饮水中有机致突物对小鼠体细胞遗传损伤的分子机制研究
作者：袁晶 戴文涛 李晓燕 陈学敏
单位：袁晶(同济医科大学公共卫生学院，武汉 430030)；戴文涛(同济医科大学公共卫生学院，武汉 430030)；李晓燕(同济医科大学公共卫生学院，武汉 430030)；陈学敏(同济医科大学公共卫生学院，武汉 430030)
关键词：小鼠；饮用水；有机致突物
卫生研究000109 摘要：通过居家饮水中提取的有机浓缩物亚急性染毒小鼠后，在动物肝、肾、肠组织观察到显微病理及超微病理学变化；各实验组小鼠胸骨骨髓嗜多染红细胞微核率高于阴性对照组。用PCR-SSCP方法可检出高剂量组肝、肾、肠组织DNA p53基因点突变，尤以第7外显子突变频率较高。提示用分子生物学技术研究饮水有机致突物在实验小鼠体内遗传毒性机制的可行性。
中图分类号：R123.6 Q754 R994.6 文献标识码：A
, 百拇医药
文章编号：1000-8020(2000)01-0024-04
Study on the molecular mechanism of genetic damages in body cells in mice treated with organic mutants in drinking water
Yuan Jing, Dai Wentao, Li Xiaoyan, Chen Xuemin
(School of Public Health,Tongji Medical University, Wuhan 430030,China)
Abstract：The genetic toxicity of some volatile compounds of chlorinated by-products have been determined in animal studies. But little is known at present about the genetic toxicity of nonvolatile matter in drinking water in vivo assay.In a sub-acut experiment, the mice were exposed to the organic compounds extracted from in-home tap water. The pathologic changes in the liver and kidney tissues were observed under microscope and electron microscope. The frequencies of micronuclei in polychromatic erythrocytes in mice chest bone marrow in the three treated groups were tested. The point mutants in p53 gene of liver, kidney and colon tissues in the high dosage group were examined by PCR-SSCP. Especially, the frequencies of mutations in exon 7 of p53 gene in those mice were higher than those in exon 5 of p53 gene. It showed that the study on the molecular genetic toxicity of organic mutants in vivo assay was possible
, 百拇医药
Key words：mouse， drinking water， organic mutant
饮水中非挥发性有机物比挥发性有机物组分的致突性更大已在国内外实验研究中得到证实。近年相关学科研究结果提示：体细胞突变等细胞异常增殖分化过程可导致癌症的发生；人类肺癌、结肠癌、乳腺癌等常见恶性肿瘤病人体细胞中多可检出控制DNA损伤应答反应的p53基因的突变[1]。本研究探索了饮水有机致突物对小鼠的分子遗传毒性。
1 材料与方法
1.1 微核试验
1.1.1 实验动物的选择分组 选用同济医科大学实验动物中心提供的健康昆明种小鼠48只，体重18～25g，随机分为6组，分别为自由饮水空白对照组、二甲基亚砜阴性对照组、环磷酰胺阳性对照组及3个实验组。雌雄各半，分笼喂养。
, 百拇医药
