甲基汞对大鼠脑突触体谷氨酸摄取的抑制作用*
作者：祝卫国 陈学敏
单位：同济医科大学环境卫生学教研室，武汉 430030
关键词：甲基汞；突触体；谷氨酸摄取
卫生研究\990402 摘要 应用高亲和性摄取试验研究了甲基汞在体外对大鼠脑突触体谷氨酸摄取的影响。结果表明，1×10-9～1×10-4mol/L甲基汞可使大鼠大脑皮层、海马、纹状体和小脑突触体3H-L-谷氨酸摄取量分别下降0.7%～74.4%、7.5%～91.1%、1.4%～76.6%和4.4%～77.0%，其中在1×10-6～1×10-4mol/L范围内均有显著性意义(P<0.05)，且均存在明显的剂量—效应关系，其抑制作用的IC50分别为7.9、3.6、2.2和4.3×10-6mol/L。本研究结果提示甲基汞可明显抑制大鼠脑突触体高亲和谷氨酸摄取功能。
, 百拇医药
中图分类号 R994.6 Q593.2 Q517
Inhibition of glutamate uptake in rat brain synaptosome by methylmercury
Zhu Weiguo Chen Xuemin
Department of Environmental Health,Tongji Medical University,Wuhan 430030, China
The effect of methylmercury on the glutamate uptake in rat brain synaptosomes were studied in vitro by using a high affinity uptake test.The result showed that methylmercury(1×10-9～1×10-4mol/L)could decrease 3H-L-glutamate uptake in rat cerebral cortex,hippocampus, striatum and cerebellum synaptosome by 0.7%～74.4%,7.5%～91.1%,1.4%～76.6% and 4.4%～77.0%,respectively,in a dose-dependent manner,and their IC50 were 7.9, 3.6, 2.2 and 4.3×10-6mol/L,respectively.It suggested that methylmercury could obviously inhibit glutamate uptake in the synaptosomes of rat brain.
, 百拇医药
Key words: methylmercury,synaptosome,glutamate uptake 甲基汞是一种具有神经毒性的环境污染物，它主要侵犯中枢神经系统，造成不可逆性脑损害。有研究表明，甲基汞的神经毒性与其抑制胶质细胞谷氨酸摄取，进而导致谷氨酸在突触间隙滞留过久，过度刺激突触后受体有关[1，2]。但胶质细胞膜上的谷氨酸摄取系统主要是防止谷氨酸弥散到其它神经元，避免其兴奋性作用的扩大，而神经末梢上的谷氨酸摄取系统在迅速终止谷氨酸递质作用、防止其过度刺激相应受体方面起主导作用[3]。因此，我们以神经末梢制备物脑突触体为实验材料，研究了甲基汞对谷氨酸高亲和性摄取功能的影响。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
氯化甲基汞(≥98%，Merck)，L-(2，3-3H)-谷氨酸(3H-L-Glu)(740GBq/mmol，NEN，DuPont)，PPO和POPOP闪烁体(Rath进口分装)，FJ-2107G型液体闪烁计数器(西安国营二六二厂)，LKB恒温水浴箱(LKB，瑞典)，TomyRS-20Ⅱ低温高速离心机(Seiko，日本)，Beckman低温超速离心机(Beckman，美国)，Potter玻璃-Telfon匀浆器(B.Braun，德国)
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1.2 脑突触体制备
选用健康成年雄性SD大鼠(220～240g，同济医科大学实验动物中心)，断头处死后迅速剥离全脑并分离出待测脑区，加入10倍体积冷的0.32mol/L蔗糖匀浆液，冰浴匀浆，先低温离心(1000g，10min，4℃)以去除胞核和较大碎片，上清液再离心(15000g，30min，4℃)，将得到的沉淀用少许匀浆液悬浮混匀，随后进行不连续密度梯度离心(0.8，1.0，1.2，1.4mol/L蔗糖梯度，65000g，2.5h，4℃)，收集1.0mol/L蔗糖界面附近的突触体并加入10倍体积Tris-HCl缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH 7.4，10mmol/L EDTA)，低温离心(35000g,10min,4℃)，沉淀物即为突触体。用Lowry法测定蛋白含量[4]，匀浆液稀释分装突触体，液氮速冻，-70℃保存备用。
