维生素A对小鼠胚胎Hox3.5基因表达的影响
作者：刘恭平 朱清华
单位：同济医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，武汉 430030
关键词：维生素A缺乏；Hox3.5；基因表达；胚胎
卫生研究000312 摘要：为观察维生素A(VA)缺乏及再补充对小鼠胚胎HoxC4(3.5)基因表达的影响，将初断乳的60只昆明种雌鼠随机分为4组：正常对照组(N)饲含VA 4 000IU/kg饲料，其他3组(A、B、C组)在交配前饲缺乏VA饲料，B和C组分别在妊娠的第0和7天饲含VA 10 000IU/kg的饲料，A组饲料不变。30只雄鼠饲以普通饲料，在饲养的第16周按雌∶雄=2∶1合笼交配。在妊娠第12天脱颈椎处死雌鼠，立即剖腹取出胎鼠，置于液氮中速冻后于-70℃冰箱保存。用地高辛标记的探针，采用原位杂交方法探测小鼠胚胎HoxC4(3.5)基因mRNA含量。结果显示，A组mRNA的含量明显减少；B组mRNA含量与N组无差异；C组mRNA含量虽比A组增加，但仍低于N组。结果提示，VA可能通过调控Hox基因的表达来影响胚胎发育。
, http://www.100md.com
中图分类号：Q562 Q132.7 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)03-0164-02
Effects of vitamin A on Hox 3.5 gene
expression in mouse embryo
Liu Gongping， Zhu Qinghua
(Department of Nutrition and Food Hygiene，Tongji Medical University，Wuhan 430030，China)
Abstract:In order to investigate the effects of vitamin A(VA)deficiency and VA supplementation on Hox 3.5 gene expression in mouse embryo，60 Kunming weaning female mice were divided into four groups.The normal control group(N) was fed diet containing VA 4 000 IU/kg.The other 3 groups were fed VA deficient diet(VA 0 IU/kg diet)for 16 weeks and then make all mice mating with normal male mice.Group A was fed VA deficient diet all through the experiment.Group B and group C were fed diet supplemented with VA (VA 10 000IU/kg)from the day zero and from the 7th day after conception respectively.On the 12th day of gestation，6 pregnant mice in each group were killed and the embryos were taken immediately.In situ hybridization was used to determine the contents of mRNA of Hox 3.5 gene in mice embryos by digoxin-labeled cDNA probes.The results revealed that the contents of Hox 3.5 gene mRNA in the embryos of group A and C decreased significantly compared from group N and B，and that in group B had no difference from group N.The mRNA contents of group C were higher compared with group A，but still was lower than that of group N.It was concluded that vitamin A might influence the development of embryos by regulating the expression of homeobox gene.
