乙醇及其代谢产物乙醛对胎鼠大脑星形胶质细胞增殖的影响
作者：屈卫东 吴德生 刘发才 翁贵武
单位：华西医科大学公共卫生学院，成都 610041
关键词：乙醇；乙醛；星形胶质细胞；细胞增殖
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摘要 为探讨孕期饮酒致胎儿神经系统发育异常和发育迟缓机制，本研究在体外利用3H-TdR参入胎鼠大脑星形胶质细胞以研究乙醇及其代谢产物乙醛对其增殖的影响。结果表明乙醇、乙醛均可明显抑制星形胶质细胞增殖，乙醛的抑制作用强度明显高于乙醇。结果表明，乙醇、乙醛对星形胶质细胞生长有明显抑制作用。酒精引起的神经系统发育异常很可能是乙醇及其代谢产物对星形胶质细胞增殖抑制所致。
中图分类号 Q593.4 TS262.2 R163
, http://www.100md.com
Effects of alcohol and metabolite acetaldehyde
on the proliferation of astroglial cells of fetal brain
Qu Weidong,Wu Desheng,et al.
School of Public Health,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041,China
To explore the mechanism of the retardation and abnormality of nerve system development induced by drinking alcohol during pregnancy, 3H-TdR incorporation was used to study the proliferation of astroglial cells of fetal brain induced by alcohol and its metabolite acetaldehyde in vitro.The results showed that alcohol and acetaldehyde obviously restrain the proliferation of astrocytes. The effect of restrain induced by acetaldehyde is stronger than that by alcohol. Nerve system development retardation and abnormality resulted from alcohol is likely to be the restrain of proliferation induced by alcohol and its metabolite acetaldehyde.
, 百拇医药
Key words:alcohol,acetaldehyde,astrocytes,cell proliferation
对胎儿酒精综合征(fetal alcohol syndrome,FAS)的研究发现孕期饮酒能够改变胎儿大脑皮层的形态结构和髓鞘结构，还可导致大脑皮层神经元和浦肯野细胞数量急剧下降和坏死[1]。由于胚胎发育期神经胶质细胞大量增殖以满足大脑及中枢神经系统结构形成和功能完善，有学者提出孕期饮酒引起的脑和中枢神经系统发育异常可能是乙醇损伤了星形胶质细胞促进神经元分化成熟和定向迁移所致[2]。
本研究利用星形胶质细胞体外培养技术，采用3H-TdR参入法研究乙醇、乙醛对星形胶质细胞增殖过程的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 实验试剂与仪器
乙醇(色谱纯)、乙醛(分析纯)，上海化学试剂厂，DMEM-F12培养基(Boehringer mannheim公司)，Hank's液、D-Han'ks液、闪烁液，3H-TdR(中国原子能研究所)。超净工作台，CO2培养箱，烘箱，液体闪烁仪，96孔细胞培养板，玻璃纤维滤纸，多头细胞收集器。
1.1.2 实验培养基
DMEM-F12培养基，内含0.1%谷氨酰胺，0.6%葡萄糖，含青、链霉素双抗各100U/ml，用前加入20%胎牛血清。
1.1.3 实验分组
对照组除DMEM-F12完全培养液外不含任何受试物。实验组乙醇的终浓度为：2.5，5，10，20，40mmol/L 5个剂量组；乙醛终浓度为0.5，2.0，8.0，16.0，32.0mmol/L 5个剂量组。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 星形胶质细胞分离培养
孕19天大鼠颈椎脱臼处死，无菌剖腹分离胚胎，断胎头，移入DMEM-F12培养基；剥离胎鼠脑盖，分离脑膜及血管，Hank's液清洗；置内含10%胎牛血清和5%DMEM-F12培养基的Hank's液中再清洗；按Booher法略加修正进行分离培养[3]。