1.1.2 染毒剂量与观察指标 取D湖水为源水的末梢管网自来水，水样浓缩方法参照文献[2]，并经SOS(SOS chromest)试验证实为阳性。阴性对照组每只小鼠二甲基亚砜灌胃0.1ml/d；阳性对照组小鼠环磷酰胺染毒剂量按60mg/kgBW计；3个实验组小鼠以亚急性给药方式用饮水浓缩提取物灌胃，用量相当于正常成人日饮水量(按20g小鼠日饮水量为1ml)的1000倍、200倍、40倍。每日记录动物体重变化。于实验第5日断头处死小鼠，检测各小鼠血清谷草转氨酶(GOT)、血清谷丙转氨酶(GPT)、血清碱性磷酸酶(AKP)3项生化指标。取心、肝、肾、膀胱等器官，称重实体器官及计算其脏器系数[脏器重量(g)/鼠体重(g)]。各器官组织块分别在常规甲醛及2.5%戊二醛-锇酸固定液中固定；用于显微病理及超微病理分析。同时取各小鼠胸骨髓直接涂片，常规染色，在油镜下记录每只小鼠的1000个嗜多染红细胞(polychromatic erythrocytes, PCE)含微核的细胞数。
1.2 p53基因点突变检测
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1.2.1 组织DNA提取 将保存的小鼠石蜡包埋组织切成5～8μm切片15张，置1.5ml Ep管中，用二甲苯脱蜡2次。依次用浓度为100%、90%、75%、25%乙醇梯度水化。加入1×SSC(终浓度：15mmol/L柠檬酸钠，150mmol/L NaCl,pH7.0)500μl，室温下放置30min，5000r/min离心数秒，弃上清。再加700μl消化液(终浓度：1%SDS，200μg/ml蛋白酶K，150mmol/L的NaCl,5mmol/L柠檬酸钠)，37℃水浴孵育5天，用酚-氯法和饱和盐提取法分离蜡块DNA。用50μlTE(终浓度：10mol/L的Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0)溶解DNA，经UV-3000(Shimdzn公司)紫外可见分光光度计检测DNA的浓度与纯度。然后计算每个样本DNA提取量。
1.2.2 聚合酶链反应 检测p53基因第5外显子及第7外显子：(1)第7外显子PCR体系：以组织蜡块DNA为模板，双蒸水30.5μl，10×Tag DNA聚合酶缓冲液5μl，25mmol/L的MgCl23μl，10mmol/L dNTPs 1μl,10μmol/L上游引物(5'GCC GGC TCT GAG TAT ACC ACC3')及下游引物(5'CTG GAG TCT TCC AGT GTC ATG3')各2μl。先94℃加热2min，再加5U/μl的Tag DNA聚合酶0.5μl。94℃变性45s，58℃退火50s，72℃引物延伸45s，循环40次。末次循环后，72℃再延伸10min，4℃保存30s。(2)第5外显子PCR扩增体系：上游引物(5′ACA CCT GAT CGT TAC TCG GC3′)及下游引物(5′GAG GGC TTA CCA TCA CCA TC3′)与第7外显子不同。仅50℃退火50s及72℃延伸1min 2步有调整，所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。Tag DNA聚合酶及其缓冲液系promega产品，PCR扩增仪(型号：Hema 8000C)为珠海黑马医学仪器有限公司产品。DNA分子量参照物(pUC 19/MspI)是Sangon产品。
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1.2.3 SSCP分析 取4μl PCR产物，加入8μl 10倍变性缓冲液(终浓度：0.5mol/L NaOH,10mmol/L EDTA,pH8.0)及4μl 95℃去离子甲酰胺，置95℃水浴10min；立即入冰水骤冷，快速上样于预电泳聚丙烯酰胺凝胶(40%丙烯酰胺∶N，N-亚甲叉双丙烯酰胺=19∶1；5%甘油)，其用于第5、7外显子的凝胶浓度分别为8%及12%。电泳缓冲液为1×TBE，160V，室温下电泳4.5h，于10%乙醇和0.5%冰蜡酸中固定该凝胶，用双蒸水漂洗3次。然后用1%硝酸银染色10min，三蒸水迅速漂洗数次，将凝胶置显色液(终浓度：15g/L的NaCl，4.5ml/L甲醇)中直到出现肉眼可见的清晰DNA条带。最后用7.5g/L NaHCO3终止显色反应。
2 结果
2.1 动物一般情况
实验最初2天，染毒小鼠精神不振，活动次数减少。实验期间高剂量组、低剂量组、阴性对照组分别有1、1、2只雄性小鼠死亡。及时解剖肉眼观察未见异常。
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2.2 体重变化与脏器系数