1.3 突触体谷氨酸摄取实验
, 百拇医药
参照文献方法进行[5]，略作改动。谷氨酸摄取反应总体系500μl，含Krebs-碳酸氢盐缓冲液，含50μg突触体蛋白的一定量待测物。25℃水浴10min后，加入37kBq/mmol3H-L-Glu(lmmol/L)混匀，25℃水浴反应5min，加入冷的Krebs缓冲液终止反应，迅速经0.22μm硝酸纤维素膜抽滤，并用Krebs缓冲液冲洗反应管和滤膜3遍，将滤膜放入液闪瓶中、加入5ml甲苯闪烁液(含0.5%PPO，0.02%POPOP，10%甲醇和10%乙醇)及1ml乙二醇乙醚暗化过夜，在液闪计数器3H谱道测定样品的放射性强度。
1.4 统计方法
用SAS软件进行方差分析和直线相关分析。
2 结果
结果表明，1×10-9～1×10-4mol/L甲基汞可使各脑区突触体3H-L-Glu摄取能力有不同程度地降低，且都有明显的剂量-效应关系(r皮层=-0.958,r海马=-0.855，r纹状体=-0.982，r小脑=-0.955，均为P<0.05)。其中大脑皮层突触体3H-L-Glu摄取能力降低，在1×10-6～1×10-4mol/L范围内有显著性意义(P<0.05)其相应IC50=7.9×10-6mol/L；海马突触体3H-L-Glu摄取能力降低，在1×10-7～1×10-4mol/L范围内有显著性意义(P<0.05)，其中IC50=3.6×10-6mol/L；纹状体突触体3H-L-Glu摄取能力降低，在1×10-8～1×10-4mol/L范围内有显著性意义(p<0.05)，其IC50=2.2×10-6mol/L；小脑突触体3H-L-Glu摄取能力，在1×10-6～1×10-4mol/L范围内有显著性意义(P<0.05)，其IC50=4.3×10-6mmol/L(见附表)。
, 百拇医药
附表 甲基汞对不同脑区突触体3H-L-Glu摄取的影响
[n=5,x±s,nmol/(g.min)] 剂量
(mol/L)
大脑皮层
海马
纹状体
小脑
摄取量
抑制率(%)
摄取量
抑制率(%)
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摄取量
抑制率(%)
摄取量
抑制率(%)
0
2.40±0.27
/
2.27±0.21
/
3.59±0.23
/
1.31±0.12
/
, 百拇医药
1×10-9
2.39±0.25
0.7
2.10±0.18
7.5
3.54±0.23
1.4
1.25±0.11
4.4
1×10-8
2.35±0.31
2.2
, 百拇医药
1.94±0.17
14.3
2.62±0.58(1)
27.0
1.11±0.11
14.7
1×10-7
2.18±0.24
9.5
1.66±0.16(1)
26.8
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2.24±0.20(2)
37.6
1.07±0.10
17.8
1×10-6
1.40±0.12(2)
41.8
1.46±0.15(2)
35.6
2.15±0.20(2)
40.0
, 百拇医药
0.95±0.08(1)
27.1
1×10-5
1.33±0.17(2)
44.8
1.46±0.15(2)
35.7
1.70±0.14(2)
52.6
0.52±0.05(2)
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59.5
1×10-4
0.62±0.11(2)
74.9
0.20±0.02(2)
91.1
0.85±0.06(6)
76.4
0.30±0.03(2)
77.0
注：与对照组比较，(1)P<0.05 (2)P<0.01
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3 讨论
谷氨酸递质灭活功能障碍是谷氨酸由兴奋性递质转变成兴奋性神经毒素并导致神经退行性病变的重要原因之一[5]。谷氨酸灭活的主要机制是重摄取。神经末梢和胶质细胞膜上都存在Na+依赖性的高亲和性和低亲和性谷氨酸重摄取系统，前者在快速终止谷氨酸递质作用方面起主要作用，而后者则主要防止谷氨酸向周围弥散[3]。