1.2.2 细胞处理
从CO2培养箱中取出分离培养的星形胶质细胞，弃上清液；用0.25%胰酶消化细胞至细胞呈圆球形。加2ml DMEM-F12完全培养液终止；1000r/min离心，弃上清液；加DMEM-F12培养液使培养细胞再悬浮；调整细胞密度至1×106个/ml,待用。
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1.2.3 3H-TdR标记及检测
96孔培养板每孔中加入100μl细胞悬液，再加入含不同浓度的受试物100μl。分别培养24,48,72和96h，于每组培养结束前12～16h加入3H-TdR(0.5μCi/ml)。实验结束时，用胰酶消化细胞至细胞成球形；以多头细胞收集器反复抽吸清洗，收集细胞至玻璃纤维滤纸上，于120℃烘箱中干燥4h，置5ml闪烁液中；液闪仪测定。
1.2.4 结果分析
用液闪仪计数5ml闪烁液中3H-TdR标记细胞的cpm值，分别绘制乙醇、乙醛对星形胶质细胞和少突胶质细胞增殖影响曲线。
1.2.5 统计处理
采用SAS软件，应用方差分析比较对照组与实验组的显著性差异水平。
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2 结果
2.1 乙醇对星形胶质细胞增殖的影响
图1增殖生长曲线显示，对照组星形胶质细胞从0～48h持续增殖生长，于48h达高峰，48h后生长显著下降，至96h达最低点。不同浓度乙醇组中多数组的生长曲线与对照组呈一致规律，唯40mmol/L组于48h后仍缓慢增殖生长，呈现平台现象，至72h达峰值，此后生长迅速下降。
图1 不同乙醇浓度对星形胶质细胞增殖的影响
2.2 乙醛对星形胶质细胞的影响
图2反映乙醛对星形胶质细胞增殖的影响，从0～48h，对照组星形胶质细胞持续增殖，48h达峰值，72h迅速降低，96h至最低点，除16mmol/L，32mmol/L外，其它各组细胞生长规律与对照组基本一致，均在48h到增殖顶峰。48～72h期间，16mmol/L有轻度增殖生长呈平台现象。32mmol/L组迅速增加达峰值，96h后降低至最低点。
, 百拇医药
图2 不同乙醛浓度对星形胶质细胞增殖的影响
3 讨论
本研究用3H-TdR参入法探讨了星形胶质细胞体外增殖过程。从图1可见对照组星形胶质细胞在最初24小时开始增殖至培养48小时细胞增殖达最高峰，表明该区间是细胞对数增殖期。在48～72小时细胞增殖能力急剧下降，一方面因细胞在前48小时的迅速增殖，占据了可增殖空间，导致接触抑制，细胞增殖能力下降；另一方面，培养液营养物质大量消耗影响细胞进一步增殖。96小时细胞增殖能力进一步下降表明细胞进入衰退期。
乙醇、乙醛均可影响星形胶质细胞增殖过程。尽管对照组及多数实验组表现出相似的动力学过程，即0～48h期间为对数增殖期，48～72h生长能力急剧下降，72～96小时为衰退期。然而在较高剂量乙醇、乙醛作用于两种细胞系时，48～72h未出现生长能力急剧下降，而出现平台期，个别组(乙醛40mmol/L)甚至出现明显增殖。显然，其原因并非高剂量乙醇、乙醛对培养细胞的生长抑制能力弱。因24和48小时所测cpm值与剂量呈显著负相关。因此，该现象发生的机制在于较高剂量乙醇和乙醛在对数增殖期明显抑制了细胞生长，故48h后培养环境中仍存在增殖空间，未发生接触抑制，且培养基内营养物质消耗相对缓慢，此期仍有一定营养成份以满足细胞增殖需要，因而出现与48小时相似增殖速度，表现出平台期，甚至更高。综上所述，高剂量组48小时后出现平台或显著增殖的现象的本质是抑制作用强的表现。
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根据48小时后出现平台或继续显著增殖的现象，实验中观察比较了乙醇和乙醛的毒作用强度。结果发现，乙醇作用于星形胶质细胞，其平台现象出现于最高剂量组(40mmol/L)，而乙醛的平台现象出现于次低剂量组(16mmol/L)，最高剂量组(32mmol/L)则出现继续增殖。因此，乙醛对星形胶质细胞的抑制作用强度明显高于乙醇。从而说明在体内乙醇代谢为乙醛时，毒性作用可能增强，其对脑发育的影响不容忽视。
本实验从体外实验这一侧面，进一步说明，乙醇在体内所致脑组织结构和功能改变很可能是乙醇及其代谢产物乙醛毒性效应抑制了星形胶质细胞增殖致使细胞大量死亡，从而影响神经细胞定向迁移过程，导致神经元分化成熟受到抑制[4]，致使与之相关的神经元功能异常，阻止轴突延伸和神经元回路形成，进而导致语言、学习记忆能力下降[5]。
由于乙醇及其代谢产物抑制了星形胶质细胞，可能导致脑发育障碍而产生严重后果。而星形胶质细胞功能与其相关功能蛋白的表达密切相关。因此进一步研究乙醇、乙醛对星形胶质细胞相关功能蛋白的表达，对阐明乙醇的神经毒作用机制极有意义。
, http://www.100md.com
四川省计生委资助(No.98007)；
作者简介：屈卫东，男，博士