除阴性对照组小鼠实验期限与其体重变化有关外，(F=3.1783，P<0.05)其它各组小鼠体重变化与染毒时间无关。
2.3 生化指标
各组动物GOT、GPT、AKP测定结果见表1。
表1 各组小鼠血清生化指标变化水平
IU/L 组别
n
GPT
GOT
AKP
范围
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中位数
均数
范围
中位数
均数
范围
中位数
均数
空白对照组
8
121～39
70.5
72.5
, 百拇医药
317～157
238.0
238.0
790～163
286.0
371.6
阴性对照组
6
87～52
66.5
68.0
304～214
259.0
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261.5
523～239
416.5
368.0
阳性对照组
8
127～46
53.0
63.4
269～188
243.0
239.4
845～150
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340.5
379.0
低剂量组
8
104～37
59.0
60.6
381～184
284.0
287.6
1444～204
412.5
589.8
, 百拇医药
中剂量组
7
75～36
61.0
57.0
240～119
210.0
200.7
597～66
329.0
340.1
高剂量组
7
, 百拇医药
78～53
67.0
66.7
414～206
238.0
272.4
640～179
386.0
388.1
用秩和检验法(Kruskal and Willis法)进行统计学检验，各组间差异无显著性。
2.4 病理组织学检查
各组小鼠心、肾、胃、膀胱组织在普通光学显微镜下未见异常。阴性对照组小鼠肝组织也未见异常。但3个实验组小鼠肝组织可见点状坏死，核分裂象存在；空白对照组小鼠肝组织偶见点状坏死。各组小鼠肠上皮细胞病理学变化表现为固有膜存在程度不同的炎性细胞浸润，并伴有淋巴细胞、浆细胞浸润，核分裂象可见。
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高剂量组小鼠肾近端小管上皮细胞空泡增多，微绒毛不整齐，管腔内有脱落细胞。远端小管上皮细胞肿胀，管内有脱落细胞(图1)。
高剂量组肝细胞肿胀、核增大，染色体分布不均，粗面内面网明显减少，线粒体基质密度增高(图2)。低剂量组小鼠肝细胞核形不规则，染色分布不均，粗面内质网明显减少，脂滴增生，线粒体肿胀、增生，窦面微绒毛减少、萎缩，窦面充满枯否氏细胞(图3)。
图1 高剂量组小鼠肾组织超微病理改变 (×3400)
图2 高剂量组小鼠肝组织超微病理改变 (×3400)
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图3 低剂量组小鼠肝组织超微病理改变 (×3400)
2.5 微核率
由表2可见，2种不同统计方法所得结果一致。即除空白对照组外，其它3个实验组小鼠胸骨骨髓PCE微核率与阴性对照组差别均有极显著性(P<0.01)。
表2 各组小鼠胸骨骨髓PCE微核率分析 分组
n
微核率(%)
空白对照组
8
0.9175±0.0661
阴性对照组
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6
1.1683±0.0864
低剂量组
8
4.6250±0.1186(1)
中剂量组
7
6.1429±0.0811(1)
高剂量组
7
10.5857±0.1796(1)
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注：(1)经t检验和秩和检验证明与阴性对照组相比，P<0.01 2.6 p53基因点突变检测
经SSCP(single strand conformation polymorphism)凝胶电泳分析含p53基因第5、7外显子发现：所检样本中有14个具有异常泳动的单链DNA条带(14/25)；其中，高剂量组10例样品中有9例突变：即同时有第5、7外显子突变的及仅第5外显子突变的各1例，仅第7外显子突变的有7例。而空白对照组11例中，仅在第5、第7外显子突变的各2和3例。
代表性SSCP分析结果见图4。
第1～5、10条是空白对照组样品，第6～9是高剂量组样品。第1、7、10条箭头所指处为泳动变位。即第1条缺失一条带，第7、10条各多出一条带
, 百拇医药
图4 小鼠p53基因第5外显子PCR-SSCP分析
3 讨论
3.1 体重变化及其脏器系数
