纳米红色元素硒的急性毒性和生物利用性
作者：高学云 张劲松 张立德
单位：高学云(中国科学技术大学经济技术学院，合肥 230052)；张劲松(中国科学技术大学经济技术学院，合肥 230052)；张立德(中国科学院固体物理研究所)
关键词：硒；生物利用性；纳米红色元素硒；急性毒性
摘要摘要：纳米红色元素硒是以蛋白质为分散剂的元素硒的纳米粒子，粒径在60nm以内。体外研究证实，纳米红色元素硒能够与谷胱甘肽反应，其反应能力约为亚硒酸钠的1/20至1/10。急性毒性实验证实以口服硒元素的量计，纳米红色元素硒的LD50=112.98(89.95～141.90)mg/kgBW，亚硒酸钠的LD50=15.72(13.38～18.47)mg/kgBW，显示出纳米红色元素硒的毒性低。生物利用性试验证实：小鼠分别口服纳米红色元素硒和亚硒酸钠(Se 50μg/kg BW)30天，与对照组比，2种硒都能显著提高小鼠血硒和肝硒浓度，血中谷胱甘肽过氧化物酶活性升高。这说明纳米红色元素硒能被小鼠较好利用。
, 百拇医药
中图分类号：Q613.52 R994.4 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)01-0057-02
Acute toxicity and bioavailability of nano red elemental selenium
Gao Xueyun, Zhang Jinsong, Zhang Lide
Institute of Economics and Technology,University of Science and Technology,Hefei 230052,China
Abstract：The reaction ratio of nano red elemental selenium(nanose)with GSH in vitro was one-tenth of that of sodium selenite.Mice were fed with nanose and sodium selenite separately at 50μg/kg BW for 30 days.Both selenium forms could significantly increased Se concentration of blood,liver and activity of blood GSH-Px.Acute toxicity experiment of mice implied that the acute toxicity of nanose was nearly one-seventh of that of sodium selenite.The LD50 for nanose se was 112.98mg kg BW,and the LD50 for sodium selenite was Se 15.72mg/kg BW.The acute toxicity of nanose was low for mice.
, 百拇医药
Key words：selenium, bioavailability, nano red elemental selenium, acute toxicity
已知灰色元素硒和黑色元素硒，几乎无生物活性和毒性。目前，对于红色元素硒生物性质的认识是模糊的。通常情况下，无机化学反应形成的红色元素硒为粗大颗粒，易聚合形成灰色元素硒或黑色元素硒。一些微生物对无机硒有耐受性，原因是将无机硒转化形成为对这些微生物无毒性的处于胶体状态的红色元素硒[1]。
我们在体外研究中发现，蛋白质能够控制红色元素硒原子的聚合，从而形成以蛋白质为分散剂的纳米粒子，呈红色，粒径在60nm以内，简称为纳米硒。这种纳米红色元素硒对热稳定，不转化形成灰或黑色元素硒。本文研究了在化学体系中，纳米红色元素硒与谷胱甘肽的反应率；纳米红色元素硒的生物利用性及其急性毒性。
1 材料和方法
, http://www.100md.com
1.1 试剂和仪器
纳米红色元素硒由专利方法(97106962.X)制备。亚硒酸钠为国产分析纯，含量大于97%。DTNB：5，5’-二硫代双硝基苯甲酸，Fluka产品。DAN：2，3-二氨基萘，Sigma产品。GSH：还原型谷胱甘肽，为国产分析纯。国产751分光光度计和960荧光光度计。
1.2 动物
昆明种小鼠，雌雄各半，体重19～21g。由安徽医科大学提供。合格证号：皖医实动准第01号。
1.3 硒的生物利用性试验
将30只小鼠随机分为3组，每组10只，雌雄各半。对照组(NC)灌喂生理盐水，亚硒酸钠组(SE)和纳米红色元素硒组(NS)按体重分别灌喂Se 50μg/kg BW共30天。测定血、肝硒和全血GSH-Px活性[2，3]。结果见表1。
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表1 纳米硒和亚硒酸钠的生物利用性比较(
±s,n=10)
分组
硒剂量 (μg/kg BW)
肝硒浓度
(nmol/g)
血硒浓度
(nmol/g)
血中谷胱甘肽