, 百拇医药
Key words:vitamin A deficiency， Hox 3.5， gene expression， embryo
维生素A(VA)是人体生长发育和维持机体生命活动所必不可少的微量营养素，它不仅在视觉、细胞分化方面具有明确的作用，而且对胚胎发育也是必需的[1]。先天性的VA严重缺乏可以使胚胎出现一系列的畸形，如眼、肺、心血管系统及泌尿生殖系统畸形等[2]。近年来研究发现VA与发育基因有一定关系[3]。本次研究就是通过对VA缺乏的孕鼠补充或不补充VA来观察其对Hox基因表达的影响。
1 材料及方法
1.1 动物饲养及分组
初断乳的清洁级昆明种雌鼠60只，雄鼠30只(武汉生物制品研究所动物中心提供)，全部用不锈钢鼠笼喂养。常规适应性喂养1周后，将雌鼠按体重随机分为正常对照组(N)、VA缺乏组(A)、妊娠第0天补充VA组(B)和妊娠第7天补充VA组(C)。VA缺乏饲料按AOAC配方修改而成，正常对照组及补充组饲料在缺乏VA饲料的基础上按各自需要添加VA。A、B、C 3组饲以VA缺乏饲料，每周观察VA缺乏症状。在第16周A、B、C 3组小鼠均出现VA缺乏症状时，按雌∶雄=2∶1合笼交配，第2天清晨查阴栓，查到阴栓者记为妊娠0天。交配后A组继续喂养VA缺乏饲料，B和C组分别在妊娠第0和7天饲以含VA 10 000IU/kg的饲料，雄鼠饲以普通饲料。试验期间小鼠自由饮水，自然光照，室温20～25℃，湿度55%～65%。在妊娠第12天时分别对孕鼠摘眼球留取血标本。然后脱颈椎处死，立刻剖腹取出胎鼠，所用器具必须高温处理或者用焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理，确保无RNA酶。每组各取孕12天的雌鼠6只，分别从每只孕鼠随机取出2只胎鼠，迅速置于液氮中冷冻，然后置于-70℃冰箱保存待测。
, 百拇医药
1.2 孕鼠血清VA水平测定
采用荧光法(F-3000型荧光分光光度计，日本日立公司制造)测定孕鼠血清VA浓度(见表)。
1.3 胎鼠HoxC4(3.5)基因mRNA的原位杂交法测定
1.3.1 探针的制备[4] (1)在Internet网上从基因库上检索到Hox3.5基因的DNA序列，分别在Hox3.5基因第1外显子设计2对引物，引物长度均为21个碱基；交Gibco Brl公司合成。(2)胎鼠总RNA的分离提取：随机取正常对照组的胎鼠1只，利用TRIzol Total RNA提取试剂盒(美国Gibco Brl公司产品)提取总RNA。(3)cDNA的合成：利用TitanTM One Tube RT-PCR System(德国Boehringer Mannheim公司产品)获得cDNA片段作为DNA探针，其长度为247bp。(4)探针的标记：按照地高辛DNA标记及检测试剂盒(Boehringer Mannheim公司产品)的方法，对制备的片段进行标记。
, 百拇医药
1.3.2 原位杂交 (1)病理切片的制作：将胎鼠从-70℃冰箱取出后置于-20℃的冰箱，在恒冷切片机上沿旁矢状切面切成5μm厚的切片(每只胎鼠切2张切片)，迅速置于室温下4%的多聚甲醛固定20min。PBS洗后逐级酒精脱水(50%～100%的酒精，5个梯度)。然后，-20℃冰箱保存备用。(2)分子杂交：用地高辛标记的探针与胎鼠切片进行原位杂交，探查mRNA，并用酶联免疫法显色(采用地高辛DNA标记及检测试剂盒)[5]。
1.3.3 杂交结果的定量分析 采用HPIAS-1000的高清晰度多媒体彩色图象分析系统，测定杂交点的阳性比率。结果用面积密度(area density，一个视野中阳性表达面积之和/视窗面积)和积分光密度(Int-L-Den)。
1.4 统计处理
各组数据用平均数±标准误表示，均进行t检验。
, 百拇医药
2 结果
实验末期A、B、C 3组均出现皮毛干枯、胡须脱落、反应淡漠、眼部出现脓性分泌物及少食、少动等VA缺乏症状。从附表可见，A、C 2组孕鼠血清VA水平明显低于N组(P<0.01)，B组与N组相比差异无显著性(P>0.05)，C组高于A组，差异有极显著性(P<0.01)。
由附表的面积密度和积分光密度2个指标可见，A、C 2组的Hox3.5基因的表达量明显低于N、B 2组(P<0.01或P<0.05)，N组与B组相比，差异无显著性(P>0.05)，C组高于A组(P<0.05)。
附表 孕鼠血清VA浓度及小鼠胚胎中Hox3.5