甲基汞的神经毒性与谷氨酸重摄取功能障碍有关。Brookes、Albercht和Aschner等的研究都表明[1，2]，甲基汞可抑制星状胶质细胞摄取3H-L-Glu，Albercht和Aschner等还发现巯基的供体还原型谷胱甘肽(GSH)和二巯基苏糖醇(DTT)对此种抑制作用具有保护作用[2]。如前所述、通常神经末梢的谷氨酸重摄取在迅速终止谷氨酸递质作用，避免其过渡刺激受体方面的意义更大。因此，本研究以神经末梢制备物脑突触体为实验材料，通过体外高亲和性摄取试验进一步证实了甲基汞对脑突触体3H-L-Glu重摄取功能有抑制作用。结果显示，在1×10-9～1×10-4mol/L范围内甲基汞可在不同程度上抑制大脑皮层、海马、纹状体和小脑突触体的谷氨酸摄取功能，其中在1×10-6～1×10-4mol/L范围内均有显著性意义；其抑制作用的IC50分别为7.9、3.6、2.2，4.3×10-6mol/L，其中甲基汞对纹状体突触体3H-L-Glu重摄取的抑制最强，对海马，小脑的次之，对大脑皮层的最弱，提示这种抑制作用有一定的脑区敏感性。虽然目前尚不清楚造成这种差别的原因，但提示：纹状体可能是除了通常所认为的小脑之外甲基汞作用的另一重要靶位。总之上述结果表明甲基汞可明显抑制脑突触体谷氨酸摄取能力。
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谷氨酸摄取主要由依赖Na+梯度的高亲和性谷氨酸转运体完成[6]，而Na+梯度主要靠Na+，K+-ATPase[7]，使跨膜Na+梯度降低，是甲基汞抑制突触体谷氨酸摄取功能的可能机制之一。另外，通过改变谷氨酸转运体分子上的还原巯基状态或数目[8]，影响脑组织一氧化氮(NO)分子的生成[9]，甲基汞也可影响脑突触体谷氨酸摄取功能。进一步从分子水平研究甲基汞对神经末稍或胶质细胞上谷氨酸转运体表达和调控的影响，将有助于我们深入了解甲基汞抑制谷氨酸摄取的机理。
* 国家自然科学基金资助项目(编号39470603)
作者简介：祝卫国，男，博士，讲师
参考文献
, 百拇医药
1.Brookes N. In vitro evidence for the role of glutamate in the CNS toxicity of mercury. Toxicology,1992;76:245—256
2.Albrecht J,Talbot M,Kimelberg H,et al.The role of sulfhydrl groups and calcium in the mercuric chloride-induced inhibition of glutamate uptake in rat primary astrocyte cultures.Brain Res,1993,607:249—254
3.Nicolls GD，Attwell D. The release and uptake of excitatory amino acids. TIPS,1990,11:462—468
, http://www.100md.com
4.Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,Protein measurement with the folin phenol reagents.J Biol Chem.1951,193:265—275
5.Olney JW.Excitotoxic amino acids and Hungtington's Disease,in Advances in Neurology,Vol.23(Chase TN,Wexler NS and Barbeau A.eds) New York:Raven Press,1979,609—624
6.Kanai Y,Smith CP，Hediger MA. A new family of neurotransmitter transporters:the high-affinity glutamate transporters.FASEB J,1993,7:1450—1459
, http://www.100md.com
7.Rajanna B，Hobson M. Influence of mercury on uptake of [3H]dopamine and [3H]norepinephrine by rat brain synaptosomes. Toxicol Lett,1985,27:7—14
8.Pogun S,Dawson V,Kuhar MJ. Nitric oxide inhibits [3H]-glutamate transport in synaptosomes. Synapse,1994,18:21—26
9.安社娟，陈学敏，越飞.甲基汞对大鼠脂质过氧化及信使分子一氧化氮的影响.中国公共卫生学报，1997，16(6)：374—375
1998-08-27收稿, http://www.100md.com
单位：同济医科大学环境卫生学教研室，武汉 430030
关键词：甲基汞；突触体；谷氨酸摄取
