodium fluoride. The impairment on the structure of Gray Ⅰ synaptic interface in the CA3 area of mice hippocampus were quantitatively analyzed by electron microscopy and computer image processing appliance. The main results are as follows:the learning ability of mice drinking high concentration of fluoride presented remarkable deterioration,the thickness of post-synaptic density (PSD) was decreased, and the width of synaptic cleft was remarkably increased. The results suggested that the impairment on the learning capability induced by fluorosis may be closely related with the pathological changes of synaptic structure in the brain of mice.
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Key words: fluoride,ultrastructure,learning-memory capability,hippocampus,synaptic structure
氟虽是人体必需微量元素之一，但摄入量过多易导致氟斑牙及氟骨症，长期摄入高氟甚至对神经系统产生一定的影响和危害[1，2]。全国饮水卫生标准规定含氟量不超过1.0mg/L[3]，而金华地区氟污染较为严重，该地区污染点水质中的氟含量竟高达5mg/L，已形成较为严重的区域性氟污染[4]。为研究该地区氟污染是否已影响人体脑功能和脑组织结构，鉴于海马是学习记忆的重要脑区，突触是神经信息传递的关键部位，给予小鼠长期口服1～10mg/L浓度梯度的氟化钠溶液，来观察慢性氟中毒对小鼠学习记忆行为的影响。通过观察小鼠学习记忆相关脑区海马CA3区突触界面结构病理变化，为阐明氟中毒的机理和该地区氟中毒的防治提供基础资料。
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1 材料与方法1.1 实验动物及分组
实验选用金华市药物检定所实验动物饲养中心提供的1月龄ICR品系小白鼠28只，随机分成4组：对照组(n=8)、低氟组(n=7)、中氟组(n=7)、和高氟组(n=6)，分别饮用蒸馏水、1mg/L、5mg/L和10mg/L的氟化钠溶液，自由摄取饮水，共饲养10周。
1.2 分辨学习记忆能力的检测
实验以三等分辐射式迷宫(即Y-迷宫)作为分辨学习记忆(Discrimination learning memory)能力的检测模型[5]。反应箱每一支臂顶端有信号灯。实验时，灯光信号表示安全区，不通电；另两支臂通电，训练小鼠学会分辨条件信号而主动逃避电击。灯光出现的方位按照随机次序变换。凡通电时小鼠主动跑向有灯光信号的支臂逃避电击为正确反应，否则就视为错误反应。实验采用分段训练法，即每训练10次后让小鼠休息1分钟，以连续10次训练中有9次(90%)正确反应即定为学会标准。记录每个小鼠在Y-迷宫中达到学会标准所需训练次数，训练次数越少说明小鼠学习能力越强或学习速度越快，比较各组学习能力的差异。在Y-迷宫中动物的分辨学习能力达到学会标准24小时后再检测其记忆力，连续检测10次，记录这10次反应中正确反应尚保持多少次，以保持记忆的百分数来表示。
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1.3 脑区取材和突触界面结构参数的测量
行为检测结束后，选择对学习记忆行为有显著影响的小鼠(高氟组)以及对照组，各2只，迅速处死，取脑块固定于5%的戊二醛中，在4℃左右的冰箱中放置24小时，待脑块稍变硬后，参照边缘系统解剖图取海马CA3区[6]。按常规方法制备超薄切片，用JEM-1200EX型电镜观察和拍摄Gray Ⅰ型突触照片(见图1)，再按照罗兰等人的方法[7]，用CIA-Ⅰ型计算机图像分析仪对突触界面结构，即突触活性带长度、突触界面曲率、突触后致密物质(post-synaptic density,PSD)厚度和突触间隙宽度进行定量分析。
图1 Gray I 型结构示意图
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1.突触囊泡 2.突触前致密突起 3.突触间隙
4.突触后致密物质 5.线粒体
1.4 统计方法
本实验的观察和测量采用双盲法进行，所得数据用平均值表示，小鼠学习记忆行为检测数据和海马CA3区突触界面结构的观测所得数据分别用新复极差测验法(SSR)和t检验法进行统计处理。
2 实验结果
2.1 分辨学习记忆能力的检测结果
表1表明，随着氟浓度的增大，小鼠达到学会标准所需训练次数逐渐增多，高氟组小鼠训练次数比对照组多将近一倍(P<0.05)，说明氟中毒能显著降低小鼠的分辨学习能力。
从表1看来，各组的记忆保持率几乎无差异。
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表1 氟中毒对小鼠学习记忆能力的影响(x±s)
组别
饮水氟浓度(mg/L)
n
达到学会标准所需训练次数
24小时后记忆
保持率(%)
对照组
0
7
43.1± 7.6
71.3±7.2