过氧化物酶活性
(U/ml)
, 百拇医药
NC
0
7.09±2.05
1.57±0.47
50.30± 9.30
NS
50
15.17±2.30(1)
2.94±0.77(1)
65.18±10.10(2)
SE
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50
13.38±2.10(1)
3.01±0.67(1)
62.64± 6.78(2)
注：与对照组(NC)比较，(1)P<0.001 (2)P<0.011.4 硒的急性毒性试验
将120只小鼠随机分为12组，每组10只，雌雄各半。5组灌喂不同剂量亚硒酸钠溶液，7组灌喂不同剂量纳米红色元素硒溶液。组间比值为1∶0.7。灌胃容积0.4ml/10g BW。给药后连续观察14天。结果见表2。
表2 纳米硒和亚硒酸钠急性毒性比较(n=10)
纳米硒
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亚硒酸钠
剂 量 (mg/kg BW)
小鼠死亡数
剂 量
(mg/kg BW)
小鼠死亡数
200.0
6
25.0
10
140.0
5
17.5
, http://www.100md.com
4
98.0
5
12.3
3
68.6
4
8.6
1
48.0
1
6.0
0
33.6
, 百拇医药
0
23.5
0
1.5 硒与还原型谷胱甘肽的体外反应
配制含Se4.0μg/ml的亚硒酸钠溶液及含Se 40.0μg/ml的纳米红色元素硒溶液。1mmol/L GSH(pH7.0，0.2mol/L PBS，2.5mmol/L NaN3，0.2mmol/L EDTA-2Na)0.2ml，加入不同容积硒溶液，37℃准确反应10min，加入4.3ml PBS(pH8.0,0.1mol/L)，0.5ml DTNB(400mg DTNB和10g柠檬酸钠溶解于1L蒸馏水)，反应5min后，于751分光光度计在波长412nm(A412)处测吸光值。结果见表3。
1.6 统计实验数据
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用±s表示，用SAS软件进行统计处理和显著性检验。
2 结果
2.1 纳米硒和亚硒酸钠的生物利用性
表1表明小鼠分别灌喂2种形式的硒50μg/kg BW30天，与正常对照组比，其血硒和肝硒浓度以及全血GSH-Px活性都显著提高。亚硒酸钠组与纳米红色元素硒组间各指标无统计上的差别。说明与灰黑色单质硒不同，纳米红色元素硒能被小鼠较好利用。
2.2 纳米硒和亚硒酸钠的急性毒性
由表2按Smyth H F法计算出小鼠口服纳米红色元素硒的急性毒性以硒计LD50=112.98mg/kg BW，95%的可信限89.95～141.90mg/kg BW；亚硒酸钠的急性毒性LD50=15.72mg/kg BW，95%的可信限13.38～18.47mg/kg BW，与文献报道一致[4]。亚硒酸钠的急性毒性约为纳米红色元素硒的7倍。
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2.3 纳米硒和亚硒酸钠与谷胱甘肽的体外反应
亚硒酸钠中硒的反应率(%)=[200(A1-A2)/4A1B]×100%；纳米红色元素硒中硒的反应率(%)=[200(A1-A2)/2A1B]×100%。
式中，A1表示反应体系不加硒时GSH与DTNB反应的吸光值；A2表示反应体系加硒反应后GSH与DTNB反应的吸光值；B表示反应体系中硒的总摩尔量；200表示反应体系中GSH的总摩尔量；4和2表示亚硒酸钠和纳米红色元素硒分别与GSH反应的化学配比。硒的反应率表示在上述反应条件下，亚硒酸钠与纳米红色元素硒分别与GSH反应的能力。
由表3可知，在所测试的剂量范围内，参加反应的亚硒酸钠的量高于纳米红色元素硒的10至20倍。
, 百拇医药
表3 纳米硒和亚硒酸钠与谷胱甘肽在体外体系中的反应率
亚硒酸钠
纳米硒
硒含量 (ng)
反应率
(%)
硒含量
(ng)
反应率
(%)
20
2.7
200
, http://www.100md.com
2.4
40
5.0
400
4.2
80
9.5
800
8.5
160
22.5
1600
17.1
, 百拇医药
240
30.2
2400
16.2
320
34.5
3200
17.7
400
37.7
4000
16.5
640
, 百拇医药
42.3
6400
18.7
3 讨论
长时间以来，研究人员忽视了对元素硒的深入研究，只是认为灰元素硒和黑色元素硒几乎无生物活性和毒性。纳米红色元素硒是以蛋白质为分散剂的元素硒的纳米粒子。纳米粒子有不同于宏观和微观物质的特性，纳米红色元素硒粒子中的硒原子比灰色元素硒和黑色元素硒中的硒原子有更活泼的化学性质[5]。纳米红色元素硒易溶于水，与Na2SeO3比，纳米红色元素硒能与GSH以较低的反应率反应，这些性质提示纳米红色元素硒有参与生物体代谢的物理化学活性。生物利用性的结果表明，纳米红色元素硒与Na2SeO3在提高小鼠的血硒和肝硒的浓度及全血GSH-Px活性上处于同一水平，这也证实了纳米红色元素硒可以被小鼠利用。许多研究人员认为，GSH与硒反应产生