本研究除阴性对照组小鼠实验期间其体重受影响外，其它组均未见异常。二甲基亚砜已作为饮水有机浓缩物溶剂多年，并未在体外Ames试验、SOS试验中发现其毒性，但我们的研究结果显示：其对整体动物有一定毒性作用，实验组小鼠肠上皮细胞存在固有膜炎性细胞浸润等病理变化，提示该有机试剂在今后有关研究中应慎用。
3.2 小鼠血清
本研究结果尚不足以判断GOT、GPT、AKP这些肝敏感酶作为饮水有机致突物体内损害评价的特异指标。
3.3 病理检查
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肝组织细胞坏死、肠上皮细胞固有膜炎性细胞浸润等显微病理组织学变化证实饮水有机致突物在此实验条件下可致小鼠某些脏器的组织损害。线粒体是细胞内最敏感的细胞器之一。超微病理检查发现细胞内亚细胞器线粒体、粗面内质网已有病理变化，说明细胞膜有可能受到损伤并致钠泵作用失调，水分大量进入细胞影响了亚细胞功能。枯否氏细胞是肝内的巨噬细胞，它维持着肝内环境稳定，有报道枯否氏细胞具有较强的吞噬和杀伤肿瘤细胞的能力，对肝细胞的癌变过程有一定抑制作用[3]。我们在扫描电镜下可见肝窦内充满了枯否氏细胞，这可能是机体对外来污染物的早期反应指征。
有学者认为小鼠自发肿瘤率高于大鼠，并对小鼠的肝脏化学致癌动物模型持保留态度[4]。实验中我们在空白对照组小鼠肝组织、肠组织均见到病理改变，是该种属自发病变还是在出生早期已接触污染饮水所致，本实验尚不能解答。
3.4 骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验
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本实验结果证实：3个实验组小鼠胸骨骨髓PCE微核率与阴性对照组比较差异有极显著性。由此说明，饮水浓缩有机致突物(SOS证实为阳性)对整体染毒动物有遗传毒性。
国内学者最近报道小鼠胸骨骨髓PCE微核自然发生率频数分布属正偏态[5]。故将实验结果用传统建议的t检验法与秩和检验法分析，其结果一致。但此类资料究竟应选用何种统计分析法为宜，值得有关同行研究商榷。
3.5 p53基因变化
近年临床研究显示：人类乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌等多种常见肿瘤病例中常可检出含有p53基因的染色体短臂特异位点的丢失，且残留p53等位基因中发生点突变[6]。已知人与小鼠p53基因组结构所有内含子和外显子之间的连接位点均完全一致，故选用小鼠为饮水污染物分子毒性的研究对象是适宜的。前述实验结果已说明饮水有机致突物可引起小鼠p53基因第5、7外显子突变；尤以第7外显子发生突变率高些。近年有学者提出人类生存环境中存在着非遗传毒性致癌物[7]，我们从空白对照组小鼠肝组织检出p53基因第7外显子突变，是否此饮水中某些种类化合物系非遗传毒性的致突原尚待深入研究。
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综上所述，本研究采用饮水有机致突物亚急性染毒小鼠，在染色体水平证实了其遗传损伤作用，并用PCR-SSCP法在分子水平揭示了其对p53基因突变位点第5、7外显子的影响。有必要降低染毒剂量后开展p53基因各突变热点的较深入研究工作。
(致谢：本实验所用浓缩水样由陈秀娜教授馈赠，特致真诚谢意。)
基金项目：国家教委回国人员起动基金资助项目
作者简介：袁晶，女，副教授
参考文献
1，王梅，葛明建.肿瘤细胞动力学与p53.国外医学临床生物化学与检验学分册，1997，18(6)：253—258
2，李晓燕，高蔚，陈秀娜.饮用水中非挥发性有机物的遗传毒性及脂质过氧化作用.中国公共卫生，1999，14(1)：8—10
, http://www.100md.com
3，朱海轸，阮幼冰，武忠弼，等.kupffer细胞在实验性肝癌形成中的作用.Chin Pathol,1998,27(2):102
4，江泉观.基础毒理学.北京：化学工业出版社，1991，139
5，郑建明，宝建中，余宏宇，等.p53基因第7外显子突变与乳腺癌的关系.临床与实验病理学杂志，1997，13(1)：43—44
6，Elmar G. The micronucleus test:its value as a predictor of rodent carcinogens versus its value in risk assessment. Mut Res,1996,352：189—190
7，高珊，姚小曼.昆明种小鼠微核和染色体畸变试验比值研究.卫生毒理学杂志，1997，11(3)：90
(1999-05-05收稿), 百拇医药