基因的表达(n=8，
±s) 组别
, 百拇医药
VA
(μmol/L)
面积密度
积分光密度
N
1.40±0.32
0.096 5±0.047 8
932.448 5±180.996 7
A
0.44±0.06(1，3)
0.047 0±0.007 6(1，2)
, 百拇医药
433.818 5±122.008 9(1，2)
B
1.56±0.29
0.116 3±0.099 5
985.326 5±176.201 3
C
1.03±0.12(1)
0.069 8±0.013 6(1)
685.195 4±206.984 9(1)
注：与N和B组相比(1)P<0.05 与C组相比，(2)P<0.05 (3)P<0.013 讨论
, 百拇医药
同源异性盒基因(Hox基因)属于发育基因，是一大类从时间和空间上对生物体的生长、发育进行协调和控制的调控基因。已经知道，结构基因通过表达特异性的蛋白质结构来建造有机体，而生物的发育则需要成千上万个结构基因按一个精确的时间和空间图谱来表达才能完成。研究发现，Hox基因在脊椎动物，尤其是哺乳动物胚胎发育过程中具有极其重要的作用[6]。它通过提供有序位置结构的分子系统，在胚胎的前-后轴模式的形成、肢体、脊椎及颅面部结构模式方面，具有重要的作用[7]。一旦其表达异常，就可能出现各种畸形。
有许多信号分子可以影响Hox基因的表达，视黄酸(RA)就是其中的一个(体内的RA来源于食物中的VA)[8]。据文献报道，在NT2/D1细胞系中Hox基因表达对RA具有共线性特性：在RA浓度为10-7mol/L时，仅染色体3′端的基因被激活；而在10-5mol/L时，5′端的基因才激活；无论RA是低浓度还是高浓度，Hox基因都是沿3′、5′的方向依次激活[8]。Marshall 发现，给予携带LacZ报告子基因的转基因小鼠RA，可以诱导Hox B1(Hox2.9)和Hox B2(Hox2.8)异常表达[7]。本次研究发现：(1)VA缺乏导致Hox3.5表达量明显下降，出现胚胎发育不良与畸形(结合本课题的动物致畸实验)；(2)妊娠第0天正处于受精卵的原核形成期，此时补充VA可使其从母体获得足够的VA，使Hox基因正常表达、胚胎正常发育。(3)妊娠第7天时胚胎正处于器官发生期，因缺乏VA，Hox基因表达量降低，此时补充VA虽然有一定的补偿作用，可以在一定程度上促进Hox基因的表达，但与正常组相比，仍有显著差异，表现为胚胎发育不良。
, http://www.100md.com
综上所述，VA作为一种自然成形剂，对胚胎的生长发育极其重要。它可能使Hox基因表达异常，从而使胚胎出现各种畸形及发育不良。所以在妊娠前补充足够的VA对胚胎的生长发育是十分重要的。但是RA是直接作用于Hox基因来调控它的转录，还是通过激活旁路途径来调控Hox基因的表达，还有待于进一步研究。
基金项目：国家“九五”攻关课题子题(No.96-904-06-06)
作者简介：刘恭平，男，硕士生
参考文献
1，Ekhard E，Ziegler LJ，Flier Jr.现代营养学.第7版.闻芝梅，陈君石译.北京：人民卫生出版社，1998，108
2，Morriss-Kay GM，Sokolova N.Embryonic development and pattern formation.FASEB J，1996，10:961
, http://www.100md.com
3，Robb K.Hox genes in vertebrate development.Cell，1994，78:191
4，金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指导.第2版.北京：科学出版社，1996，396
5，姜泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1997，128
6，薛志刚.同源异性盒基因和胚胎发育.武汉大学学报，1993，6：105
7，Heather M，Stefan N，Mai H，et al.Retinoic acid alters hindbrain Hox code and induces transformation of rhombomeres 2/3 into a 4/5 identity.Nature，1992，360(24/31):737
8，Antonio S，Dario A，Laura A，et al.Sequential activation of Hox2 homeobox genes by retinoic acid in human embryonal carcinoma cell.Nature，1990，346(23):763
