167种食品中的李斯特菌检验
作者：陈太基 封幼玲 戴建华 陈华
单位：江苏省卫生防疫站，南京 210009
关键词：李斯特菌；菌落形态；生化试验；鉴定
卫生研究000418 摘要：通过对南京某地区6类167种食品李斯特菌的初步分离鉴定，发现MMA分离平板上除45°光线下为蓝色或灰蓝色的S型小菌落外，呈现扁平、干燥、边缘不整齐的菌落(R菌落)也为李斯特菌的可疑菌落，同时发现触酶阴性、MR阴性、VP阴性及尿素酶阳性的菌株。结果表明，S型小菌落、尿素酶阴性、MR阳性、VP阳性及触酶阳性均不能作为李斯特菌鉴定的严格标准。
中图分类号：R155.31 TS 207.4 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)04-0246-02
, 百拇医药
Identification of Listeria species in 167 kinds of foods
Chen Taiji, Feng Youling, Dai Jianhua, Chen Hua
(Health and Epidemic Preventive Station of Jiangsu Province, Nanjing 210009,China)
Abstract：Through preliminary identification of isolation of Listeria species in six types foods, which consisted of 167 kinds of foods, we found both S-form and R-form colonies were suspected colonies of Listeria species, and some of them were catalase-negative, urease-positive, methyl red(MR) negative and Voges-Proskauer(VP) negative. The results showed that S-form, catalase-positive, urease-negative, MR-positive and VP-positive colony should not be used as the strict criteria for the identification of Listeria.
, 百拇医药
Key words:Listeria, colonial types, biochemical reaction, identification
李斯特菌属的主要特征为选择性MMA平板上在45°光线下为灰蓝或蓝色的S型小菌落，半固体培养基呈现伞形或月牙形生长，染色形态为G+细小杆菌、七叶苷+、触酶+、葡萄糖+、尿素酶-、MR+、VP+，呈翻滚样运动，多数H2S-、甘露醇+、硝酸盐还原-[1]。但是在对该属菌进行鉴定时完全按照此特征，有时会造成漏检，如该菌触酶通常为阳性，但国外已有多次触酶阴性的李斯特菌食物中毒的报道[2，3]。我们在对6大类167种食品样品中李斯特菌分离时，也发现一些类似的情况，如触酶-、MR-、VP-、尿素酶+的李斯特菌。本文目的在于通过对李斯特菌生长生化特性的一些研究，以期获得对李斯特菌常规检验鉴定的进一步认识。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 样品
包括肉禽类、蔬菜类、奶类、海产品、水产品及冷饮类共6大类167种食品样品，其中肉类包括新鲜、腌制及卤制品等生、熟肉类；水产品及海产品包括新鲜及冷冻产品；牛奶包括生奶及消毒奶，等等。样品分别采集自南京市的各大农贸市场、大型奶制品厂及相关食品生产企业。
1.2 主要试剂
萘啶酮酸(naladixic acid)，Sigma公司；盐酸吖啶黄(acriflavine HCl)，Sigma公司；胰胨、多胨为进口产品，其余试剂均为国产。生化培养基按GB4789-94等自行配制。
1.3 标准菌株
编号540001(L.monocytogenes)由卫生部食品卫生监督检验所提供，C4(L.ivanovii)、C6(L.seeligeri)、C16(L.monocytogenes)系军事医学科学院微生物流行病研究所提供。
, 百拇医药
1.4 主要仪器
Vitek全自动微生物分析系统(Vitek-AMS)及革兰氏阳性鉴定卡(GPI)，法国bioMerieux生产；暗视野显微镜。细菌生化分析软件为SYS-R06.02、VTK-AMS R06.01。
1.5 方法