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低氟组
1
7
61.1±10.2
70.0±4.9
中氟组
5
6
63.2±13.4
70.0±8.6
高氟组
10
6
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77.9±10.3(1)
70.0±5.8
注：(1)与对照组相比P<0.052.2 氟中毒对小鼠海马CA3区突触界面结构的影响
对照组和高氟组小鼠海马CA3区Gray Ⅰ型 突触电镜照片见图2～5。图2和图3表明两组海马CA3区突触前膜内侧都有园形囊泡，突触后膜有明显加厚的突触致密物质(PSD)，突触间隙清晰可见，符合Gray Ⅰ型突触(即兴奋形突触)的结构特征。图4中对照组海马CA3区突触前膜内侧线粒体片状嵴清晰可见，而图5中高氟组突触前膜内侧线粒体片状嵴结构模糊。
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图2 对照组小鼠海马CA3区突触界面结构(×50，000)
氟中毒对小鼠海马CA3区突触界面结构的损伤效应的观测统计结果列入表2可知长期高氟摄入使小鼠海马CA3区PSD厚度极显著变小(P<0.01)，突触间隙宽度极显著变大(P<0.01)。
表2 小鼠海马CA3区突触界面结构(x±s)
组 别
n
突触活性带
长度(nm)
突触界面
曲率
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突触间隙
宽度(nm)
PSD厚度
(nm)
对照组
49
315.84± 94.77
1.19±0.18
15.68 ± 1.70
55.57±12.61
高氟组
41
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278.27±102.43
1.17±0.19
17.16 ± 2.45(1)
39.56±0.97(1)
注：(1)与对照组比P<0.01
图3 高氟组小鼠海马CA3区突触界面结构(50，000)
(示较薄的PSD和较宽的突触间隙)
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图4 对照组小鼠海马CA3区突触前线粒体结构(×50，000)
(示线粒体片状嵴清晰可见)
图5 高氟组小鼠海马CA3区突触前线粒体结构(×50，000)
(示线粒体片状嵴结构模糊)
3 讨论
本文观测结果表明，长期高氟摄入确能对动物的神经系统高级行为—学习能力造成一定程度的损伤，而对小鼠的记忆能力却无显著影响，这可能与染毒时间过短有关，也和有关学习和记忆在脑内可能有不同的神经机制的报道[8]相一致。
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海马作为学习记忆的相关脑区，其突触界面结构的可塑性变化与学习记忆行为的相关性近年来已引起研究者们的关注，我们以前的研究已经表明，突触界面结构是敏感易变的指标，易受年龄、药物等影响而发生可塑性变化[9，10]，并且这种变化与宏观上学习记忆的变化相一致。本研究结果表明，氟中毒可引起小鼠分辨学习能力的显著损伤，并能引起海马区突触界面一些结构的明显病理性改变。提示慢性氟中毒对小鼠学习能力的显著影响可能与其脑内突触结构的病理性变化有关。已有文献表明，氟能透过血脑屏障，过量氟在脑内蓄积，可造成神经细胞某些受体或递质合成减少，导致神经细胞发育障碍或损伤[11]，突触后膜致密物质(PSD)内含有多种蛋白质，包括受体蛋白等。因此，氟中毒引起脑内神经细胞某些受体或递质合成减少，从而引起突触界面结构的病理性变化(如突触间隙变宽、PSD厚度变小和线粒体嵴结构崎变等)，而这些突触界面结构的变化必然会影响神经信息的传递，最终影响小鼠的学习记忆行为。
* 浙江省大型测试基金(No.98004)和省教委基金资助项目(No.961097)
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作者简介：章子贵，男，硕士，讲师
参考文献
1.官志忠，于燕妮，刘家骝.慢性氟中毒大鼠所生仔鼠大脑形态学改变的研究.中华病理学杂志，1986，15(4)：297—299
2.官志忠，于燕妮，刘家骝.慢性氟中毒对大鼠DNA和RNA含量的影响.贵阳医学院学报，1985，10(4)：250—253
3.孙玉富，腾国兴，赵新华.地方性氟中毒病区划分指标与标准的研究进展.中国地方病学杂志，1996，15(3)：169—170
4.申秀英，许晓路，章子贵.金华地区氟污染成因危害及对策(Ⅱ).农业环境保护，1998，17(2)：65—70
5.陈蓉，萧信生，王新光.Org-2766对小鼠学习记忆的影响及其与脑内蛋白质合成的关系.心理学报，1990：3：306—311
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6.陈宜张.大鼠边缘系统的解剖.上海：第二军医大学出版社，1979：50—58
7.罗兰，陆汉新，吴馥梅等.脱甘氨酰胺精氨酸加压素引起脑内突触可塑性变化的定量观察.解剖学报，1991，22：93—97
8.吴馥梅，萧信生.神经肽与学习记忆.见姚志彬等.脑研究前沿.广州：广东科技出版社，1995，268—290
9.章子贵，徐晓虹，吴馥梅.衰老过程中小鼠学习记忆与脑内突触结构参数变化的相关性.神经解剖学杂志，1998：14(2)：147—151
10.章子贵，徐晓虹，吴馥梅.东莨菪碱所致记忆障碍的脑内突触机制.心理学报，1998，30(3)：332—336
11.于燕妮，杨文秀.地方性氟病区胎儿大脑神经递质与受体的变化.中国地方病学杂志.1996，15(5)：257—259
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