等自由基进而损伤生物组织是其产生生物毒性的原因之一。纳米红色元素硒的急性毒性很低的原因之一可能是纳米红色元素硒与生物体内GSH反应率低进而自由基产生量低。纳米红色元素硒粒子所具有的小尺寸效应、表面效应等特性都会使其表现出特殊的生物特性[5，6]。研究纳米红色元素硒的生物性质，可以拓宽对元素硒的认识，从而探索找出高生物利用性和低毒性的硒的形式。
, 百拇医药
基金项目：国家烟草专卖局科研基金(No.952051)
作者简介：高学云，男，博士，助理研究员
参考文献
1，Garbisu C,Gonzalez S,Yang WH,et al.Physiological mechanisms regulating the conversion of selenite to elemental selenium by Bacillus subtilis.Biofacters,1995,5(1):29—35
2，Tomei FA,Barton LL,Semanski CL,et al.Transformation of selenate and selenite to elemental selenium by Desulfovibrio desulfuricans.J Ind Microbiol,1995,14(3,4):329—335
3，王光亚，刘胜杰，杨光圻，等.生物样品、水及土壤中痕量硒的荧光测定(Ⅰ).营养学报，1985，7(1)：39—45
4，邓海，梁玉香.硒氟急性联合毒性实验.卫生研究，1996，25(1)：24—25
5，Ball P,Garwin L.Science at the atomic scale.Nature,1992,355:761-763
6，张立德，牟季美.纳米材料学.沈阳：辽宁科学技术出版社，1994，1—9
(1999-06-21收稿), http://www.100md.com
单位：高学云(中国科学技术大学经济技术学院，合肥 230052)；张劲松(中国科学技术大学经济技术学院，合肥 230052)；张立德(中国科学院固体物理研究所)
关键词：硒；生物利用性；纳米红色元素硒；急性毒性
摘要摘要：纳米红色元素硒是以蛋白质为分散剂的元素硒的纳米粒子，粒径在60nm以内。体外研究证实，纳米红色元素硒能够与谷胱甘肽反应，其反应能力约为亚硒酸钠的1/20至1/10。急性毒性实验证实以口服硒元素的量计，纳米红色元素硒的LD50=112.98(89.95～141.90)mg/kgBW，亚硒酸钠的LD50=15.72(13.38～18.47)mg/kgBW，显示出纳米红色元素硒的毒性低。生物利用性试验证实：小鼠分别口服纳米红色元素硒和亚硒酸钠(Se 50μg/kg BW)30天，与对照组比，2种硒都能显著提高小鼠血硒和肝硒浓度，血中谷胱甘肽过氧化物酶活性升高。这说明纳米红色元素硒能被小鼠较好利用。
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中图分类号：Q613.52 R994.4 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)01-0057-02
Acute toxicity and bioavailability of nano red elemental selenium
Gao Xueyun, Zhang Jinsong, Zhang Lide
Institute of Economics and Technology,University of Science and Technology,Hefei 230052,China
Abstract：The reaction ratio of nano red elemental selenium(nanose)with GSH in vitro was one-tenth of that of sodium selenite.Mice were fed with nanose and sodium selenite separately at 50μg/kg BW for 30 days.Both selenium forms could significantly increased Se concentration of blood,liver and activity of blood GSH-Px.Acute toxicity experiment of mice implied that the acute toxicity of nanose was nearly one-seventh of that of sodium selenite.The LD50 for nanose se was 112.98mg kg BW,and the LD50 for sodium selenite was Se 15.72mg/kg BW.The acute toxicity of nanose was low for mice.
