硒、锌对氟致大鼠大脑神经细胞DNA损伤的影响
作者：陈 军 陈学敏 杨克敌
单位：同济医科大学环境卫生教研室，武汉 430030
关键词：氟；硒；锌；DNA损伤；大脑皮层神经细胞
卫生研究000410 摘要：为研究氟对大鼠大脑皮层神经细胞的DNA损伤作用及硒、锌单独及联合作用对其的影响，对大鼠体外染毒后采用单细胞凝胶电泳技术检测DNA单链断裂。结果显示单独加氟、硒组DNA损伤程度显著大于对照组(P<0.01)，且氟的影响更为严重，氟硒组和氟锌组DNA损伤程度小于氟组，但差异无显著性意义，氟硒锌组DNA损伤程度显著低于氟组(P<0.05)。提示氟、硒单独作用均造成大脑皮层神经细胞DNA损伤，硒锌联合可明显拮抗氟对DNA的损伤作用。
中图分类号：R599 Q593.2 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)04-0216-02
, 百拇医药
Effects of selenium and zinc on the DNA damage caused by
fluoride in pallium neural cells of rats
Chen Jun, Chen Xuemin, Yang Kedi
(Department of Environmental Health,Tongji Medical University,Wuhan 430030,China)
Abstract：To investigate the effects of fluoride on DNA damage as well as the effects of selenium and zinc against fluoride respectively or jointly in pallium neural cells of rats ,single cell gel electrophoresis was used to detect the DNA damage of neural cells prepared in vitro.The results showed that the degree of DNA damage in the fluoride group and the selenium group were significantly greater than that in control group(P<0～01).The damage in the fluoride group was even more serious.The damage in the fluoride+selenium group and fluoride+zinc group was slighter than that in the fluoride group but with no significant difference.The extent of DNA damage in the fluoride+selenium+zinc group was significantly slighter than that in the fluoride group(P<0～05).It suggested that fluoride and selenium could induce DNA damage in pallium neural cells of rats respectively.Moreover, the joint antagonistic effect of selenium and zinc against fluoride was more obvious.
, 百拇医药
Key words:fluoride, selenium, zinc, DNA damage,pallium neural cells
氟的毒性作用涉及到全身各器官(组织)，氟对中枢神经系统可产生直接毒性作用，如对脑细胞增殖和分化造成不良影响[1]，大脑中氟蓄积及神经细胞发育迟缓[2]。研究表明，氟的遗传毒性与其引起DNA损伤有密切关系[3]，本实验采用单细胞凝胶电泳技术(SCGE or Comet Assay)研究了氟引起的大鼠大脑皮层神经细胞DNA损伤，同时观察了硒、锌单独及联合作用对这种损伤的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
胰蛋白酶(Difco)，牛血清白蛋白(BM)，低熔点琼脂糖(low melting point agrose,Sangon),Triton X-100(Sigma),Tris(进口分装)，肌氨酸钠(sodium sarcosinate SLS,进口分装)，其它试剂为国产分析纯。水平电泳槽和电泳仪(北京六一仪器厂)，Olympus BX60荧光显微镜(日本)，Shel CO2培养箱(美国)。
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1.2 大脑皮层神经细胞悬液制备
参照Dildy的方法稍作改进[4]。将(210±15)g雄性SD大鼠断头处死，取出大脑，剥去脑膜，置于pH7.4的冰Hanks液中清洗2次。用眼科剪剪碎脑组织后加入0.125%胰蛋白酶，置于37℃水浴中消化20分钟，边消化边轻微振摇。然后用含0.5%牛血清白蛋白的RPMI 1640培养基终止消化，经250目筛网过滤，滤液1500r/min离心5分钟后弃上清，用Hanks液洗涤细胞1次，最后用RPMI 1640培养基制成约106个/ml的细胞悬液。经台盼蓝染色，细胞存活率不低于95%。将细胞置于CO2培养箱中37℃培养3小时，pH74 PBS清洗细胞2次后仍以PBS悬浮细胞。