样品的增菌培养及分离：选用EB和LB两种方法同时进行增菌培养和MMA分离[2]，但作如下改变：①可疑菌落的选择：除45°光线下为蓝色或灰蓝色的S型小菌落外，呈现扁平、干燥、边缘不整齐的菌落(R菌落)也视为可疑菌落；②可疑菌落穿刺于半固体培养基25℃左右培养，以观察其动力；③动力特征符合及暗视野显微镜下呈微旋转或翻滚样运动的菌落进行革兰氏染色及葡萄糖发酵，符合者同时进行系统生化鉴定及Vitek-AMS证实。系统生化包括甘露醇、硝酸盐还原、七叶苷、触酶、尿素酶、MR/VP、H2S等几项，证实为李斯特菌属者再作鼠李糖、木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、密二糖、蔗糖、cAMP、糊精、水解马尿酸及可溶性淀粉等生化反应，进行李斯特菌种的鉴定。所有生化实验均以标准菌株同时进行对照研究，且均重复测定2次以上。此外Vitek-AMS检测按操作手册进行。部分细菌鉴定的系统生化分析方法为Vitek系统的bioanalysis方法。判定是否为李斯特菌及相应的可信度。
, 百拇医药
2 结果
经过李斯特菌的主要形态、生化筛选及Vitek-AMS证实，初步确定6大类167种食品样品中检出31株李斯特菌，各种李斯特菌均有分布，其中单核细胞增生李斯特菌占77.4%[4]，经过EB和LB增菌后李斯特菌的检出率LB高于EB。其中符合特征(S型菌落、动力为伞形和月牙形、暗视野显微镜下呈微旋转或翻滚样运动、G+小杆菌、七叶苷+、触酶+、葡萄糖+、尿素酶-、MR+、VP+、H2S-)经Vitek-AMS证实为李斯特菌属者有24株(可信度为99%)，见表1；至少有1项与上述特征不符或不同者，经Vitek-AMS证实为李斯特菌属者有7株，见表2。我们以标准菌株C4、C6、C16及54001同时进行生物试验也发现C16的MR为阴性。再有，一些菌株如14EB-5、18LB-2、127LB-2的尿素酶常规试验为弱阳性，而Vitek-AMS鉴定结果为阴性，但是若以尿素酶阳性用VTK-AMS R06.01软件分析，发现鉴定结果仍然一样，如菌株127LB-2 Vitek-AMS自动鉴定出的结果为：鉴定编码76221220440(99%lisspe)，该生化模式中尿素酶为阴性，若判定其尿素酶为阳性，则鉴定编码为76231220440，结果也是99%lisspe,18LB-2也同样如此。
, http://www.100md.com
表1 主要特征符合者Vitek-AMS鉴定结果(1) 实验号(2)
源样品
鉴定编码
实验号
源样品
鉴定编码
4LB-2
生猪肉
76221220440
60EB-1
鱿鱼筒(3)
, 百拇医药
76221220440
12LB
鸡 肉
76321220440
81LB-1
雪糕Ⅰ
76221220440
18LB-1
生猪肉
76221220440
81LB-3
雪糕Ⅰ
, 百拇医药
76221220440
18LB-2
生猪肉
72221220440
82LB-1
雪糕Ⅱ
76221220440
18LB-5
生猪肉
76221220440
82LB-4
雪糕Ⅱ
, http://www.100md.com
76221220440
19LB-2
生猪肉
72221220440
127LB-1
咸 肉
72221220440
19LB-3
生猪肉
76221220440
127LB-2
咸 肉
, 百拇医药
76221220440
22LB-9
生猪肉
76221220440
127LB-4
咸 肉
72221220440
48LB
南海沙虫(3)
76221220440
137LB-3
咸 肉
, http://www.100md.com
72221220440
57LB
淡水虾仁丸(3)
76221220440
137EB-2
咸 肉
76221220440
58LB
海河八鲜(3)
76221220440
144LB-7
, 百拇医药 咸 肉
72221220440
59LB-3
鱿鱼卷(3)
76221220440
160LB
熟卤肉
72221220440
注：(1)可信度均为99% lisspe (2)LB系自LB增菌液分离，EB系自EB增菌液分离 (3)冷冻小包装表2 部分主要特征不符合菌株鉴定结果(1) 实验号
源样品
, http://www.100md.com
与主要特征不同点
鉴定编码
14EB-5
青菜
VP±(2)
76361220050
14EB-7
青菜
R形菌落、VP-、触酶-
76221220440
22LB-4
生猪肉
, 百拇医药
R形菌落
76221220440
22LB-5
生猪肉
R形菌落
72221220440
48EB
南海沙虫(3)
R形菌落、触酶-
76221220440
55LB-1
牛肉贡丸(3)
, http://www.100md.com
触酶-
76221220440
65EB-1
鲜龙虾
R形菌落
74361330440
C16
国际标准株
MR-
未做
注：(1)除C16未做外，可信度均为99% lisspe (2)结果极其微弱 (3)冷冻小包装
3 讨论
, 百拇医药
