氯化镉对人胚肺成纤维细胞的恶性转化作用
作者：李永安 王晓丽 爱平 冯彪 凌翎 李志超 范洪学
单位：李永安(白求恩医科大学预防医学院毒理教研室，长春 130021)；王晓丽(白求恩医科大学预防医学院毒理教研室，长春 130021)；石爱平(白求恩医科大学第一临床学院泌尿外科)；冯彪(白求恩医科大学预防医学院毒理教研室，长春 130021)；凌翎(白求恩医科大学预防医学院毒理教研室，长春 130021)；李志超(白求恩医科大学预防医学院毒理教研室，长春 130021)；范洪学(白求恩医科大学预防医学院毒理教研室，长春 130021)
关键词：镉；恶性转化；致癌
摘要摘要：为研究氯化镉致人胚肺成纤维细胞的恶性转化作用，用染色体分析、3H-TdR掺入实验和流式细胞术检测了转化细胞染色体畸变、各细胞周期时相细胞的比例和DNA合成情况。结果显示，氯化镉在0.004μmol/L、0.02μmol/L、0.04 μmol/L 3个实验浓度都可使人胚肺成纤维细胞生长排列紊乱，失去方向性和密度调节作用，重叠生长，形成明显的转化灶；染色体发生畸变：数目增多或减少，结构出现断片、双着丝粒体；S期细胞比例增大；细胞DNA合成异常旺盛，其中实验组DNA合成量约为阴性对照组的2.4～3.8倍。
, 百拇医药
中图分类号：R734.2 Q343.245 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)01-0034-03
Effects of cadmium chloride on the malignant transformation of human embryo lung fibroblasts
Li Yong-an, Wang Xiaoli, Shi Aiping, Feng Biao, et al.
(Department of Toxicology, School of Preventive Medicine, Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021,China)
, 百拇医药
Abstract：The malignant transformation of human embryo lung fibroblast (HELF) induced by CdCl2 was tested by 3H-TdR incorporation, chromosome analysis and flow cytometry. Chromosome aberration, the ratio of cells in different cell cycle phases and the quantities of DNA synthesis of differnet groups were determined. The results showed that the morphology of HELF changed in three levels of cadmium chloride (Ⅰ 0.004μmol/L, Ⅱ0.02 μmol/L and Ⅲ 0.04 μmol/L)treated for three times. The cell growth was disordered and overlapping without density regulating effect and the transforming foci were formed. The quantities of chromosome were decreased or increased and the dicentric and acentric fragments were found in experimental groups. The ratio of cells in S phase increased and the quantities of DNA synthesis in experimental groups were 2.4—3.8 times higher than that of negative control group. The chromosome aberration of cells, the increase of cells in S phase and the increase of DNA synthesis may play some roles in the malignant transformation of HELF induced by CdCl2.
, 百拇医药
Key words：cadmium, malignant transformation, mechanism of carcinogenesis