卫生研究\990402 摘要 应用高亲和性摄取试验研究了甲基汞在体外对大鼠脑突触体谷氨酸摄取的影响。结果表明，1×10-9～1×10-4mol/L甲基汞可使大鼠大脑皮层、海马、纹状体和小脑突触体3H-L-谷氨酸摄取量分别下降0.7%～74.4%、7.5%～91.1%、1.4%～76.6%和4.4%～77.0%，其中在1×10-6～1×10-4mol/L范围内均有显著性意义(P<0.05)，且均存在明显的剂量—效应关系，其抑制作用的IC50分别为7.9、3.6、2.2和4.3×10-6mol/L。本研究结果提示甲基汞可明显抑制大鼠脑突触体高亲和谷氨酸摄取功能。
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中图分类号 R994.6 Q593.2 Q517
Inhibition of glutamate uptake in rat brain synaptosome by methylmercury
Zhu Weiguo Chen Xuemin
Department of Environmental Health,Tongji Medical University,Wuhan 430030, China
The effect of methylmercury on the glutamate uptake in rat brain synaptosomes were studied in vitro by using a high affinity uptake test.The result showed that methylmercury(1×10-9～1×10-4mol/L)could decrease 3H-L-glutamate uptake in rat cerebral cortex,hippocampus, striatum and cerebellum synaptosome by 0.7%～74.4%,7.5%～91.1%,1.4%～76.6% and 4.4%～77.0%,respectively,in a dose-dependent manner,and their IC50 were 7.9, 3.6, 2.2 and 4.3×10-6mol/L,respectively.It suggested that methylmercury could obviously inhibit glutamate uptake in the synaptosomes of rat brain.
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Key words: methylmercury,synaptosome,glutamate uptake 甲基汞是一种具有神经毒性的环境污染物，它主要侵犯中枢神经系统，造成不可逆性脑损害。有研究表明，甲基汞的神经毒性与其抑制胶质细胞谷氨酸摄取，进而导致谷氨酸在突触间隙滞留过久，过度刺激突触后受体有关[1，2]。但胶质细胞膜上的谷氨酸摄取系统主要是防止谷氨酸弥散到其它神经元，避免其兴奋性作用的扩大，而神经末梢上的谷氨酸摄取系统在迅速终止谷氨酸递质作用、防止其过度刺激相应受体方面起主导作用[3]。因此，我们以神经末梢制备物脑突触体为实验材料，研究了甲基汞对谷氨酸高亲和性摄取功能的影响。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
氯化甲基汞(≥98%，Merck)，L-(2，3-3H)-谷氨酸(3H-L-Glu)(740GBq/mmol，NEN，DuPont)，PPO和POPOP闪烁体(Rath进口分装)，FJ-2107G型液体闪烁计数器(西安国营二六二厂)，LKB恒温水浴箱(LKB，瑞典)，TomyRS-20Ⅱ低温高速离心机(Seiko，日本)，Beckman低温超速离心机(Beckman，美国)，Potter玻璃-Telfon匀浆器(B.Braun，德国)
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1.2 脑突触体制备
选用健康成年雄性SD大鼠(220～240g，同济医科大学实验动物中心)，断头处死后迅速剥离全脑并分离出待测脑区，加入10倍体积冷的0.32mol/L蔗糖匀浆液，冰浴匀浆，先低温离心(1000g，10min，4℃)以去除胞核和较大碎片，上清液再离心(15000g，30min，4℃)，将得到的沉淀用少许匀浆液悬浮混匀，随后进行不连续密度梯度离心(0.8，1.0，1.2，1.4mol/L蔗糖梯度，65000g，2.5h，4℃)，收集1.0mol/L蔗糖界面附近的突触体并加入10倍体积Tris-HCl缓冲液(50mmol/L Tris-HCl pH 7.4，10mmol/L EDTA)，低温离心(35000g,10min,4℃)，沉淀物即为突触体。用Lowry法测定蛋白含量[4]，匀浆液稀释分装突触体，液氮速冻，-70℃保存备用。
