维生素E琥珀酸酯诱导人胃癌细胞凋亡的研究
作者：刘柏合 吴坤 赵丹阳
单位：赵丹阳(黑龙江中医药大学方剂教研室)；刘柏合 吴坤(哈尔滨医科大学公共卫生学院，哈尔滨 150001)
关键词：维生素E琥珀酸酯；人胃癌细胞(SGC-7901)；细胞凋亡
卫生研究000414 摘要：采用体外细胞培养的方法，观察了维生素E琥珀酸酯(VES)对人胃癌细胞(SGC-7901)生长的影响，并通过荧光染色和流式细胞仪技术研究其对SGC-7901细胞凋亡的影响。结果表明VES(5、10和20μg/ml)对SGC-7901细胞生长有明显抑制作用；同时VES可诱导SGC-7901细胞凋亡。提示VES可通过诱导细胞凋亡来抑制胃癌细胞生长。
中图分类号：R 730.1 R 735.2 Q566 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)04-0234-03
, http://www.100md.com
Study on vitamin E succinate inducing apoptosis of human gastric
carcinoma cell
Liu Baihe, Wu Kun， Zhao Danyang
(Public Health School of Harbin Medical Univesity, Harbin 150001,China)
Abstract：The effects of vitamin E succinate (VES) on the growth of human gastric carcinoma SGC-7901 cell were observed in cell culture. The apoptosis of SGC-7901 cell induced by VES was studied by fluorescent staining and flow-cytometry. The results showed that VES (5,10 and 20mg/L) could obviously inhibit the growth of gastric carcinoma cell, and it could be the result of inducing apoptosis.
, 百拇医药
Key words:vitamin E succinate, human gastric carcinoma SGC-7901 cell, apoptosis
维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate, VES)是维生素E的天然衍生物，它是由琥珀酸与α-生育酚的6位羟基成酯而形成的化合物，因其可保护α-生育酚的6位羟基，使α-生育酚在储存和运输中稳定性增加，而广泛用于α-生育酚的运输和储存。最近研究表明，VES可对多种肿瘤细胞生长产生抑制作用[1，2]。本研究以人胃癌细胞(SGC-7901)作为离体试验模型，通过用不同剂量的VES处理该细胞，观察VES对SGC-7901细胞生长的影响，并利用荧光染色和流式细胞仪技术检测VES处理后细胞发生凋亡的情况，以探讨VES对肿瘤细胞的作用机理。
1 材料与方法
1.1 仪器
, http://www.100md.com
荧光倒置显微镜为Olympus公司IX70型；流式细胞仪为Coulter公司EpicsX2型。
1.2 材料
RPMI-1640购自Gibco公司；碘化丙啶(PI)染料、联咪二苯吲哚(4,6-Diamidino-2-phenylindole,DAPI)及VES均购自Sigma公司。
1.3 方法
1.3.1 VES溶液的配制 用无水乙醇将VES配制成浓度为10g/L的储备液，使用前根据细胞毒性试验，将VES储备液用10%新生牛血清的1640培养液分别稀释成5、10和20mg/L的VES使用液，并加入无水乙醇使VES使用液中无水乙醇的浓度为1ml/L。
1.3.2 SGC-7901细胞的培养 人胃癌细胞(SGC-7901)引自北京市肿瘤研究所。细胞在含有10%新生牛血清、青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/L)和L-谷氨酰胺(2mmol/L)的RPMI 1640培养液中，于37℃、5%CO2培养箱中常规培养。
, 百拇医药
1.3.3 生长曲线的测定 将SGC-7901细胞以每孔2×104接种于24孔板中，于CO2培养箱中常规培养24h。然后将培养液分别换成空白对照液(1 ml/L乙醇的10%新生牛血清1640的培养液)和不同浓度的VES使用液，继续培养7天。每天换液1次，同时将空白组和VES处理组细胞分别消化4孔，台盼蓝染色，置血球计数板内计数活细胞数。绘制生长曲线，并计算细胞的生长抑制率。
1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 将生长至对数生长期的SGC-7901细胞用空白对照液和不同浓度VES使用液培养48h后，用PBS液洗2次，70%乙醇4℃过夜固定。PBS洗2次去除固定液，加PI染料混匀，避光染色30min，利用流式细胞仪分析凋亡细胞含量。