单位：袁晶(同济医科大学公共卫生学院，武汉 430030)；戴文涛(同济医科大学公共卫生学院，武汉 430030)；李晓燕(同济医科大学公共卫生学院，武汉 430030)；陈学敏(同济医科大学公共卫生学院，武汉 430030)
关键词：小鼠；饮用水；有机致突物
卫生研究000109 摘要：通过居家饮水中提取的有机浓缩物亚急性染毒小鼠后，在动物肝、肾、肠组织观察到显微病理及超微病理学变化；各实验组小鼠胸骨骨髓嗜多染红细胞微核率高于阴性对照组。用PCR-SSCP方法可检出高剂量组肝、肾、肠组织DNA p53基因点突变，尤以第7外显子突变频率较高。提示用分子生物学技术研究饮水有机致突物在实验小鼠体内遗传毒性机制的可行性。
中图分类号：R123.6 Q754 R994.6 文献标识码：A
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文章编号：1000-8020(2000)01-0024-04
Study on the molecular mechanism of genetic damages in body cells in mice treated with organic mutants in drinking water
Yuan Jing, Dai Wentao, Li Xiaoyan, Chen Xuemin
(School of Public Health,Tongji Medical University, Wuhan 430030,China)
Abstract：The genetic toxicity of some volatile compounds of chlorinated by-products have been determined in animal studies. But little is known at present about the genetic toxicity of nonvolatile matter in drinking water in vivo assay.In a sub-acut experiment, the mice were exposed to the organic compounds extracted from in-home tap water. The pathologic changes in the liver and kidney tissues were observed under microscope and electron microscope. The frequencies of micronuclei in polychromatic erythrocytes in mice chest bone marrow in the three treated groups were tested. The point mutants in p53 gene of liver, kidney and colon tissues in the high dosage group were examined by PCR-SSCP. Especially, the frequencies of mutations in exon 7 of p53 gene in those mice were higher than those in exon 5 of p53 gene. It showed that the study on the molecular genetic toxicity of organic mutants in vivo assay was possible
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Key words：mouse， drinking water， organic mutant
饮水中非挥发性有机物比挥发性有机物组分的致突性更大已在国内外实验研究中得到证实。近年相关学科研究结果提示：体细胞突变等细胞异常增殖分化过程可导致癌症的发生；人类肺癌、结肠癌、乳腺癌等常见恶性肿瘤病人体细胞中多可检出控制DNA损伤应答反应的p53基因的突变[1]。本研究探索了饮水有机致突物对小鼠的分子遗传毒性。
1 材料与方法
1.1 微核试验
1.1.1 实验动物的选择分组 选用同济医科大学实验动物中心提供的健康昆明种小鼠48只，体重18～25g，随机分为6组，分别为自由饮水空白对照组、二甲基亚砜阴性对照组、环磷酰胺阳性对照组及3个实验组。雌雄各半，分笼喂养。