我们认为李斯特菌在半固体培养基中呈现伞形动力及镜下微旋转或翻滚样运动是其重要特征之一，所以在对上述167种样品中的李斯特菌的检测鉴定时，我们首先依据其动力特征及革兰氏染色进行筛选，可疑者同时进行Vitek-AMS鉴定及常规生化鉴定。常规生化鉴定时某些生化特征与传统模式不一致的菌落不轻易被排除。通过这样，我们发现形态、生化特征符合传统模式者，其初步鉴定基本上均为李斯特菌；而其中的某些特征如菌落形态、触酶、MR、VP、及尿素酶与通常文献包括伯杰细菌鉴定手册的定义不太一致的部分菌株，我们也鉴定为李斯特菌。这其中的一些鉴定指标在一些文献已有报道，如R型菌落为可疑菌落、触酶阴性等[2，3]。我们以国际标准株同时进行生化试验时也发现，C16 MR试验为阴性，定为尿素酶阳性的菌株虽然我们没有分离到，但Vitek-AMS数据库中已明确列入此类模式，如，77231220440。关于这类情况的解释，我们认为可能是菌株在自然界或各种培养条件下受影响而发生变异，或本身就存在这类情况而尚未被发现。
Bubert等发现2株触酶阴性的李斯特菌时，开始因为触酶阴性而致鉴定较困难，以后他们以p60蛋白制备的anti-p60抗体进行免疫印迹及用针对不同基因制备的引物进行PCR证实了触酶阴性的李斯特菌，并探讨了其流行病学的应用，认为触酶阳性不能作为李斯特菌鉴定的严格标准[2]。我们课题组通过该研究，目的在于更进一步探讨李斯特菌鉴定的形态特征和生化模式，以及对李斯特菌检测的新的认识及其意义，我们同样认为，S型菌落、尿毒酶阴性、MR/VP阳性及触酶阳性均不能作为李斯特菌鉴定的严格标准。
, http://www.100md.com
基金项目：江苏省卫生厅预防医学资助课题
作者简介：陈太基，男，硕士研究生，主管技师
参考文献
1，GB 4789-1994 食品卫生检验方法微生物学部分
2，Bubert A, Riebe J, Schnitzler N, et al. Isolation of catalase-negative Listeria monocytogenes strains from Listeriosis patients and their rapid identification by anti-p60 antibodies and/or PCR.J Clin Microbiol, 1997,35(1):179-183
3，Swartz MA, Welch DF, Narayanan RD, et al. Catalase-negative Listeria monocytogenes causing meningitis in an adult. Am J Clin Pathol,1991,96:130-133
4，陈太基，封幼玲，戴建华，等.南京地区李斯特菌污染状况研究.中国公共卫生，2000，16(1)：45—46
(1999-12-14收稿), 百拇医药
单位：江苏省卫生防疫站，南京 210009
关键词：李斯特菌；菌落形态；生化试验；鉴定
卫生研究000418 摘要：通过对南京某地区6类167种食品李斯特菌的初步分离鉴定，发现MMA分离平板上除45°光线下为蓝色或灰蓝色的S型小菌落外，呈现扁平、干燥、边缘不整齐的菌落(R菌落)也为李斯特菌的可疑菌落，同时发现触酶阴性、MR阴性、VP阴性及尿素酶阳性的菌株。结果表明，S型小菌落、尿素酶阴性、MR阳性、VP阳性及触酶阳性均不能作为李斯特菌鉴定的严格标准。
中图分类号：R155.31 TS 207.4 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)04-0246-02
, 百拇医药
Identification of Listeria species in 167 kinds of foods
Chen Taiji, Feng Youling, Dai Jianhua, Chen Hua
(Health and Epidemic Preventive Station of Jiangsu Province, Nanjing 210009,China)
Abstract：Through preliminary identification of isolation of Listeria species in six types foods, which consisted of 167 kinds of foods, we found both S-form and R-form colonies were suspected colonies of Listeria species, and some of them were catalase-negative, urease-positive, methyl red(MR) negative and Voges-Proskauer(VP) negative. The results showed that S-form, catalase-positive, urease-negative, MR-positive and VP-positive colony should not be used as the strict criteria for the identification of Listeria.