1.3.5 荧光染色实验 将生长至对数生长期的SGC-7901细胞用空白对照液和不同浓度VES使用液培养48h后，把悬浮和贴壁的细胞收集在一起，用PBS液洗2遍，加入2mg/L DAPI无水甲醇溶液，在37℃孵育15min，然后在300～500nm波长下，用×400荧光显微镜进行凋亡形态学观察。
, 百拇医药
2 结果
2.1 VES处理的SGC-7901细胞的生长曲线
由图1可见：对照组细胞于接种后第2天开始快速生长，第4天细胞数量已明显高于VES组。而VES处理的细胞均受到不同程度的抑制，随着VES剂量的增加，这种抑制作用越明显。其中20μg/ml VES剂量处理的细胞在24h后受到明显抑制，在第4天抑制率即接近100%。5、10和20μg/ml VES处理细胞7天后，细胞生长分别被抑制41.2%、98.3%和100%。
图1 VES处理的SGC-7901细胞的生长曲线
2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡
将空白对照液和不同浓度VES处理48 h的SGC-7901细胞收集后，用流式细胞仪对细胞周期分布及凋亡细胞率进行检测，结果见图2及表1。
, 百拇医药
图2 VES处理的SGC-7901的流式细胞仪检测结果
表1 流式细胞仪检测VES处理对SGC-7901细胞凋亡的影响(n=3) 组 别
剂量
(mg/L)
细胞凋亡率
(%)
对照组
-
0.40±0.11
VES
5
3.43±0.35(1)
, 百拇医药
VES
10
12.63±2.38(1)
VES
20
25.22±3.56(1)
注：与对照组相比(1)P<0.01
表1显示，随VES剂量增加凋亡细胞数明显增加，呈剂量依赖关系。
由图2可见，在对照组细胞中未检测到细胞凋亡峰(前G1峰)；而用5、10和20mg/L VES处理细胞48h后，均检测到典型的细胞凋亡峰，并且细胞凋亡峰面积随剂量增加而明显增加。
, 百拇医药
2.3 荧光染色观察细胞凋亡
DAPI染色后，细胞核发淡蓝色荧光。对照组细胞的细胞核近似圆形，边缘清晰，染色均匀(见图3A)。而VES处理后的细胞细胞核边缘不规则，细胞核染色体浓集，着色较重，并伴有细胞核固缩和细胞核碎片增加现象，为细胞发生凋亡的典型特征(见图3B)。
图3 DAPI染色的SGC-7901细胞(×400)
3 讨论
VES是维生素E的天然衍生物，目前国外报道其在体外对多种肿瘤细胞生长有抑制作用，如大鼠神经胶质瘤细胞[3]、人前列腺癌细胞[4]、人早幼粒细胞[5]、人乳腺癌细胞等[6]。进一步研究显示VES对上皮细胞来源的肿瘤抑制效果更佳[2]。同时国外学者用VES处理人乳腺癌细胞后还发现，VES在抑制乳腺癌细胞生长过程中，可诱导细胞产生凋亡[7]。这表明VES可能成为一种新的细胞凋亡诱导剂，而引起关注。
, 百拇医药
胃癌属于上皮细胞癌，为我国高发的恶性肿瘤，本文通过用不同浓度的VES处理人胃癌细胞(SGC-7901)后，观察到VES对SGC-7901细胞生长具有抑制作用，并且该抑制作用随VES剂量的增加而增强，呈剂量-效应关系。同时我们也对VES与其水解产物α-生育酚(维生素E的一种主要抗氧化成分)的抗胃癌细胞生长作用进行了比较，结果显示在相同剂量下，α-生育酚对胃癌细胞生长无抑制作用[8]，这表明VES抗胃癌细胞生长不是通过其水解后产生α-生育酚来实现的，而是通过其完整结构来发挥作用的，因此VES具有不同于维生素E的抗肿瘤作用机理。
为进一步探讨VES抗胃癌细胞生长的作用机理，我们利用流式细胞仪对VES处理的SGC-7901细胞进行了分析，结果显示在VES处理的SGC-7901细胞中出现了典型的前G1期峰，即细胞凋亡峰，并随着VES剂量的增加，细胞凋亡数也明显增多，这表明VES可诱导胃癌细胞产生凋亡。同时我们又利用荧光染色法对VES处理的人胃癌细胞(SGC-7901)进行了形态观察。DAPI作为一种荧光染料，只对细胞核进行染色，并可直接在荧光显微镜下对染色后的细胞进行形态学变化观察，该法在国内外被广泛应用。本文结果表明VES处理SGC-7901细胞后，细胞核边缘变得不规则，并伴有染色体浓集、细胞核固缩和细胞核碎片增多等现象的出现，而这些现象正是细胞凋亡的典型特征，从而更进一步证明：VES可诱导人胃癌细胞(SGC-7901)产生凋亡。这一结论与国外学者在VES处理的乳腺癌细胞中所观察到的结果一致，表明VES抑制肿瘤细胞生长可通过其诱导肿瘤细胞产生凋亡来实现。目前其诱导凋亡的机理尚不清楚，有待进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金(No.39870662)
作者简介：刘柏合，男，博士研究生
参考文献
1，Prasad K N, Edwards-Prasad J.Vitamin E and cancer prevention:recent advances and future potentials. J Am Coll Nutr,1992,11:487