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1.1.2 染毒剂量与观察指标 取D湖水为源水的末梢管网自来水，水样浓缩方法参照文献[2]，并经SOS(SOS chromest)试验证实为阳性。阴性对照组每只小鼠二甲基亚砜灌胃0.1ml/d；阳性对照组小鼠环磷酰胺染毒剂量按60mg/kgBW计；3个实验组小鼠以亚急性给药方式用饮水浓缩提取物灌胃，用量相当于正常成人日饮水量(按20g小鼠日饮水量为1ml)的1000倍、200倍、40倍。每日记录动物体重变化。于实验第5日断头处死小鼠，检测各小鼠血清谷草转氨酶(GOT)、血清谷丙转氨酶(GPT)、血清碱性磷酸酶(AKP)3项生化指标。取心、肝、肾、膀胱等器官，称重实体器官及计算其脏器系数[脏器重量(g)/鼠体重(g)]。各器官组织块分别在常规甲醛及2.5%戊二醛-锇酸固定液中固定；用于显微病理及超微病理分析。同时取各小鼠胸骨髓直接涂片，常规染色，在油镜下记录每只小鼠的1000个嗜多染红细胞(polychromatic erythrocytes, PCE)含微核的细胞数。
1.2 p53基因点突变检测
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1.2.1 组织DNA提取 将保存的小鼠石蜡包埋组织切成5～8μm切片15张，置1.5ml Ep管中，用二甲苯脱蜡2次。依次用浓度为100%、90%、75%、25%乙醇梯度水化。加入1×SSC(终浓度：15mmol/L柠檬酸钠，150mmol/L NaCl,pH7.0)500μl，室温下放置30min，5000r/min离心数秒，弃上清。再加700μl消化液(终浓度：1%SDS，200μg/ml蛋白酶K，150mmol/L的NaCl,5mmol/L柠檬酸钠)，37℃水浴孵育5天，用酚-氯法和饱和盐提取法分离蜡块DNA。用50μlTE(终浓度：10mol/L的Tris-HCl,1mmol/L EDTA,pH8.0)溶解DNA，经UV-3000(Shimdzn公司)紫外可见分光光度计检测DNA的浓度与纯度。然后计算每个样本DNA提取量。
1.2.2 聚合酶链反应 检测p53基因第5外显子及第7外显子：(1)第7外显子PCR体系：以组织蜡块DNA为模板，双蒸水30.5μl，10×Tag DNA聚合酶缓冲液5μl，25mmol/L的MgCl23μl，10mmol/L dNTPs 1μl,10μmol/L上游引物(5'GCC GGC TCT GAG TAT ACC ACC3')及下游引物(5'CTG GAG TCT TCC AGT GTC ATG3')各2μl。先94℃加热2min，再加5U/μl的Tag DNA聚合酶0.5μl。94℃变性45s，58℃退火50s，72℃引物延伸45s，循环40次。末次循环后，72℃再延伸10min，4℃保存30s。(2)第5外显子PCR扩增体系：上游引物(5′ACA CCT GAT CGT TAC TCG GC3′)及下游引物(5′GAG GGC TTA CCA TCA CCA TC3′)与第7外显子不同。仅50℃退火50s及72℃延伸1min 2步有调整，所用引物由上海生工生物工程有限公司合成。Tag DNA聚合酶及其缓冲液系promega产品，PCR扩增仪(型号：Hema 8000C)为珠海黑马医学仪器有限公司产品。DNA分子量参照物(pUC 19/MspI)是Sangon产品。
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1.2.3 SSCP分析 取4μl PCR产物，加入8μl 10倍变性缓冲液(终浓度：0.5mol/L NaOH,10mmol/L EDTA,pH8.0)及4μl 95℃去离子甲酰胺，置95℃水浴10min；立即入冰水骤冷，快速上样于预电泳聚丙烯酰胺凝胶(40%丙烯酰胺∶N，N-亚甲叉双丙烯酰胺=19∶1；5%甘油)，其用于第5、7外显子的凝胶浓度分别为8%及12%。电泳缓冲液为1×TBE，160V，室温下电泳4.5h，于10%乙醇和0.5%冰蜡酸中固定该凝胶，用双蒸水漂洗3次。然后用1%硝酸银染色10min，三蒸水迅速漂洗数次，将凝胶置显色液(终浓度：15g/L的NaCl，4.5ml/L甲醇)中直到出现肉眼可见的清晰DNA条带。最后用7.5g/L NaHCO3终止显色反应。
2 结果
2.1 动物一般情况
实验最初2天，染毒小鼠精神不振，活动次数减少。实验期间高剂量组、低剂量组、阴性对照组分别有1、1、2只雄性小鼠死亡。及时解剖肉眼观察未见异常。
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2.2 体重变化与脏器系数