, 百拇医药
Key words:Listeria, colonial types, biochemical reaction, identification
李斯特菌属的主要特征为选择性MMA平板上在45°光线下为灰蓝或蓝色的S型小菌落，半固体培养基呈现伞形或月牙形生长，染色形态为G+细小杆菌、七叶苷+、触酶+、葡萄糖+、尿素酶-、MR+、VP+，呈翻滚样运动，多数H2S-、甘露醇+、硝酸盐还原-[1]。但是在对该属菌进行鉴定时完全按照此特征，有时会造成漏检，如该菌触酶通常为阳性，但国外已有多次触酶阴性的李斯特菌食物中毒的报道[2，3]。我们在对6大类167种食品样品中李斯特菌分离时，也发现一些类似的情况，如触酶-、MR-、VP-、尿素酶+的李斯特菌。本文目的在于通过对李斯特菌生长生化特性的一些研究，以期获得对李斯特菌常规检验鉴定的进一步认识。
1 材料与方法
, http://www.100md.com
1.1 样品
包括肉禽类、蔬菜类、奶类、海产品、水产品及冷饮类共6大类167种食品样品，其中肉类包括新鲜、腌制及卤制品等生、熟肉类；水产品及海产品包括新鲜及冷冻产品；牛奶包括生奶及消毒奶，等等。样品分别采集自南京市的各大农贸市场、大型奶制品厂及相关食品生产企业。
1.2 主要试剂
萘啶酮酸(naladixic acid)，Sigma公司；盐酸吖啶黄(acriflavine HCl)，Sigma公司；胰胨、多胨为进口产品，其余试剂均为国产。生化培养基按GB4789-94等自行配制。
1.3 标准菌株
编号540001(L.monocytogenes)由卫生部食品卫生监督检验所提供，C4(L.ivanovii)、C6(L.seeligeri)、C16(L.monocytogenes)系军事医学科学院微生物流行病研究所提供。
, 百拇医药
1.4 主要仪器
Vitek全自动微生物分析系统(Vitek-AMS)及革兰氏阳性鉴定卡(GPI)，法国bioMerieux生产；暗视野显微镜。细菌生化分析软件为SYS-R06.02、VTK-AMS R06.01。
1.5 方法
样品的增菌培养及分离：选用EB和LB两种方法同时进行增菌培养和MMA分离[2]，但作如下改变：①可疑菌落的选择：除45°光线下为蓝色或灰蓝色的S型小菌落外，呈现扁平、干燥、边缘不整齐的菌落(R菌落)也视为可疑菌落；②可疑菌落穿刺于半固体培养基25℃左右培养，以观察其动力；③动力特征符合及暗视野显微镜下呈微旋转或翻滚样运动的菌落进行革兰氏染色及葡萄糖发酵，符合者同时进行系统生化鉴定及Vitek-AMS证实。系统生化包括甘露醇、硝酸盐还原、七叶苷、触酶、尿素酶、MR/VP、H2S等几项，证实为李斯特菌属者再作鼠李糖、木糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、乳糖、密二糖、蔗糖、cAMP、糊精、水解马尿酸及可溶性淀粉等生化反应，进行李斯特菌种的鉴定。所有生化实验均以标准菌株同时进行对照研究，且均重复测定2次以上。此外Vitek-AMS检测按操作手册进行。部分细菌鉴定的系统生化分析方法为Vitek系统的bioanalysis方法。判定是否为李斯特菌及相应的可信度。
, 百拇医药
2 结果
经过李斯特菌的主要形态、生化筛选及Vitek-AMS证实，初步确定6大类167种食品样品中检出31株李斯特菌，各种李斯特菌均有分布，其中单核细胞增生李斯特菌占77.4%[4]，经过EB和LB增菌后李斯特菌的检出率LB高于EB。其中符合特征(S型菌落、动力为伞形和月牙形、暗视野显微镜下呈微旋转或翻滚样运动、G+小杆菌、七叶苷+、触酶+、葡萄糖+、尿素酶-、MR+、VP+、H2S-)经Vitek-AMS证实为李斯特菌属者有24株(可信度为99%)，见表1；至少有1项与上述特征不符或不同者，经Vitek-AMS证实为李斯特菌属者有7株，见表2。我们以标准菌株C4、C6、C16及54001同时进行生物试验也发现C16的MR为阴性。再有，一些菌株如14EB-5、18LB-2、127LB-2的尿素酶常规试验为弱阳性，而Vitek-AMS鉴定结果为阴性，但是若以尿素酶阳性用VTK-AMS R06.01软件分析，发现鉴定结果仍然一样，如菌株127LB-2 Vitek-AMS自动鉴定出的结果为：鉴定编码76221220440(99%lisspe)，该生化模式中尿素酶为阴性，若判定其尿素酶为阳性，则鉴定编码为76231220440，结果也是99%lisspe,18LB-2也同样如此。
, http://www.100md.com
表1 主要特征符合者Vitek-AMS鉴定结果(1) 实验号(2)
源样品
鉴定编码
实验号
源样品
鉴定编码
4LB-2
生猪肉
76221220440
60EB-1
鱿鱼筒(3)
, 百拇医药
76221220440
12LB
鸡 肉
76321220440
81LB-1
雪糕Ⅰ
76221220440
18LB-1
生猪肉
76221220440
81LB-3
雪糕Ⅰ
, 百拇医药
76221220440
18LB-2
生猪肉