2，Sporn MB, Roberts AB. Interactions of retinoid and transforming growth factor-beta in regulation of cell differentiation and proliferation. Molecul Endocrinol, 1991,5:3
, 百拇医药
3，Rama B N, Prasad N. Study on the specificity of alpha tocopheryl (vitamin E) acid succinate effect on melanoma, glioma and neuroblastoma cells in culture. Proc Soc Exp Biol Med,1983,174:302
4，Isral K, Sander BG, Kline K. RRR-α-tocopheryl succinate inhibits the proliferation of human prostatic tumor cells with defective cell cycle/differentiation pathways. Nutr Cancer,1995,24:161
5，Turley J M, Sanders B G, Kline K. RRR-α-tocopheryl succinate modulation of human promyclocytic leukemia(HL 60) cell proliferation and differentiation. Nutr Cancer,1992,18:201
, 百拇医药
6，Charpentier A, Simmons-Menchaca M, Yu W, et al. RRR-α-tocopheryl succinate enhances TGF-β1, -β2 and-β3 and TGF-βR-Ⅱ expression by human MDA-MB-435 breast cancer cells. Nutr Cancer,1996,26:237
7，Yu WP, Heim K, Qian M, et al. Evidence for role of transforming growth factor-β in RRR-α-tocopheryl succinate-induced apoptosis of human MDA-AM-435 breast cancer cells. Nutr Cancer,1997,27:267
8，刘柏合，吴坤，赵丹阳.维生素E琥珀酸酯抑制人胃癌细胞生长的研究.卫生研究，2000，29(3):172—174
(2000-04-17收稿), 百拇医药
单位：赵丹阳(黑龙江中医药大学方剂教研室)；刘柏合 吴坤(哈尔滨医科大学公共卫生学院，哈尔滨 150001)
关键词：维生素E琥珀酸酯；人胃癌细胞(SGC-7901)；细胞凋亡
卫生研究000414 摘要：采用体外细胞培养的方法，观察了维生素E琥珀酸酯(VES)对人胃癌细胞(SGC-7901)生长的影响，并通过荧光染色和流式细胞仪技术研究其对SGC-7901细胞凋亡的影响。结果表明VES(5、10和20μg/ml)对SGC-7901细胞生长有明显抑制作用；同时VES可诱导SGC-7901细胞凋亡。提示VES可通过诱导细胞凋亡来抑制胃癌细胞生长。
中图分类号：R 730.1 R 735.2 Q566 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)04-0234-03
, http://www.100md.com
Study on vitamin E succinate inducing apoptosis of human gastric
carcinoma cell
Liu Baihe, Wu Kun， Zhao Danyang
(Public Health School of Harbin Medical Univesity, Harbin 150001,China)
Abstract：The effects of vitamin E succinate (VES) on the growth of human gastric carcinoma SGC-7901 cell were observed in cell culture. The apoptosis of SGC-7901 cell induced by VES was studied by fluorescent staining and flow-cytometry. The results showed that VES (5,10 and 20mg/L) could obviously inhibit the growth of gastric carcinoma cell, and it could be the result of inducing apoptosis.