随着工业生产的迅速发展，镉(Cd)对环境的污染越来越严重，人群流行病学和动物实验都有报道认为镉与人类肿瘤有一定相关关系，IARC(international agency for research on cancer)于1994年将镉列为人类致癌物。目前研究镉的致癌机理更具有实际意义，因此本文在氯化镉诱导人胚肺成纤维细胞(HELF)恶性转化的基础上，检测转化细胞染色体畸变、各细胞周期时相的细胞比例和DNA合成情况。
1 材料与方法
1.1 恶性转化实验
1.1.1 细胞制备 取双亲系三代无肿瘤及先天性或遗传病病史、4个月左右水囊引产胎儿(由长春市妇产医院提供)，在无菌条件下取出部分肺组织，用Hank's液冲洗3次，将胎肺剪成1cm×1cm组织块，加入适量的0.25%胰酶，置37℃水浴中消化30min，再用Hank's液冲洗3次，加入DMEM(dulbecco's modified eagle medium)培养液(含20%胎牛血清，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素)制成单细胞悬液，分至5cm×5cm培养瓶内，每瓶细胞数(6～21)×107，于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁生长后传代培养。
, 百拇医药
1.1.2 细胞转化 基础培养体系为不含血清的DMEM培养液，各组的不同成分：阴性对照为双蒸水，阳性对照为N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG 2μg/ml)，3个实验组氯化镉的终浓度分别为Ⅰ组0.004μmol/L；Ⅱ组0.02μmol/L；Ⅲ组0.04μmol/L。将细胞传代培养2～3代，每组3个培养瓶，待细胞生长达70%～80%融合后，各组分别换用相应的培养液37℃、5%CO2培养24小时，弃去原培养液，用基础培养液冲洗3次，加入含20%胎牛血清的新鲜DMEM培养液继续培养，待细胞融合70%～80%时，按1∶2传代，观察其细胞生长状况，待细胞长至8～11代和22～24代时，用同样方法进行第2次和第3次染毒。
1.1.3 形态学观察 每天观察、记录各瓶细胞生长方式及形态变化。
1.2 染色体制备及分析
每组选第25代细胞2瓶，用常规方法制备染色体标本。选取100个分裂好的中期分裂相细胞，根据ISCN(1981)标准进行核型分析，包括数目变化及结构畸变，计算畸变染色体细胞率。采用χ2检验对结果进行统计学处理。
, 百拇医药
1.3 细胞周期不同时相的检测
1.3.1 单细胞悬液制备及固定 选第25代生长旺盛的细胞，用0.25%胰酶消化后，用PBS(pH6.8)最后制成每管细胞数为2×106/ml的单细胞悬液，每组5个平行样。将细胞通过400目尼龙网注入70%冷乙醇中，4℃冰箱中固定18小时后离心洗细胞，用200μl PBS悬浮细胞待测定。
1.3.2 细胞DNA和RNA的测定 加入与细胞悬液等体积的0.1mg/ml的RNA酶，37℃消化30分钟。离心洗涤2次，再于200μl细胞悬液中加入等体积碘化丙啶荧光染液(0.05mg/ml，含0.03% Triton-X100)，4℃染色30分钟。用美国B-D公司的FACScan流式细胞仪测定。采用方差分析、q检验对结果进行统计学处理。
1.4 细胞转化(3H-TdR掺入)实验
, 百拇医药
将第25代已达70%～80%融合的各组细胞，用0.25%胰酶消化后，细胞数按1.5×105/孔接种于24孔板内(每组设3个平行样)，每孔加入1ml含15%胎牛血清的新鲜DMEM培养液，培养24小时后，更换培养液，同时每孔加入37kBq(1μ Ci)的3H-TdR，置37℃培养液中培养3小时后，置冰浴中终止掺入反应，弃去培养液，用0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸二钠消化后，用抽滤器将细胞收集于微孔滤膜上，依次用冷生理盐水，5%三氯醋酸，无水乙醇洗涤，收集滤膜于室温晾干后放入闪烁液中(内含0.8%PPO和0.06%POPOP的二甲苯液)，避光放置2小时以上，用LKB-1214型液体闪烁器测量cpm值，放射性标记物3H-TdR由中科院原子能研究所提供。实验重复一次。资料进行方差分析、q检验统计学处理。
2 实验结果
2.1 氯化镉导致HELF的形态学改变
, 百拇医药
阴性对照组细胞生长规整，成束状排列，具有明显方向性，无重叠生长现象(图1)。光镜下实验组单个细胞形态并未见到改变，但细胞群体生长方式发生变化，第1次氯化镉处理后传2代，Ⅲ组细胞发生生长杂乱倾向，Ⅰ、Ⅱ组细胞于染镉4代后才出现此现象。经第2次处理后，各组细胞生长紊乱(图2)，失去方向性，有些区域的细胞相互交叉重叠，形成明显转化灶(图3)，转化灶中央交叉堆集浓染的细胞核；周围可见细胞核的交叉；转化灶边缘可见细胞稀疏部位。经第3次处理后，各组细胞转化灶数均明显增多，阳性对照组形态变化过程基本同Ⅱ组。