1.3 突触体谷氨酸摄取实验
, 百拇医药
参照文献方法进行[5]，略作改动。谷氨酸摄取反应总体系500μl，含Krebs-碳酸氢盐缓冲液，含50μg突触体蛋白的一定量待测物。25℃水浴10min后，加入37kBq/mmol3H-L-Glu(lmmol/L)混匀，25℃水浴反应5min，加入冷的Krebs缓冲液终止反应，迅速经0.22μm硝酸纤维素膜抽滤，并用Krebs缓冲液冲洗反应管和滤膜3遍，将滤膜放入液闪瓶中、加入5ml甲苯闪烁液(含0.5%PPO，0.02%POPOP，10%甲醇和10%乙醇)及1ml乙二醇乙醚暗化过夜，在液闪计数器3H谱道测定样品的放射性强度。
1.4 统计方法
用SAS软件进行方差分析和直线相关分析。
2 结果
结果表明，1×10-9～1×10-4mol/L甲基汞可使各脑区突触体3H-L-Glu摄取能力有不同程度地降低，且都有明显的剂量-效应关系(r皮层=-0.958,r海马=-0.855，r纹状体=-0.982，r小脑=-0.955，均为P<0.05)。其中大脑皮层突触体3H-L-Glu摄取能力降低，在1×10-6～1×10-4mol/L范围内有显著性意义(P<0.05)其相应IC50=7.9×10-6mol/L；海马突触体3H-L-Glu摄取能力降低，在1×10-7～1×10-4mol/L范围内有显著性意义(P<0.05)，其中IC50=3.6×10-6mol/L；纹状体突触体3H-L-Glu摄取能力降低，在1×10-8～1×10-4mol/L范围内有显著性意义(p<0.05)，其IC50=2.2×10-6mol/L；小脑突触体3H-L-Glu摄取能力，在1×10-6～1×10-4mol/L范围内有显著性意义(P<0.05)，其IC50=4.3×10-6mmol/L(见附表)。
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附表 甲基汞对不同脑区突触体3H-L-Glu摄取的影响
[n=5,x±s,nmol/(g.min)] 剂量
(mol/L)
大脑皮层
海马
纹状体
小脑
摄取量
抑制率(%)
摄取量
抑制率(%)
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摄取量
抑制率(%)
摄取量
抑制率(%)
0
2.40±0.27
/
2.27±0.21
/
3.59±0.23
/
1.31±0.12
/
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1×10-9
2.39±0.25
0.7
2.10±0.18
7.5
3.54±0.23
1.4
1.25±0.11
4.4
1×10-8
2.35±0.31
2.2
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1.94±0.17
14.3
2.62±0.58(1)
27.0
1.11±0.11
14.7
1×10-7
2.18±0.24
9.5
1.66±0.16(1)
26.8
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2.24±0.20(2)
37.6
1.07±0.10
17.8
1×10-6
1.40±0.12(2)
41.8
1.46±0.15(2)
35.6
2.15±0.20(2)
40.0
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0.95±0.08(1)
27.1
1×10-5
1.33±0.17(2)
44.8
1.46±0.15(2)
35.7
1.70±0.14(2)
52.6
0.52±0.05(2)
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59.5
1×10-4
0.62±0.11(2)
74.9
0.20±0.02(2)
91.1
0.85±0.06(6)
76.4
0.30±0.03(2)
77.0
注：与对照组比较，(1)P<0.05 (2)P<0.01
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3 讨论
谷氨酸递质灭活功能障碍是谷氨酸由兴奋性递质转变成兴奋性神经毒素并导致神经退行性病变的重要原因之一[5]。谷氨酸灭活的主要机制是重摄取。神经末梢和胶质细胞膜上都存在Na+依赖性的高亲和性和低亲和性谷氨酸重摄取系统，前者在快速终止谷氨酸递质作用方面起主要作用，而后者则主要防止谷氨酸向周围弥散[3]。