, 百拇医药
Key words:vitamin E succinate, human gastric carcinoma SGC-7901 cell, apoptosis
维生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate, VES)是维生素E的天然衍生物，它是由琥珀酸与α-生育酚的6位羟基成酯而形成的化合物，因其可保护α-生育酚的6位羟基，使α-生育酚在储存和运输中稳定性增加，而广泛用于α-生育酚的运输和储存。最近研究表明，VES可对多种肿瘤细胞生长产生抑制作用[1，2]。本研究以人胃癌细胞(SGC-7901)作为离体试验模型，通过用不同剂量的VES处理该细胞，观察VES对SGC-7901细胞生长的影响，并利用荧光染色和流式细胞仪技术检测VES处理后细胞发生凋亡的情况，以探讨VES对肿瘤细胞的作用机理。
1 材料与方法
1.1 仪器
, http://www.100md.com
荧光倒置显微镜为Olympus公司IX70型；流式细胞仪为Coulter公司EpicsX2型。
1.2 材料
RPMI-1640购自Gibco公司；碘化丙啶(PI)染料、联咪二苯吲哚(4,6-Diamidino-2-phenylindole,DAPI)及VES均购自Sigma公司。
1.3 方法
1.3.1 VES溶液的配制 用无水乙醇将VES配制成浓度为10g/L的储备液，使用前根据细胞毒性试验，将VES储备液用10%新生牛血清的1640培养液分别稀释成5、10和20mg/L的VES使用液，并加入无水乙醇使VES使用液中无水乙醇的浓度为1ml/L。
1.3.2 SGC-7901细胞的培养 人胃癌细胞(SGC-7901)引自北京市肿瘤研究所。细胞在含有10%新生牛血清、青霉素(100U/ml)、链霉素(100mg/L)和L-谷氨酰胺(2mmol/L)的RPMI 1640培养液中，于37℃、5%CO2培养箱中常规培养。
, 百拇医药
1.3.3 生长曲线的测定 将SGC-7901细胞以每孔2×104接种于24孔板中，于CO2培养箱中常规培养24h。然后将培养液分别换成空白对照液(1 ml/L乙醇的10%新生牛血清1640的培养液)和不同浓度的VES使用液，继续培养7天。每天换液1次，同时将空白组和VES处理组细胞分别消化4孔，台盼蓝染色，置血球计数板内计数活细胞数。绘制生长曲线，并计算细胞的生长抑制率。
1.3.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 将生长至对数生长期的SGC-7901细胞用空白对照液和不同浓度VES使用液培养48h后，用PBS液洗2次，70%乙醇4℃过夜固定。PBS洗2次去除固定液，加PI染料混匀，避光染色30min，利用流式细胞仪分析凋亡细胞含量。
1.3.5 荧光染色实验 将生长至对数生长期的SGC-7901细胞用空白对照液和不同浓度VES使用液培养48h后，把悬浮和贴壁的细胞收集在一起，用PBS液洗2遍，加入2mg/L DAPI无水甲醇溶液，在37℃孵育15min，然后在300～500nm波长下，用×400荧光显微镜进行凋亡形态学观察。
, 百拇医药
2 结果
2.1 VES处理的SGC-7901细胞的生长曲线
由图1可见：对照组细胞于接种后第2天开始快速生长，第4天细胞数量已明显高于VES组。而VES处理的细胞均受到不同程度的抑制，随着VES剂量的增加，这种抑制作用越明显。其中20μg/ml VES剂量处理的细胞在24h后受到明显抑制，在第4天抑制率即接近100%。5、10和20μg/ml VES处理细胞7天后，细胞生长分别被抑制41.2%、98.3%和100%。
图1 VES处理的SGC-7901细胞的生长曲线
2.2 流式细胞仪检测细胞凋亡
将空白对照液和不同浓度VES处理48 h的SGC-7901细胞收集后，用流式细胞仪对细胞周期分布及凋亡细胞率进行检测，结果见图2及表1。
, 百拇医药
图2 VES处理的SGC-7901的流式细胞仪检测结果
表1 流式细胞仪检测VES处理对SGC-7901细胞凋亡的影响(n=3) 组 别
剂量
(mg/L)
细胞凋亡率
(%)
对照组
-
0.40±0.11
VES
5
3.43±0.35(1)
, 百拇医药
VES
10
12.63±2.38(1)
VES
20
25.22±3.56(1)
注：与对照组相比(1)P<0.01
表1显示，随VES剂量增加凋亡细胞数明显增加，呈剂量依赖关系。
由图2可见，在对照组细胞中未检测到细胞凋亡峰(前G1峰)；而用5、10和20mg/L VES处理细胞48h后，均检测到典型的细胞凋亡峰，并且细胞凋亡峰面积随剂量增加而明显增加。
, 百拇医药
2.3 荧光染色观察细胞凋亡
DAPI染色后，细胞核发淡蓝色荧光。对照组细胞的细胞核近似圆形，边缘清晰，染色均匀(见图3A)。而VES处理后的细胞细胞核边缘不规则，细胞核染色体浓集，着色较重，并伴有细胞核固缩和细胞核碎片增加现象，为细胞发生凋亡的典型特征(见图3B)。
图3 DAPI染色的SGC-7901细胞(×400)
3 讨论