图1 阴性对照组细胞形态
(10×20)
, 百拇医药
图2 实验组第2次处理后细胞
形态(10×20)
图3 实验组第2次处理后形成
转化灶(10×20)
2.2 氯化镉对HELF染色体的影响
实验组细胞染色体核型分析，在不同程度上表现出非整倍体的特征，核型为46条染色体的细胞约占27%～45%，其余细胞染色体数波动在30或90条左右，并存在染色体结构畸变：断片、双着丝粒体。染色体数目畸变细胞率和染色体结构畸变细胞率都随氯化镉浓度的增加而增大，分别为55%、58%、73%和9%、11%、12%。阴性对照组染色体为46条的占92%，保持正常二倍体核型，结果表明：实验组染色体数目异常细胞百分率明显高于阴性对照组(P<0.005)，实验组染色体结构畸变细胞百分率也高于阴性对照组(ⅠP<0.01，Ⅱ、Ⅲ P<0.05)。
, 百拇医药
2.3 氯化镉对细胞周期时相的影响
如表1所示，处于G1期的细胞实验组明显低于阴性对照组(P<0.01)，且呈剂量-效应关系。而处于S期的细胞实验组明显高于阴性对照组(P<0.01)。
表1 各组处于Go/G1和S期细胞比例的比较(
±s,n=5)
组别
实验处理
G0/G1期
(%)
, http://www.100md.com
S期
(%)
阴性对照组
双蒸水
76.58±9.48
10.00±2.22
阳性对照组
MNNG
51.00±6.83
32.00±6.14
实验Ⅰ组
CdCl2 0.004μmol/L
, 百拇医药
68.42±6.94
19.90±2.84
实验Ⅱ组
CdCl2 0.02μmol/L
60.60±3.80
22.60±2.83
实验Ⅲ组
CdCl2 0.04μmol/L
16.70±5.55
80.40±8.93
2.4 氯化镉对3H-TdR掺入的影响
, http://www.100md.com
结果见表2，实验组3H-TdR掺入量(cpm)明显高于阴性对照组(P<0.01)，分别为阴性对照组的2.4、3.1、3.8倍。
表2 各组3H-TdR掺入量的比较(±s,n=3)
组别
实验处理
3H-TdR掺入量
(cpm)
阴性对照组
双蒸水
, 百拇医药
1344±278
阳性对照组
MNNG
2123±272
实验Ⅰ组
CdCl2 0.004μmol/L
3258±356
实验Ⅱ组
CdCl2 0.02μmol/L
3833±649
实验Ⅲ组
, 百拇医药 CdCl2 0.04μmol/L
5014±473
3 讨论
由于人体细胞癌变是多因素、多阶段、多途径的过程，因而无论用何种致癌因素处理人体细胞，经1次处理是很难发生恶性转化的[1，2]。我们实验中所采用的人胚肺成纤维细胞与成人细胞相比是处在转化过程的起点，经3次处理才发生恶性转化，表明氯化镉诱发人胚肺成纤维细胞恶性转化也是一个多阶段过程，且其转化程度与处理次数成正比。
本研究发现氯化镉的致突变作用，是作为一种染色体断裂剂。染色体断裂后就有可能导致染色体DNA的重排和丢失，使细胞基因组中抗癌基因失活而原癌基因也有可能被激活成有活性的癌基因[3]。此外，结果发现氯化镉还可使S期细胞比例增多，且DNA大量合成，在细胞恶性转化过程中可能起着一定作用。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金(No.39570603)
作者简介：李永安，男，硕士，副教授
参考文献
1，Namba M, Nishitani K, Hyodoh F. Neoplastic transformation of human diploid fibroblasts(KWSt-6) by treatment with Co-60 gamma rays. Int J Cancer, 1985,35:275—280
2，Rhim JS. Neoplastic transformation of primary human epidermal krratinocytes by the combined action of a DNA tumor virus and chemical carcinogens. Proc AACR, 1985,26:128—137
3，Newcomb WE, Steinberg JJ, Pelicer A. Ras oncogene and phenotypic staging in N-methylnitrosourea and γ-irradition induced thymic rymphomas in C57BL/6J. Cancer Res, 1988,48:5514—5521