除阴性对照组小鼠实验期限与其体重变化有关外，(F=3.1783，P<0.05)其它各组小鼠体重变化与染毒时间无关。
2.3 生化指标
各组动物GOT、GPT、AKP测定结果见表1。
表1 各组小鼠血清生化指标变化水平
IU/L 组别
n
GPT
GOT
AKP
范围
, 百拇医药
中位数
均数
范围
中位数
均数
范围
中位数
均数
空白对照组
8
121～39
70.5
72.5
, 百拇医药
317～157
238.0
238.0
790～163
286.0
371.6
阴性对照组
6
87～52
66.5
68.0
304～214
259.0
, http://www.100md.com
261.5
523～239
416.5
368.0
阳性对照组
8
127～46
53.0
63.4
269～188
243.0
239.4
845～150
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340.5
379.0
低剂量组
8
104～37
59.0
60.6
381～184
284.0
287.6
1444～204
412.5
589.8
, 百拇医药
中剂量组
7
75～36
61.0
57.0
240～119
210.0
200.7
597～66
329.0
340.1
高剂量组
7
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78～53
67.0
66.7
414～206
238.0
272.4
640～179
386.0
388.1
用秩和检验法(Kruskal and Willis法)进行统计学检验，各组间差异无显著性。
2.4 病理组织学检查
各组小鼠心、肾、胃、膀胱组织在普通光学显微镜下未见异常。阴性对照组小鼠肝组织也未见异常。但3个实验组小鼠肝组织可见点状坏死，核分裂象存在；空白对照组小鼠肝组织偶见点状坏死。各组小鼠肠上皮细胞病理学变化表现为固有膜存在程度不同的炎性细胞浸润，并伴有淋巴细胞、浆细胞浸润，核分裂象可见。
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高剂量组小鼠肾近端小管上皮细胞空泡增多，微绒毛不整齐，管腔内有脱落细胞。远端小管上皮细胞肿胀，管内有脱落细胞(图1)。
高剂量组肝细胞肿胀、核增大，染色体分布不均，粗面内面网明显减少，线粒体基质密度增高(图2)。低剂量组小鼠肝细胞核形不规则，染色分布不均，粗面内质网明显减少，脂滴增生，线粒体肿胀、增生，窦面微绒毛减少、萎缩，窦面充满枯否氏细胞(图3)。
图1 高剂量组小鼠肾组织超微病理改变 (×3400)
图2 高剂量组小鼠肝组织超微病理改变 (×3400)
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图3 低剂量组小鼠肝组织超微病理改变 (×3400)
2.5 微核率
由表2可见，2种不同统计方法所得结果一致。即除空白对照组外，其它3个实验组小鼠胸骨骨髓PCE微核率与阴性对照组差别均有极显著性(P<0.01)。
表2 各组小鼠胸骨骨髓PCE微核率分析 分组
n
微核率(%)
空白对照组
8
0.9175±0.0661
阴性对照组
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6
1.1683±0.0864
低剂量组
8
4.6250±0.1186(1)
中剂量组
7
6.1429±0.0811(1)
高剂量组
7
10.5857±0.1796(1)
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注：(1)经t检验和秩和检验证明与阴性对照组相比，P<0.01 2.6 p53基因点突变检测
经SSCP(single strand conformation polymorphism)凝胶电泳分析含p53基因第5、7外显子发现：所检样本中有14个具有异常泳动的单链DNA条带(14/25)；其中，高剂量组10例样品中有9例突变：即同时有第5、7外显子突变的及仅第5外显子突变的各1例，仅第7外显子突变的有7例。而空白对照组11例中，仅在第5、第7外显子突变的各2和3例。
代表性SSCP分析结果见图4。
第1～5、10条是空白对照组样品，第6～9是高剂量组样品。第1、7、10条箭头所指处为泳动变位。即第1条缺失一条带，第7、10条各多出一条带
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图4 小鼠p53基因第5外显子PCR-SSCP分析