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Key words：selenium, bioavailability, nano red elemental selenium, acute toxicity
已知灰色元素硒和黑色元素硒，几乎无生物活性和毒性。目前，对于红色元素硒生物性质的认识是模糊的。通常情况下，无机化学反应形成的红色元素硒为粗大颗粒，易聚合形成灰色元素硒或黑色元素硒。一些微生物对无机硒有耐受性，原因是将无机硒转化形成为对这些微生物无毒性的处于胶体状态的红色元素硒[1]。
我们在体外研究中发现，蛋白质能够控制红色元素硒原子的聚合，从而形成以蛋白质为分散剂的纳米粒子，呈红色，粒径在60nm以内，简称为纳米硒。这种纳米红色元素硒对热稳定，不转化形成灰或黑色元素硒。本文研究了在化学体系中，纳米红色元素硒与谷胱甘肽的反应率；纳米红色元素硒的生物利用性及其急性毒性。
1 材料和方法
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1.1 试剂和仪器
纳米红色元素硒由专利方法(97106962.X)制备。亚硒酸钠为国产分析纯，含量大于97%。DTNB：5，5’-二硫代双硝基苯甲酸，Fluka产品。DAN：2，3-二氨基萘，Sigma产品。GSH：还原型谷胱甘肽，为国产分析纯。国产751分光光度计和960荧光光度计。
1.2 动物
昆明种小鼠，雌雄各半，体重19～21g。由安徽医科大学提供。合格证号：皖医实动准第01号。
1.3 硒的生物利用性试验
将30只小鼠随机分为3组，每组10只，雌雄各半。对照组(NC)灌喂生理盐水，亚硒酸钠组(SE)和纳米红色元素硒组(NS)按体重分别灌喂Se 50μg/kg BW共30天。测定血、肝硒和全血GSH-Px活性[2，3]。结果见表1。
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表1 纳米硒和亚硒酸钠的生物利用性比较(
±s,n=10)分组
硒剂量 (μg/kg BW)
肝硒浓度
(nmol/g)
血硒浓度
(nmol/g)
血中谷胱甘肽
过氧化物酶活性
(U/ml)
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NC
0
7.09±2.05
1.57±0.47
50.30± 9.30
NS
50
15.17±2.30(1)
2.94±0.77(1)
65.18±10.10(2)
SE
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50
13.38±2.10(1)
3.01±0.67(1)
62.64± 6.78(2)
注：与对照组(NC)比较，(1)P<0.001 (2)P<0.011.4 硒的急性毒性试验
将120只小鼠随机分为12组，每组10只，雌雄各半。5组灌喂不同剂量亚硒酸钠溶液，7组灌喂不同剂量纳米红色元素硒溶液。组间比值为1∶0.7。灌胃容积0.4ml/10g BW。给药后连续观察14天。结果见表2。
表2 纳米硒和亚硒酸钠急性毒性比较(n=10)
纳米硒
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亚硒酸钠
剂 量 (mg/kg BW)
小鼠死亡数
剂 量
(mg/kg BW)
小鼠死亡数
200.0
6
25.0
10
140.0
5
17.5
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4
98.0
5
12.3
3
68.6
4
8.6
1
48.0
1
6.0
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33.6
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0
23.5
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1.5 硒与还原型谷胱甘肽的体外反应
配制含Se4.0μg/ml的亚硒酸钠溶液及含Se 40.0μg/ml的纳米红色元素硒溶液。1mmol/L GSH(pH7.0，0.2mol/L PBS，2.5mmol/L NaN3，0.2mmol/L EDTA-2Na)0.2ml，加入不同容积硒溶液，37℃准确反应10min，加入4.3ml PBS(pH8.0,0.1mol/L)，0.5ml DTNB(400mg DTNB和10g柠檬酸钠溶解于1L蒸馏水)，反应5min后，于751分光光度计在波长412nm(A412)处测吸光值。结果见表3。
1.6 统计实验数据
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用
±s表示，用SAS软件进行统计处理和显著性检验。2 结果
2.1 纳米硒和亚硒酸钠的生物利用性