(1999-11-16收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，武汉 430030
关键词：维生素A缺乏；Hox3.5；基因表达；胚胎
卫生研究000312 摘要：为观察维生素A(VA)缺乏及再补充对小鼠胚胎HoxC4(3.5)基因表达的影响，将初断乳的60只昆明种雌鼠随机分为4组：正常对照组(N)饲含VA 4 000IU/kg饲料，其他3组(A、B、C组)在交配前饲缺乏VA饲料，B和C组分别在妊娠的第0和7天饲含VA 10 000IU/kg的饲料，A组饲料不变。30只雄鼠饲以普通饲料，在饲养的第16周按雌∶雄=2∶1合笼交配。在妊娠第12天脱颈椎处死雌鼠，立即剖腹取出胎鼠，置于液氮中速冻后于-70℃冰箱保存。用地高辛标记的探针，采用原位杂交方法探测小鼠胚胎HoxC4(3.5)基因mRNA含量。结果显示，A组mRNA的含量明显减少；B组mRNA含量与N组无差异；C组mRNA含量虽比A组增加，但仍低于N组。结果提示，VA可能通过调控Hox基因的表达来影响胚胎发育。
, http://www.100md.com
中图分类号：Q562 Q132.7 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)03-0164-02
Effects of vitamin A on Hox 3.5 gene
expression in mouse embryo
Liu Gongping， Zhu Qinghua
(Department of Nutrition and Food Hygiene，Tongji Medical University，Wuhan 430030，China)
Abstract:In order to investigate the effects of vitamin A(VA)deficiency and VA supplementation on Hox 3.5 gene expression in mouse embryo，60 Kunming weaning female mice were divided into four groups.The normal control group(N) was fed diet containing VA 4 000 IU/kg.The other 3 groups were fed VA deficient diet(VA 0 IU/kg diet)for 16 weeks and then make all mice mating with normal male mice.Group A was fed VA deficient diet all through the experiment.Group B and group C were fed diet supplemented with VA (VA 10 000IU/kg)from the day zero and from the 7th day after conception respectively.On the 12th day of gestation，6 pregnant mice in each group were killed and the embryos were taken immediately.In situ hybridization was used to determine the contents of mRNA of Hox 3.5 gene in mice embryos by digoxin-labeled cDNA probes.The results revealed that the contents of Hox 3.5 gene mRNA in the embryos of group A and C decreased significantly compared from group N and B，and that in group B had no difference from group N.The mRNA contents of group C were higher compared with group A，but still was lower than that of group N.It was concluded that vitamin A might influence the development of embryos by regulating the expression of homeobox gene.