(1999-04-28收稿), 百拇医药
单位：李永安(白求恩医科大学预防医学院毒理教研室，长春 130021)；王晓丽(白求恩医科大学预防医学院毒理教研室，长春 130021)；石爱平(白求恩医科大学第一临床学院泌尿外科)；冯彪(白求恩医科大学预防医学院毒理教研室，长春 130021)；凌翎(白求恩医科大学预防医学院毒理教研室，长春 130021)；李志超(白求恩医科大学预防医学院毒理教研室，长春 130021)；范洪学(白求恩医科大学预防医学院毒理教研室，长春 130021)
关键词：镉；恶性转化；致癌
摘要摘要：为研究氯化镉致人胚肺成纤维细胞的恶性转化作用，用染色体分析、3H-TdR掺入实验和流式细胞术检测了转化细胞染色体畸变、各细胞周期时相细胞的比例和DNA合成情况。结果显示，氯化镉在0.004μmol/L、0.02μmol/L、0.04 μmol/L 3个实验浓度都可使人胚肺成纤维细胞生长排列紊乱，失去方向性和密度调节作用，重叠生长，形成明显的转化灶；染色体发生畸变：数目增多或减少，结构出现断片、双着丝粒体；S期细胞比例增大；细胞DNA合成异常旺盛，其中实验组DNA合成量约为阴性对照组的2.4～3.8倍。
, 百拇医药
中图分类号：R734.2 Q343.245 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)01-0034-03
Effects of cadmium chloride on the malignant transformation of human embryo lung fibroblasts
Li Yong-an, Wang Xiaoli, Shi Aiping, Feng Biao, et al.
(Department of Toxicology, School of Preventive Medicine, Norman Bethune University of Medical Sciences,Changchun 130021,China)
, 百拇医药
Abstract：The malignant transformation of human embryo lung fibroblast (HELF) induced by CdCl2 was tested by 3H-TdR incorporation, chromosome analysis and flow cytometry. Chromosome aberration, the ratio of cells in different cell cycle phases and the quantities of DNA synthesis of differnet groups were determined. The results showed that the morphology of HELF changed in three levels of cadmium chloride (Ⅰ 0.004μmol/L, Ⅱ0.02 μmol/L and Ⅲ 0.04 μmol/L)treated for three times. The cell growth was disordered and overlapping without density regulating effect and the transforming foci were formed. The quantities of chromosome were decreased or increased and the dicentric and acentric fragments were found in experimental groups. The ratio of cells in S phase increased and the quantities of DNA synthesis in experimental groups were 2.4—3.8 times higher than that of negative control group. The chromosome aberration of cells, the increase of cells in S phase and the increase of DNA synthesis may play some roles in the malignant transformation of HELF induced by CdCl2.
, 百拇医药