VES是维生素E的天然衍生物，目前国外报道其在体外对多种肿瘤细胞生长有抑制作用，如大鼠神经胶质瘤细胞[3]、人前列腺癌细胞[4]、人早幼粒细胞[5]、人乳腺癌细胞等[6]。进一步研究显示VES对上皮细胞来源的肿瘤抑制效果更佳[2]。同时国外学者用VES处理人乳腺癌细胞后还发现，VES在抑制乳腺癌细胞生长过程中，可诱导细胞产生凋亡[7]。这表明VES可能成为一种新的细胞凋亡诱导剂，而引起关注。
, 百拇医药
胃癌属于上皮细胞癌，为我国高发的恶性肿瘤，本文通过用不同浓度的VES处理人胃癌细胞(SGC-7901)后，观察到VES对SGC-7901细胞生长具有抑制作用，并且该抑制作用随VES剂量的增加而增强，呈剂量-效应关系。同时我们也对VES与其水解产物α-生育酚(维生素E的一种主要抗氧化成分)的抗胃癌细胞生长作用进行了比较，结果显示在相同剂量下，α-生育酚对胃癌细胞生长无抑制作用[8]，这表明VES抗胃癌细胞生长不是通过其水解后产生α-生育酚来实现的，而是通过其完整结构来发挥作用的，因此VES具有不同于维生素E的抗肿瘤作用机理。
为进一步探讨VES抗胃癌细胞生长的作用机理，我们利用流式细胞仪对VES处理的SGC-7901细胞进行了分析，结果显示在VES处理的SGC-7901细胞中出现了典型的前G1期峰，即细胞凋亡峰，并随着VES剂量的增加，细胞凋亡数也明显增多，这表明VES可诱导胃癌细胞产生凋亡。同时我们又利用荧光染色法对VES处理的人胃癌细胞(SGC-7901)进行了形态观察。DAPI作为一种荧光染料，只对细胞核进行染色，并可直接在荧光显微镜下对染色后的细胞进行形态学变化观察，该法在国内外被广泛应用。本文结果表明VES处理SGC-7901细胞后，细胞核边缘变得不规则，并伴有染色体浓集、细胞核固缩和细胞核碎片增多等现象的出现，而这些现象正是细胞凋亡的典型特征，从而更进一步证明：VES可诱导人胃癌细胞(SGC-7901)产生凋亡。这一结论与国外学者在VES处理的乳腺癌细胞中所观察到的结果一致，表明VES抑制肿瘤细胞生长可通过其诱导肿瘤细胞产生凋亡来实现。目前其诱导凋亡的机理尚不清楚，有待进一步研究。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金(No.39870662)
作者简介：刘柏合，男，博士研究生
参考文献
1，Prasad K N, Edwards-Prasad J.Vitamin E and cancer prevention:recent advances and future potentials. J Am Coll Nutr,1992,11:487
2，Sporn MB, Roberts AB. Interactions of retinoid and transforming growth factor-beta in regulation of cell differentiation and proliferation. Molecul Endocrinol, 1991,5:3
, 百拇医药
3，Rama B N, Prasad N. Study on the specificity of alpha tocopheryl (vitamin E) acid succinate effect on melanoma, glioma and neuroblastoma cells in culture. Proc Soc Exp Biol Med,1983,174:302
4，Isral K, Sander BG, Kline K. RRR-α-tocopheryl succinate inhibits the proliferation of human prostatic tumor cells with defective cell cycle/differentiation pathways. Nutr Cancer,1995,24:161
5，Turley J M, Sanders B G, Kline K. RRR-α-tocopheryl succinate modulation of human promyclocytic leukemia(HL 60) cell proliferation and differentiation. Nutr Cancer,1992,18:201
, 百拇医药
6，Charpentier A, Simmons-Menchaca M, Yu W, et al. RRR-α-tocopheryl succinate enhances TGF-β1, -β2 and-β3 and TGF-βR-Ⅱ expression by human MDA-MB-435 breast cancer cells. Nutr Cancer,1996,26:237
7，Yu WP, Heim K, Qian M, et al. Evidence for role of transforming growth factor-β in RRR-α-tocopheryl succinate-induced apoptosis of human MDA-AM-435 breast cancer cells. Nutr Cancer,1997,27:267
8，刘柏合，吴坤，赵丹阳.维生素E琥珀酸酯抑制人胃癌细胞生长的研究.卫生研究，2000，29(3):172—174
(2000-04-17收稿), 百拇医药