, 百拇医药
Key words:vitamin A deficiency， Hox 3.5， gene expression， embryo
维生素A(VA)是人体生长发育和维持机体生命活动所必不可少的微量营养素，它不仅在视觉、细胞分化方面具有明确的作用，而且对胚胎发育也是必需的[1]。先天性的VA严重缺乏可以使胚胎出现一系列的畸形，如眼、肺、心血管系统及泌尿生殖系统畸形等[2]。近年来研究发现VA与发育基因有一定关系[3]。本次研究就是通过对VA缺乏的孕鼠补充或不补充VA来观察其对Hox基因表达的影响。
1 材料及方法
1.1 动物饲养及分组
初断乳的清洁级昆明种雌鼠60只，雄鼠30只(武汉生物制品研究所动物中心提供)，全部用不锈钢鼠笼喂养。常规适应性喂养1周后，将雌鼠按体重随机分为正常对照组(N)、VA缺乏组(A)、妊娠第0天补充VA组(B)和妊娠第7天补充VA组(C)。VA缺乏饲料按AOAC配方修改而成，正常对照组及补充组饲料在缺乏VA饲料的基础上按各自需要添加VA。A、B、C 3组饲以VA缺乏饲料，每周观察VA缺乏症状。在第16周A、B、C 3组小鼠均出现VA缺乏症状时，按雌∶雄=2∶1合笼交配，第2天清晨查阴栓，查到阴栓者记为妊娠0天。交配后A组继续喂养VA缺乏饲料，B和C组分别在妊娠第0和7天饲以含VA 10 000IU/kg的饲料，雄鼠饲以普通饲料。试验期间小鼠自由饮水，自然光照，室温20～25℃，湿度55%～65%。在妊娠第12天时分别对孕鼠摘眼球留取血标本。然后脱颈椎处死，立刻剖腹取出胎鼠，所用器具必须高温处理或者用焦碳酸二乙酯(DEPC)水处理，确保无RNA酶。每组各取孕12天的雌鼠6只，分别从每只孕鼠随机取出2只胎鼠，迅速置于液氮中冷冻，然后置于-70℃冰箱保存待测。
, 百拇医药
1.2 孕鼠血清VA水平测定
采用荧光法(F-3000型荧光分光光度计，日本日立公司制造)测定孕鼠血清VA浓度(见表)。
1.3 胎鼠HoxC4(3.5)基因mRNA的原位杂交法测定
1.3.1 探针的制备[4] (1)在Internet网上从基因库上检索到Hox3.5基因的DNA序列，分别在Hox3.5基因第1外显子设计2对引物，引物长度均为21个碱基；交Gibco Brl公司合成。(2)胎鼠总RNA的分离提取：随机取正常对照组的胎鼠1只，利用TRIzol Total RNA提取试剂盒(美国Gibco Brl公司产品)提取总RNA。(3)cDNA的合成：利用TitanTM One Tube RT-PCR System(德国Boehringer Mannheim公司产品)获得cDNA片段作为DNA探针，其长度为247bp。(4)探针的标记：按照地高辛DNA标记及检测试剂盒(Boehringer Mannheim公司产品)的方法，对制备的片段进行标记。
, 百拇医药
1.3.2 原位杂交 (1)病理切片的制作：将胎鼠从-70℃冰箱取出后置于-20℃的冰箱，在恒冷切片机上沿旁矢状切面切成5μm厚的切片(每只胎鼠切2张切片)，迅速置于室温下4%的多聚甲醛固定20min。PBS洗后逐级酒精脱水(50%～100%的酒精，5个梯度)。然后，-20℃冰箱保存备用。(2)分子杂交：用地高辛标记的探针与胎鼠切片进行原位杂交，探查mRNA，并用酶联免疫法显色(采用地高辛DNA标记及检测试剂盒)[5]。
1.3.3 杂交结果的定量分析 采用HPIAS-1000的高清晰度多媒体彩色图象分析系统，测定杂交点的阳性比率。结果用面积密度(area density，一个视野中阳性表达面积之和/视窗面积)和积分光密度(Int-L-Den)。
1.4 统计处理
各组数据用平均数±标准误表示，均进行t检验。
, 百拇医药
2 结果
实验末期A、B、C 3组均出现皮毛干枯、胡须脱落、反应淡漠、眼部出现脓性分泌物及少食、少动等VA缺乏症状。从附表可见，A、C 2组孕鼠血清VA水平明显低于N组(P<0.01)，B组与N组相比差异无显著性(P>0.05)，C组高于A组，差异有极显著性(P<0.01)。
由附表的面积密度和积分光密度2个指标可见，A、C 2组的Hox3.5基因的表达量明显低于N、B 2组(P<0.01或P<0.05)，N组与B组相比，差异无显著性(P>0.05)，C组高于A组(P<0.05)。
附表 孕鼠血清VA浓度及小鼠胚胎中Hox3.5
基因的表达(n=8，