Key words：cadmium, malignant transformation, mechanism of carcinogenesis
随着工业生产的迅速发展，镉(Cd)对环境的污染越来越严重，人群流行病学和动物实验都有报道认为镉与人类肿瘤有一定相关关系，IARC(international agency for research on cancer)于1994年将镉列为人类致癌物。目前研究镉的致癌机理更具有实际意义，因此本文在氯化镉诱导人胚肺成纤维细胞(HELF)恶性转化的基础上，检测转化细胞染色体畸变、各细胞周期时相的细胞比例和DNA合成情况。
1 材料与方法
1.1 恶性转化实验
1.1.1 细胞制备 取双亲系三代无肿瘤及先天性或遗传病病史、4个月左右水囊引产胎儿(由长春市妇产医院提供)，在无菌条件下取出部分肺组织，用Hank's液冲洗3次，将胎肺剪成1cm×1cm组织块，加入适量的0.25%胰酶，置37℃水浴中消化30min，再用Hank's液冲洗3次，加入DMEM(dulbecco's modified eagle medium)培养液(含20%胎牛血清，100IU/ml青霉素，100IU/ml链霉素)制成单细胞悬液，分至5cm×5cm培养瓶内，每瓶细胞数(6～21)×107，于37℃、5%CO2培养箱中培养，待细胞贴壁生长后传代培养。
, 百拇医药
1.1.2 细胞转化 基础培养体系为不含血清的DMEM培养液，各组的不同成分：阴性对照为双蒸水，阳性对照为N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG 2μg/ml)，3个实验组氯化镉的终浓度分别为Ⅰ组0.004μmol/L；Ⅱ组0.02μmol/L；Ⅲ组0.04μmol/L。将细胞传代培养2～3代，每组3个培养瓶，待细胞生长达70%～80%融合后，各组分别换用相应的培养液37℃、5%CO2培养24小时，弃去原培养液，用基础培养液冲洗3次，加入含20%胎牛血清的新鲜DMEM培养液继续培养，待细胞融合70%～80%时，按1∶2传代，观察其细胞生长状况，待细胞长至8～11代和22～24代时，用同样方法进行第2次和第3次染毒。
1.1.3 形态学观察 每天观察、记录各瓶细胞生长方式及形态变化。
1.2 染色体制备及分析
每组选第25代细胞2瓶，用常规方法制备染色体标本。选取100个分裂好的中期分裂相细胞，根据ISCN(1981)标准进行核型分析，包括数目变化及结构畸变，计算畸变染色体细胞率。采用χ2检验对结果进行统计学处理。
, 百拇医药
1.3 细胞周期不同时相的检测
1.3.1 单细胞悬液制备及固定 选第25代生长旺盛的细胞，用0.25%胰酶消化后，用PBS(pH6.8)最后制成每管细胞数为2×106/ml的单细胞悬液，每组5个平行样。将细胞通过400目尼龙网注入70%冷乙醇中，4℃冰箱中固定18小时后离心洗细胞，用200μl PBS悬浮细胞待测定。
1.3.2 细胞DNA和RNA的测定 加入与细胞悬液等体积的0.1mg/ml的RNA酶，37℃消化30分钟。离心洗涤2次，再于200μl细胞悬液中加入等体积碘化丙啶荧光染液(0.05mg/ml，含0.03% Triton-X100)，4℃染色30分钟。用美国B-D公司的FACScan流式细胞仪测定。采用方差分析、q检验对结果进行统计学处理。
1.4 细胞转化(3H-TdR掺入)实验
, 百拇医药
将第25代已达70%～80%融合的各组细胞，用0.25%胰酶消化后，细胞数按1.5×105/孔接种于24孔板内(每组设3个平行样)，每孔加入1ml含15%胎牛血清的新鲜DMEM培养液，培养24小时后，更换培养液，同时每孔加入37kBq(1μ Ci)的3H-TdR，置37℃培养液中培养3小时后，置冰浴中终止掺入反应，弃去培养液，用0.25%胰酶-0.02%乙二胺四乙酸二钠消化后，用抽滤器将细胞收集于微孔滤膜上，依次用冷生理盐水，5%三氯醋酸，无水乙醇洗涤，收集滤膜于室温晾干后放入闪烁液中(内含0.8%PPO和0.06%POPOP的二甲苯液)，避光放置2小时以上，用LKB-1214型液体闪烁器测量cpm值，放射性标记物3H-TdR由中科院原子能研究所提供。实验重复一次。资料进行方差分析、q检验统计学处理。
2 实验结果
2.1 氯化镉导致HELF的形态学改变
, 百拇医药
阴性对照组细胞生长规整，成束状排列，具有明显方向性，无重叠生长现象(图1)。光镜下实验组单个细胞形态并未见到改变，但细胞群体生长方式发生变化，第1次氯化镉处理后传2代，Ⅲ组细胞发生生长杂乱倾向，Ⅰ、Ⅱ组细胞于染镉4代后才出现此现象。经第2次处理后，各组细胞生长紊乱(图2)，失去方向性，有些区域的细胞相互交叉重叠，形成明显转化灶(图3)，转化灶中央交叉堆集浓染的细胞核；周围可见细胞核的交叉；转化灶边缘可见细胞稀疏部位。经第3次处理后，各组细胞转化灶数均明显增多，阳性对照组形态变化过程基本同Ⅱ组。