刘发才 成都市龙泉区卫生防疫站
翁贵武 成都市双流县卫生防疫站
4 参考文献
1.Hannigan J H,Abel E L,Kruger M.L.Population characteristic of birth weight in an animal model of alcohol-related developmental effects. Neurotoxicol Teratol,1993,15:97—105
2.Jacobson M.Neuroglial ontogeny. In:Developmental Neurobiology. 3 Ed.New York:Pleum Press,1991 95—139
, 百拇医药
3.Booher J, Sensenbrenner M.Growth and cultivation of dissociated neurons and glial cells from embryonic chick,rat and human brain in flask cultures.Neurobiology(copenh),1972,2:97—105
4.Michael W M.Effect of prenatal exposture to alcohol on the distribution and time of origin of corticospinal neurons in the rat.Comp Neurol,1987,257:372—382
5.Streissguth A P,Sampson PD, Olson HC,et al.Maternal drinking during pregnancy:attention and short-term memory in 14-year-old off spring-A longitudinal prosepctive study.Alc Clin Exp Res,1994,18:202—218
1998-12-18收稿, 百拇医药
单位：华西医科大学公共卫生学院，成都 610041
关键词：乙醇；乙醛；星形胶质细胞；细胞增殖
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摘要 为探讨孕期饮酒致胎儿神经系统发育异常和发育迟缓机制，本研究在体外利用3H-TdR参入胎鼠大脑星形胶质细胞以研究乙醇及其代谢产物乙醛对其增殖的影响。结果表明乙醇、乙醛均可明显抑制星形胶质细胞增殖，乙醛的抑制作用强度明显高于乙醇。结果表明，乙醇、乙醛对星形胶质细胞生长有明显抑制作用。酒精引起的神经系统发育异常很可能是乙醇及其代谢产物对星形胶质细胞增殖抑制所致。
中图分类号 Q593.4 TS262.2 R163
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Effects of alcohol and metabolite acetaldehyde
on the proliferation of astroglial cells of fetal brain
Qu Weidong,Wu Desheng,et al.
School of Public Health,West China University of Medical Sciences,Chengdu 610041,China
To explore the mechanism of the retardation and abnormality of nerve system development induced by drinking alcohol during pregnancy, 3H-TdR incorporation was used to study the proliferation of astroglial cells of fetal brain induced by alcohol and its metabolite acetaldehyde in vitro.The results showed that alcohol and acetaldehyde obviously restrain the proliferation of astrocytes. The effect of restrain induced by acetaldehyde is stronger than that by alcohol. Nerve system development retardation and abnormality resulted from alcohol is likely to be the restrain of proliferation induced by alcohol and its metabolite acetaldehyde.