±s) 组别, 百拇医药
VA
(μmol/L)
面积密度
积分光密度
N
1.40±0.32
0.096 5±0.047 8
932.448 5±180.996 7
A
0.44±0.06(1，3)
0.047 0±0.007 6(1，2)
, 百拇医药
433.818 5±122.008 9(1，2)
B
1.56±0.29
0.116 3±0.099 5
985.326 5±176.201 3
C
1.03±0.12(1)
0.069 8±0.013 6(1)
685.195 4±206.984 9(1)
注：与N和B组相比(1)P<0.05 与C组相比，(2)P<0.05 (3)P<0.013 讨论
, 百拇医药
同源异性盒基因(Hox基因)属于发育基因，是一大类从时间和空间上对生物体的生长、发育进行协调和控制的调控基因。已经知道，结构基因通过表达特异性的蛋白质结构来建造有机体，而生物的发育则需要成千上万个结构基因按一个精确的时间和空间图谱来表达才能完成。研究发现，Hox基因在脊椎动物，尤其是哺乳动物胚胎发育过程中具有极其重要的作用[6]。它通过提供有序位置结构的分子系统，在胚胎的前-后轴模式的形成、肢体、脊椎及颅面部结构模式方面，具有重要的作用[7]。一旦其表达异常，就可能出现各种畸形。
有许多信号分子可以影响Hox基因的表达，视黄酸(RA)就是其中的一个(体内的RA来源于食物中的VA)[8]。据文献报道，在NT2/D1细胞系中Hox基因表达对RA具有共线性特性：在RA浓度为10-7mol/L时，仅染色体3′端的基因被激活；而在10-5mol/L时，5′端的基因才激活；无论RA是低浓度还是高浓度，Hox基因都是沿3′、5′的方向依次激活[8]。Marshall 发现，给予携带LacZ报告子基因的转基因小鼠RA，可以诱导Hox B1(Hox2.9)和Hox B2(Hox2.8)异常表达[7]。本次研究发现：(1)VA缺乏导致Hox3.5表达量明显下降，出现胚胎发育不良与畸形(结合本课题的动物致畸实验)；(2)妊娠第0天正处于受精卵的原核形成期，此时补充VA可使其从母体获得足够的VA，使Hox基因正常表达、胚胎正常发育。(3)妊娠第7天时胚胎正处于器官发生期，因缺乏VA，Hox基因表达量降低，此时补充VA虽然有一定的补偿作用，可以在一定程度上促进Hox基因的表达，但与正常组相比，仍有显著差异，表现为胚胎发育不良。
, http://www.100md.com
综上所述，VA作为一种自然成形剂，对胚胎的生长发育极其重要。它可能使Hox基因表达异常，从而使胚胎出现各种畸形及发育不良。所以在妊娠前补充足够的VA对胚胎的生长发育是十分重要的。但是RA是直接作用于Hox基因来调控它的转录，还是通过激活旁路途径来调控Hox基因的表达，还有待于进一步研究。
基金项目：国家“九五”攻关课题子题(No.96-904-06-06)
作者简介：刘恭平，男，硕士生
参考文献
1，Ekhard E，Ziegler LJ，Flier Jr.现代营养学.第7版.闻芝梅，陈君石译.北京：人民卫生出版社，1998，108
2，Morriss-Kay GM，Sokolova N.Embryonic development and pattern formation.FASEB J，1996，10:961
, http://www.100md.com
3，Robb K.Hox genes in vertebrate development.Cell，1994，78:191
4，金冬雁，黎孟枫译.分子克隆实验指导.第2版.北京：科学出版社，1996，396
5，姜泊，张亚历，周殿元.分子生物学常用实验方法.北京：人民军医出版社，1997，128
6，薛志刚.同源异性盒基因和胚胎发育.武汉大学学报，1993，6：105
7，Heather M，Stefan N，Mai H，et al.Retinoic acid alters hindbrain Hox code and induces transformation of rhombomeres 2/3 into a 4/5 identity.Nature，1992，360(24/31):737
8，Antonio S，Dario A，Laura A，et al.Sequential activation of Hox2 homeobox genes by retinoic acid in human embryonal carcinoma cell.Nature，1990，346(23):763
(1999-11-16收稿), 百拇医药