72221220440
82LB-1
雪糕Ⅱ
76221220440
18LB-5
生猪肉
76221220440
82LB-4
雪糕Ⅱ
, http://www.100md.com
76221220440
19LB-2
生猪肉
72221220440
127LB-1
咸 肉
72221220440
19LB-3
生猪肉
76221220440
127LB-2
咸 肉
, 百拇医药
76221220440
22LB-9
生猪肉
76221220440
127LB-4
咸 肉
72221220440
48LB
南海沙虫(3)
76221220440
137LB-3
咸 肉
, http://www.100md.com
72221220440
57LB
淡水虾仁丸(3)
76221220440
137EB-2
咸 肉
76221220440
58LB
海河八鲜(3)
76221220440
144LB-7
, 百拇医药 咸 肉
72221220440
59LB-3
鱿鱼卷(3)
76221220440
160LB
熟卤肉
72221220440
注：(1)可信度均为99% lisspe (2)LB系自LB增菌液分离，EB系自EB增菌液分离 (3)冷冻小包装表2 部分主要特征不符合菌株鉴定结果(1) 实验号
源样品
, http://www.100md.com
与主要特征不同点
鉴定编码
14EB-5
青菜
VP±(2)
76361220050
14EB-7
青菜
R形菌落、VP-、触酶-
76221220440
22LB-4
生猪肉
, 百拇医药
R形菌落
76221220440
22LB-5
生猪肉
R形菌落
72221220440
48EB
南海沙虫(3)
R形菌落、触酶-
76221220440
55LB-1
牛肉贡丸(3)
, http://www.100md.com
触酶-
76221220440
65EB-1
鲜龙虾
R形菌落
74361330440
C16
国际标准株
MR-
未做
注：(1)除C16未做外，可信度均为99% lisspe (2)结果极其微弱 (3)冷冻小包装
3 讨论
, 百拇医药
我们认为李斯特菌在半固体培养基中呈现伞形动力及镜下微旋转或翻滚样运动是其重要特征之一，所以在对上述167种样品中的李斯特菌的检测鉴定时，我们首先依据其动力特征及革兰氏染色进行筛选，可疑者同时进行Vitek-AMS鉴定及常规生化鉴定。常规生化鉴定时某些生化特征与传统模式不一致的菌落不轻易被排除。通过这样，我们发现形态、生化特征符合传统模式者，其初步鉴定基本上均为李斯特菌；而其中的某些特征如菌落形态、触酶、MR、VP、及尿素酶与通常文献包括伯杰细菌鉴定手册的定义不太一致的部分菌株，我们也鉴定为李斯特菌。这其中的一些鉴定指标在一些文献已有报道，如R型菌落为可疑菌落、触酶阴性等[2，3]。我们以国际标准株同时进行生化试验时也发现，C16 MR试验为阴性，定为尿素酶阳性的菌株虽然我们没有分离到，但Vitek-AMS数据库中已明确列入此类模式，如，77231220440。关于这类情况的解释，我们认为可能是菌株在自然界或各种培养条件下受影响而发生变异，或本身就存在这类情况而尚未被发现。
Bubert等发现2株触酶阴性的李斯特菌时，开始因为触酶阴性而致鉴定较困难，以后他们以p60蛋白制备的anti-p60抗体进行免疫印迹及用针对不同基因制备的引物进行PCR证实了触酶阴性的李斯特菌，并探讨了其流行病学的应用，认为触酶阳性不能作为李斯特菌鉴定的严格标准[2]。我们课题组通过该研究，目的在于更进一步探讨李斯特菌鉴定的形态特征和生化模式，以及对李斯特菌检测的新的认识及其意义，我们同样认为，S型菌落、尿毒酶阴性、MR/VP阳性及触酶阳性均不能作为李斯特菌鉴定的严格标准。
, http://www.100md.com
基金项目：江苏省卫生厅预防医学资助课题
作者简介：陈太基，男，硕士研究生，主管技师
参考文献
1，GB 4789-1994 食品卫生检验方法微生物学部分
2，Bubert A, Riebe J, Schnitzler N, et al. Isolation of catalase-negative Listeria monocytogenes strains from Listeriosis patients and their rapid identification by anti-p60 antibodies and/or PCR.J Clin Microbiol, 1997,35(1):179-183
3，Swartz MA, Welch DF, Narayanan RD, et al. Catalase-negative Listeria monocytogenes causing meningitis in an adult. Am J Clin Pathol,1991,96:130-133
4，陈太基，封幼玲，戴建华，等.南京地区李斯特菌污染状况研究.中国公共卫生，2000，16(1)：45—46
(1999-12-14收稿), 百拇医药