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Key words:alcohol,acetaldehyde,astrocytes,cell proliferation
对胎儿酒精综合征(fetal alcohol syndrome,FAS)的研究发现孕期饮酒能够改变胎儿大脑皮层的形态结构和髓鞘结构，还可导致大脑皮层神经元和浦肯野细胞数量急剧下降和坏死[1]。由于胚胎发育期神经胶质细胞大量增殖以满足大脑及中枢神经系统结构形成和功能完善，有学者提出孕期饮酒引起的脑和中枢神经系统发育异常可能是乙醇损伤了星形胶质细胞促进神经元分化成熟和定向迁移所致[2]。
本研究利用星形胶质细胞体外培养技术，采用3H-TdR参入法研究乙醇、乙醛对星形胶质细胞增殖过程的影响。
1 材料和方法
1.1 材料
, 百拇医药
1.1.1 实验试剂与仪器
乙醇(色谱纯)、乙醛(分析纯)，上海化学试剂厂，DMEM-F12培养基(Boehringer mannheim公司)，Hank's液、D-Han'ks液、闪烁液，3H-TdR(中国原子能研究所)。超净工作台，CO2培养箱，烘箱，液体闪烁仪，96孔细胞培养板，玻璃纤维滤纸，多头细胞收集器。
1.1.2 实验培养基
DMEM-F12培养基，内含0.1%谷氨酰胺，0.6%葡萄糖，含青、链霉素双抗各100U/ml，用前加入20%胎牛血清。
1.1.3 实验分组
对照组除DMEM-F12完全培养液外不含任何受试物。实验组乙醇的终浓度为：2.5，5，10，20，40mmol/L 5个剂量组；乙醛终浓度为0.5，2.0，8.0，16.0，32.0mmol/L 5个剂量组。
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1.2 方法
1.2.1 星形胶质细胞分离培养
孕19天大鼠颈椎脱臼处死，无菌剖腹分离胚胎，断胎头，移入DMEM-F12培养基；剥离胎鼠脑盖，分离脑膜及血管，Hank's液清洗；置内含10%胎牛血清和5%DMEM-F12培养基的Hank's液中再清洗；按Booher法略加修正进行分离培养[3]。
1.2.2 细胞处理
从CO2培养箱中取出分离培养的星形胶质细胞，弃上清液；用0.25%胰酶消化细胞至细胞呈圆球形。加2ml DMEM-F12完全培养液终止；1000r/min离心，弃上清液；加DMEM-F12培养液使培养细胞再悬浮；调整细胞密度至1×106个/ml,待用。
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1.2.3 3H-TdR标记及检测
96孔培养板每孔中加入100μl细胞悬液，再加入含不同浓度的受试物100μl。分别培养24,48,72和96h，于每组培养结束前12～16h加入3H-TdR(0.5μCi/ml)。实验结束时，用胰酶消化细胞至细胞成球形；以多头细胞收集器反复抽吸清洗，收集细胞至玻璃纤维滤纸上，于120℃烘箱中干燥4h，置5ml闪烁液中；液闪仪测定。
1.2.4 结果分析
用液闪仪计数5ml闪烁液中3H-TdR标记细胞的cpm值，分别绘制乙醇、乙醛对星形胶质细胞和少突胶质细胞增殖影响曲线。
1.2.5 统计处理
采用SAS软件，应用方差分析比较对照组与实验组的显著性差异水平。
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2 结果
2.1 乙醇对星形胶质细胞增殖的影响
图1增殖生长曲线显示，对照组星形胶质细胞从0～48h持续增殖生长，于48h达高峰，48h后生长显著下降，至96h达最低点。不同浓度乙醇组中多数组的生长曲线与对照组呈一致规律，唯40mmol/L组于48h后仍缓慢增殖生长，呈现平台现象，至72h达峰值，此后生长迅速下降。
图1 不同乙醇浓度对星形胶质细胞增殖的影响
2.2 乙醛对星形胶质细胞的影响
图2反映乙醛对星形胶质细胞增殖的影响，从0～48h，对照组星形胶质细胞持续增殖，48h达峰值，72h迅速降低，96h至最低点，除16mmol/L，32mmol/L外，其它各组细胞生长规律与对照组基本一致，均在48h到增殖顶峰。48～72h期间，16mmol/L有轻度增殖生长呈平台现象。32mmol/L组迅速增加达峰值，96h后降低至最低点。
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图2 不同乙醛浓度对星形胶质细胞增殖的影响
3 讨论