3 讨论
3.1 体重变化及其脏器系数
本研究除阴性对照组小鼠实验期间其体重受影响外，其它组均未见异常。二甲基亚砜已作为饮水有机浓缩物溶剂多年，并未在体外Ames试验、SOS试验中发现其毒性，但我们的研究结果显示：其对整体动物有一定毒性作用，实验组小鼠肠上皮细胞存在固有膜炎性细胞浸润等病理变化，提示该有机试剂在今后有关研究中应慎用。
3.2 小鼠血清
本研究结果尚不足以判断GOT、GPT、AKP这些肝敏感酶作为饮水有机致突物体内损害评价的特异指标。
3.3 病理检查
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肝组织细胞坏死、肠上皮细胞固有膜炎性细胞浸润等显微病理组织学变化证实饮水有机致突物在此实验条件下可致小鼠某些脏器的组织损害。线粒体是细胞内最敏感的细胞器之一。超微病理检查发现细胞内亚细胞器线粒体、粗面内质网已有病理变化，说明细胞膜有可能受到损伤并致钠泵作用失调，水分大量进入细胞影响了亚细胞功能。枯否氏细胞是肝内的巨噬细胞，它维持着肝内环境稳定，有报道枯否氏细胞具有较强的吞噬和杀伤肿瘤细胞的能力，对肝细胞的癌变过程有一定抑制作用[3]。我们在扫描电镜下可见肝窦内充满了枯否氏细胞，这可能是机体对外来污染物的早期反应指征。
有学者认为小鼠自发肿瘤率高于大鼠，并对小鼠的肝脏化学致癌动物模型持保留态度[4]。实验中我们在空白对照组小鼠肝组织、肠组织均见到病理改变，是该种属自发病变还是在出生早期已接触污染饮水所致，本实验尚不能解答。
3.4 骨髓嗜多染红细胞(PCE)微核试验
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本实验结果证实：3个实验组小鼠胸骨骨髓PCE微核率与阴性对照组比较差异有极显著性。由此说明，饮水浓缩有机致突物(SOS证实为阳性)对整体染毒动物有遗传毒性。
国内学者最近报道小鼠胸骨骨髓PCE微核自然发生率频数分布属正偏态[5]。故将实验结果用传统建议的t检验法与秩和检验法分析，其结果一致。但此类资料究竟应选用何种统计分析法为宜，值得有关同行研究商榷。
3.5 p53基因变化
近年临床研究显示：人类乳腺癌、肺癌、结肠癌、肝癌等多种常见肿瘤病例中常可检出含有p53基因的染色体短臂特异位点的丢失，且残留p53等位基因中发生点突变[6]。已知人与小鼠p53基因组结构所有内含子和外显子之间的连接位点均完全一致，故选用小鼠为饮水污染物分子毒性的研究对象是适宜的。前述实验结果已说明饮水有机致突物可引起小鼠p53基因第5、7外显子突变；尤以第7外显子发生突变率高些。近年有学者提出人类生存环境中存在着非遗传毒性致癌物[7]，我们从空白对照组小鼠肝组织检出p53基因第7外显子突变，是否此饮水中某些种类化合物系非遗传毒性的致突原尚待深入研究。
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综上所述，本研究采用饮水有机致突物亚急性染毒小鼠，在染色体水平证实了其遗传损伤作用，并用PCR-SSCP法在分子水平揭示了其对p53基因突变位点第5、7外显子的影响。有必要降低染毒剂量后开展p53基因各突变热点的较深入研究工作。
(致谢：本实验所用浓缩水样由陈秀娜教授馈赠，特致真诚谢意。)
基金项目：国家教委回国人员起动基金资助项目
作者简介：袁晶，女，副教授
参考文献
1，王梅，葛明建.肿瘤细胞动力学与p53.国外医学临床生物化学与检验学分册，1997，18(6)：253—258
2，李晓燕，高蔚，陈秀娜.饮用水中非挥发性有机物的遗传毒性及脂质过氧化作用.中国公共卫生，1999，14(1)：8—10
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3，朱海轸，阮幼冰，武忠弼，等.kupffer细胞在实验性肝癌形成中的作用.Chin Pathol,1998,27(2):102
4，江泉观.基础毒理学.北京：化学工业出版社，1991，139
5，郑建明，宝建中，余宏宇，等.p53基因第7外显子突变与乳腺癌的关系.临床与实验病理学杂志，1997，13(1)：43—44
6，Elmar G. The micronucleus test:its value as a predictor of rodent carcinogens versus its value in risk assessment. Mut Res,1996,352：189—190
7，高珊，姚小曼.昆明种小鼠微核和染色体畸变试验比值研究.卫生毒理学杂志，1997，11(3)：90
(1999-05-05收稿), 百拇医药