甲基汞的神经毒性与谷氨酸重摄取功能障碍有关。Brookes、Albercht和Aschner等的研究都表明[1，2]，甲基汞可抑制星状胶质细胞摄取3H-L-Glu，Albercht和Aschner等还发现巯基的供体还原型谷胱甘肽(GSH)和二巯基苏糖醇(DTT)对此种抑制作用具有保护作用[2]。如前所述、通常神经末梢的谷氨酸重摄取在迅速终止谷氨酸递质作用，避免其过渡刺激受体方面的意义更大。因此，本研究以神经末梢制备物脑突触体为实验材料，通过体外高亲和性摄取试验进一步证实了甲基汞对脑突触体3H-L-Glu重摄取功能有抑制作用。结果显示，在1×10-9～1×10-4mol/L范围内甲基汞可在不同程度上抑制大脑皮层、海马、纹状体和小脑突触体的谷氨酸摄取功能，其中在1×10-6～1×10-4mol/L范围内均有显著性意义；其抑制作用的IC50分别为7.9、3.6、2.2，4.3×10-6mol/L，其中甲基汞对纹状体突触体3H-L-Glu重摄取的抑制最强，对海马，小脑的次之，对大脑皮层的最弱，提示这种抑制作用有一定的脑区敏感性。虽然目前尚不清楚造成这种差别的原因，但提示：纹状体可能是除了通常所认为的小脑之外甲基汞作用的另一重要靶位。总之上述结果表明甲基汞可明显抑制脑突触体谷氨酸摄取能力。
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谷氨酸摄取主要由依赖Na+梯度的高亲和性谷氨酸转运体完成[6]，而Na+梯度主要靠Na+，K+-ATPase[7]，使跨膜Na+梯度降低，是甲基汞抑制突触体谷氨酸摄取功能的可能机制之一。另外，通过改变谷氨酸转运体分子上的还原巯基状态或数目[8]，影响脑组织一氧化氮(NO)分子的生成[9]，甲基汞也可影响脑突触体谷氨酸摄取功能。进一步从分子水平研究甲基汞对神经末稍或胶质细胞上谷氨酸转运体表达和调控的影响，将有助于我们深入了解甲基汞抑制谷氨酸摄取的机理。
* 国家自然科学基金资助项目(编号39470603)
作者简介：祝卫国，男，博士，讲师
参考文献
, 百拇医药
1.Brookes N. In vitro evidence for the role of glutamate in the CNS toxicity of mercury. Toxicology,1992;76:245—256
2.Albrecht J,Talbot M,Kimelberg H,et al.The role of sulfhydrl groups and calcium in the mercuric chloride-induced inhibition of glutamate uptake in rat primary astrocyte cultures.Brain Res,1993,607:249—254
3.Nicolls GD，Attwell D. The release and uptake of excitatory amino acids. TIPS,1990,11:462—468
, http://www.100md.com
4.Lowry OH,Rosebrough NJ,Farr AL,Protein measurement with the folin phenol reagents.J Biol Chem.1951,193:265—275
5.Olney JW.Excitotoxic amino acids and Hungtington's Disease,in Advances in Neurology,Vol.23(Chase TN,Wexler NS and Barbeau A.eds) New York:Raven Press,1979,609—624
6.Kanai Y,Smith CP，Hediger MA. A new family of neurotransmitter transporters:the high-affinity glutamate transporters.FASEB J,1993,7:1450—1459
, http://www.100md.com
7.Rajanna B，Hobson M. Influence of mercury on uptake of [3H]dopamine and [3H]norepinephrine by rat brain synaptosomes. Toxicol Lett,1985,27:7—14
8.Pogun S,Dawson V,Kuhar MJ. Nitric oxide inhibits [3H]-glutamate transport in synaptosomes. Synapse,1994,18:21—26
9.安社娟，陈学敏，越飞.甲基汞对大鼠脂质过氧化及信使分子一氧化氮的影响.中国公共卫生学报，1997，16(6)：374—375
1998-08-27收稿, http://www.100md.com