图1 阴性对照组细胞形态
(10×20)
, 百拇医药
图2 实验组第2次处理后细胞
形态(10×20)
图3 实验组第2次处理后形成
转化灶(10×20)
2.2 氯化镉对HELF染色体的影响
实验组细胞染色体核型分析，在不同程度上表现出非整倍体的特征，核型为46条染色体的细胞约占27%～45%，其余细胞染色体数波动在30或90条左右，并存在染色体结构畸变：断片、双着丝粒体。染色体数目畸变细胞率和染色体结构畸变细胞率都随氯化镉浓度的增加而增大，分别为55%、58%、73%和9%、11%、12%。阴性对照组染色体为46条的占92%，保持正常二倍体核型，结果表明：实验组染色体数目异常细胞百分率明显高于阴性对照组(P<0.005)，实验组染色体结构畸变细胞百分率也高于阴性对照组(ⅠP<0.01，Ⅱ、Ⅲ P<0.05)。
, 百拇医药
2.3 氯化镉对细胞周期时相的影响
如表1所示，处于G1期的细胞实验组明显低于阴性对照组(P<0.01)，且呈剂量-效应关系。而处于S期的细胞实验组明显高于阴性对照组(P<0.01)。
表1 各组处于Go/G1和S期细胞比例的比较(
±s,n=5)组别
实验处理
G0/G1期
(%)
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S期
(%)
阴性对照组
双蒸水
76.58±9.48
10.00±2.22
阳性对照组
MNNG
51.00±6.83
32.00±6.14
实验Ⅰ组
CdCl2 0.004μmol/L
, 百拇医药
68.42±6.94
19.90±2.84
实验Ⅱ组
CdCl2 0.02μmol/L
60.60±3.80
22.60±2.83
实验Ⅲ组
CdCl2 0.04μmol/L
16.70±5.55
80.40±8.93
2.4 氯化镉对3H-TdR掺入的影响
, http://www.100md.com
结果见表2，实验组3H-TdR掺入量(cpm)明显高于阴性对照组(P<0.01)，分别为阴性对照组的2.4、3.1、3.8倍。
表2 各组3H-TdR掺入量的比较(
±s,n=3)组别
实验处理
3H-TdR掺入量
(cpm)
阴性对照组
双蒸水
, 百拇医药
1344±278
阳性对照组
MNNG
2123±272
实验Ⅰ组
CdCl2 0.004μmol/L
3258±356
实验Ⅱ组
CdCl2 0.02μmol/L
3833±649
实验Ⅲ组
, 百拇医药 CdCl2 0.04μmol/L
5014±473
3 讨论
由于人体细胞癌变是多因素、多阶段、多途径的过程，因而无论用何种致癌因素处理人体细胞，经1次处理是很难发生恶性转化的[1，2]。我们实验中所采用的人胚肺成纤维细胞与成人细胞相比是处在转化过程的起点，经3次处理才发生恶性转化，表明氯化镉诱发人胚肺成纤维细胞恶性转化也是一个多阶段过程，且其转化程度与处理次数成正比。
本研究发现氯化镉的致突变作用，是作为一种染色体断裂剂。染色体断裂后就有可能导致染色体DNA的重排和丢失，使细胞基因组中抗癌基因失活而原癌基因也有可能被激活成有活性的癌基因[3]。此外，结果发现氯化镉还可使S期细胞比例增多，且DNA大量合成，在细胞恶性转化过程中可能起着一定作用。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金(No.39570603)
作者简介：李永安，男，硕士，副教授
参考文献
1，Namba M, Nishitani K, Hyodoh F. Neoplastic transformation of human diploid fibroblasts(KWSt-6) by treatment with Co-60 gamma rays. Int J Cancer, 1985,35:275—280
2，Rhim JS. Neoplastic transformation of primary human epidermal krratinocytes by the combined action of a DNA tumor virus and chemical carcinogens. Proc AACR, 1985,26:128—137
3，Newcomb WE, Steinberg JJ, Pelicer A. Ras oncogene and phenotypic staging in N-methylnitrosourea and γ-irradition induced thymic rymphomas in C57BL/6J. Cancer Res, 1988,48:5514—5521
(1999-04-28收稿), 百拇医药