表1表明小鼠分别灌喂2种形式的硒50μg/kg BW30天，与正常对照组比，其血硒和肝硒浓度以及全血GSH-Px活性都显著提高。亚硒酸钠组与纳米红色元素硒组间各指标无统计上的差别。说明与灰黑色单质硒不同，纳米红色元素硒能被小鼠较好利用。
2.2 纳米硒和亚硒酸钠的急性毒性
由表2按Smyth H F法计算出小鼠口服纳米红色元素硒的急性毒性以硒计LD50=112.98mg/kg BW，95%的可信限89.95～141.90mg/kg BW；亚硒酸钠的急性毒性LD50=15.72mg/kg BW，95%的可信限13.38～18.47mg/kg BW，与文献报道一致[4]。亚硒酸钠的急性毒性约为纳米红色元素硒的7倍。
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2.3 纳米硒和亚硒酸钠与谷胱甘肽的体外反应
亚硒酸钠中硒的反应率(%)=[200(A1-A2)/4A1B]×100%；纳米红色元素硒中硒的反应率(%)=[200(A1-A2)/2A1B]×100%。
式中，A1表示反应体系不加硒时GSH与DTNB反应的吸光值；A2表示反应体系加硒反应后GSH与DTNB反应的吸光值；B表示反应体系中硒的总摩尔量；200表示反应体系中GSH的总摩尔量；4和2表示亚硒酸钠和纳米红色元素硒分别与GSH反应的化学配比。硒的反应率表示在上述反应条件下，亚硒酸钠与纳米红色元素硒分别与GSH反应的能力。
由表3可知，在所测试的剂量范围内，参加反应的亚硒酸钠的量高于纳米红色元素硒的10至20倍。
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表3 纳米硒和亚硒酸钠与谷胱甘肽在体外体系中的反应率
亚硒酸钠
纳米硒
硒含量 (ng)
反应率
(%)
硒含量
(ng)
反应率
(%)
20
2.7
200
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2.4
40
5.0
400
4.2
80
9.5
800
8.5
160
22.5
1600
17.1
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240
30.2
2400
16.2
320
34.5
3200
17.7
400
37.7
4000
16.5
640
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42.3
6400
18.7
3 讨论
长时间以来，研究人员忽视了对元素硒的深入研究，只是认为灰元素硒和黑色元素硒几乎无生物活性和毒性。纳米红色元素硒是以蛋白质为分散剂的元素硒的纳米粒子。纳米粒子有不同于宏观和微观物质的特性，纳米红色元素硒粒子中的硒原子比灰色元素硒和黑色元素硒中的硒原子有更活泼的化学性质[5]。纳米红色元素硒易溶于水，与Na2SeO3比，纳米红色元素硒能与GSH以较低的反应率反应，这些性质提示纳米红色元素硒有参与生物体代谢的物理化学活性。生物利用性的结果表明，纳米红色元素硒与Na2SeO3在提高小鼠的血硒和肝硒的浓度及全血GSH-Px活性上处于同一水平，这也证实了纳米红色元素硒可以被小鼠利用。许多研究人员认为，GSH与硒反应产生
等自由基进而损伤生物组织是其产生生物毒性的原因之一。纳米红色元素硒的急性毒性很低的原因之一可能是纳米红色元素硒与生物体内GSH反应率低进而自由基产生量低。纳米红色元素硒粒子所具有的小尺寸效应、表面效应等特性都会使其表现出特殊的生物特性[5，6]。研究纳米红色元素硒的生物性质，可以拓宽对元素硒的认识，从而探索找出高生物利用性和低毒性的硒的形式。, 百拇医药
基金项目：国家烟草专卖局科研基金(No.952051)
作者简介：高学云，男，博士，助理研究员
参考文献
1，Garbisu C,Gonzalez S,Yang WH,et al.Physiological mechanisms regulating the conversion of selenite to elemental selenium by Bacillus subtilis.Biofacters,1995,5(1):29—35
2，Tomei FA,Barton LL,Semanski CL,et al.Transformation of selenate and selenite to elemental selenium by Desulfovibrio desulfuricans.J Ind Microbiol,1995,14(3,4):329—335
3，王光亚，刘胜杰，杨光圻，等.生物样品、水及土壤中痕量硒的荧光测定(Ⅰ).营养学报，1985，7(1)：39—45
4，邓海，梁玉香.硒氟急性联合毒性实验.卫生研究，1996，25(1)：24—25
5，Ball P,Garwin L.Science at the atomic scale.Nature,1992,355:761-763
6，张立德，牟季美.纳米材料学.沈阳：辽宁科学技术出版社，1994，1—9
(1999-06-21收稿), http://www.100md.com