本研究用3H-TdR参入法探讨了星形胶质细胞体外增殖过程。从图1可见对照组星形胶质细胞在最初24小时开始增殖至培养48小时细胞增殖达最高峰，表明该区间是细胞对数增殖期。在48～72小时细胞增殖能力急剧下降，一方面因细胞在前48小时的迅速增殖，占据了可增殖空间，导致接触抑制，细胞增殖能力下降；另一方面，培养液营养物质大量消耗影响细胞进一步增殖。96小时细胞增殖能力进一步下降表明细胞进入衰退期。
乙醇、乙醛均可影响星形胶质细胞增殖过程。尽管对照组及多数实验组表现出相似的动力学过程，即0～48h期间为对数增殖期，48～72h生长能力急剧下降，72～96小时为衰退期。然而在较高剂量乙醇、乙醛作用于两种细胞系时，48～72h未出现生长能力急剧下降，而出现平台期，个别组(乙醛40mmol/L)甚至出现明显增殖。显然，其原因并非高剂量乙醇、乙醛对培养细胞的生长抑制能力弱。因24和48小时所测cpm值与剂量呈显著负相关。因此，该现象发生的机制在于较高剂量乙醇和乙醛在对数增殖期明显抑制了细胞生长，故48h后培养环境中仍存在增殖空间，未发生接触抑制，且培养基内营养物质消耗相对缓慢，此期仍有一定营养成份以满足细胞增殖需要，因而出现与48小时相似增殖速度，表现出平台期，甚至更高。综上所述，高剂量组48小时后出现平台或显著增殖的现象的本质是抑制作用强的表现。
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根据48小时后出现平台或继续显著增殖的现象，实验中观察比较了乙醇和乙醛的毒作用强度。结果发现，乙醇作用于星形胶质细胞，其平台现象出现于最高剂量组(40mmol/L)，而乙醛的平台现象出现于次低剂量组(16mmol/L)，最高剂量组(32mmol/L)则出现继续增殖。因此，乙醛对星形胶质细胞的抑制作用强度明显高于乙醇。从而说明在体内乙醇代谢为乙醛时，毒性作用可能增强，其对脑发育的影响不容忽视。
本实验从体外实验这一侧面，进一步说明，乙醇在体内所致脑组织结构和功能改变很可能是乙醇及其代谢产物乙醛毒性效应抑制了星形胶质细胞增殖致使细胞大量死亡，从而影响神经细胞定向迁移过程，导致神经元分化成熟受到抑制[4]，致使与之相关的神经元功能异常，阻止轴突延伸和神经元回路形成，进而导致语言、学习记忆能力下降[5]。
由于乙醇及其代谢产物抑制了星形胶质细胞，可能导致脑发育障碍而产生严重后果。而星形胶质细胞功能与其相关功能蛋白的表达密切相关。因此进一步研究乙醇、乙醛对星形胶质细胞相关功能蛋白的表达，对阐明乙醇的神经毒作用机制极有意义。
, http://www.100md.com
四川省计生委资助(No.98007)；
作者简介：屈卫东，男，博士
刘发才 成都市龙泉区卫生防疫站
翁贵武 成都市双流县卫生防疫站
4 参考文献
1.Hannigan J H,Abel E L,Kruger M.L.Population characteristic of birth weight in an animal model of alcohol-related developmental effects. Neurotoxicol Teratol,1993,15:97—105
2.Jacobson M.Neuroglial ontogeny. In:Developmental Neurobiology. 3 Ed.New York:Pleum Press,1991 95—139
, 百拇医药
3.Booher J, Sensenbrenner M.Growth and cultivation of dissociated neurons and glial cells from embryonic chick,rat and human brain in flask cultures.Neurobiology(copenh),1972,2:97—105
4.Michael W M.Effect of prenatal exposture to alcohol on the distribution and time of origin of corticospinal neurons in the rat.Comp Neurol,1987,257:372—382
5.Streissguth A P,Sampson PD, Olson HC,et al.Maternal drinking during pregnancy:attention and short-term memory in 14-year-old off spring-A longitudinal prosepctive study.Alc Clin Exp Res,1994,18:202—218
1998-12-18收稿, 百拇医药