1.3 实验分组与处理
取上述细胞悬液850μl为一份，每组4份共8组，即对照组、F、F+Se+Zn、Se+Zn、F+Se、Se、F+Zn、Zn组，加入受试物至1ml,NaF、Na2SeO3、ZnSO4各自终浓度分别为5mmol/L、10μmol/L和1.5mmol/L。37℃温育2小时，离心去上清，用PBS清洗一次，再将细胞悬于100μl PBS中待用。
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1.4 单细胞凝胶电泳
按Singh方法在磨砂载玻片上铺胶[5]。第1层为0.7%正常熔点琼脂糖75μl，第2层为混有10μl细胞悬液的0.7%低熔点琼脂糖75μl，第3层为0.7%低熔点琼脂糖75μl。待胶完全凝固后放入预冷的细胞裂解液中(2.5mol/L NaCl,100mmol/L EDTA-Na2,10mmol/L Tris,1% SLS,新鲜加入的1% Triton X-100,10% DMSO)1小时，然后取出玻片置于盛有电泳液(300mmol/L NaOH,1mmol/L EDTA-Na2， pH12)的电泳槽内浸泡20分钟。接通电源，在100mA、25V条件下电泳40分钟后取出玻片，用中和液(0.4mol/L Tris,pH7～5)洗3次。滴加2mg/L吖啶橙75μl染色，盖上盖玻片。尽快在荧光显微镜下观察，每片检查计数50个细胞。镜下受到损伤的DNA出现拖尾现象，根据拖尾DNA的量占细胞总DNA的比例，可将DNA损伤程度分为5级：0级，无损伤(<5%)；1级，低度损伤(5%～20%)；2级，中度损伤，(20%～40%)；3级，高度损伤，(40%～95%)；4级，重度损伤，(>95%)。
, 百拇医药
1.5 统计方法
采用Ridit分析。
2 结果
F组和Se组细胞DNA损伤程度均显著大于对照组(P<0.01)，Ridit 值分别为0.3844、0.4976和0.6501。Zn组与对照组差异无显著性(P>0.05)。F+Se+Zn组Ridit值显著高于F组(P<0.05)，F+Se组和F+Zn组Ridit值高于F组，但差异无显著性，见附表。
附表 硒、锌与氟对大鼠大脑皮层神经细胞DNA损伤的影响 组别
计数细胞
0级
1级
2级
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3级
4级
总损伤率
(%)
Ridit值
对照组
200
184
14
2
0
0
9.0
, http://www.100md.com 0.6501
F
200
85
30
44
20
21
57.5
0.3844(1)
F+Se+Zn
201
118
, http://www.100md.com
19
35
20
9
41.3
0.4684(1,2)
Se+Zn
201
138
26
24
7
6
, 百拇医药
31.3
0.5318(1，2，4)
F+Se
200
100
23
44
18
15
50.0
0.4234(1)
Se
, http://www.100md.com 201
126
25
30
14
6
37.3
0.4976(1,2)
F+Zn
200
90
35
39
, 百拇医药
18
18
55.0
0.4035(1,4)
Zn
200
180
16
3
1
0
10.0
0.6407(2，3)
, 百拇医药
注：与对照组相比(1)P<0.01；与F组相比(2)P<0.01；与F+Se+Zn组相比(3)P<0.01 (4)P<0.05
3 讨论
单细胞凝胶电泳可检测DNA单链断裂，是一种敏感且快速的检测化学物致DNA损伤的方法。本研究结果表明，氟、硒单独作用均可引起大鼠大脑皮层神经细胞DNA损伤，氟的影响更为严重，而锌对细胞DNA的损伤作用不明显。据报道，用碱洗脱法检测知NaF 0.1～0.2g/L可引起JHU-1细胞DNA单链断裂[3]，结合本次结果来看，5mmol/L甚至更小浓度的NaF就足以造成DNA损伤。氟对DNA的损伤既可是直接起断裂剂的作用，也可以干扰某些酶的活性起间接作用。此外，也可能与氟致脑组织脂质过氧化有关。本研究发现10μmol/L Na2SeO3可引起大鼠大脑神经细胞DNA单链断裂，Garberg等也发现体外20～50μmol/L Na2SeO3可明显诱导肝细胞DNA单链断裂[6]，而Lu的研究表明硒不但可诱导DNA单链断裂，而且紧接着激活核酸内切酶引起DNA双链断裂，最终导致细胞凋亡，该过程在硒抗肿瘤作用中可能起至关重要的作用[7]。
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本研究还发现，硒、锌单独对氟致大鼠大脑皮层神经细胞DNA损伤起到一定保护作用，但无显著性意义。而当硒、锌联合时表现出相加作用，明显地减轻了氟对DNA的损伤(P<0.01)。硒、锌可能是从不同角度发挥其保护作用，孙淑庄等认为硒有可能象硼那样与氟形成难解离的氟硒复合物[8]，而硒的抗氧化性也可能对氟毒性产生拮抗作用。由于硒的生物学效应较为复杂，其拮抗氟致DNA损伤机理值得进一步深入研究。目前已经发现的4种核酸内切酶中DNAase-1 NuC-1及NuC-18均可受到锌的抑制，当细胞内钙离子浓度升高时，锌对细胞内DNAase的抑制作用减弱[9]，此外，细胞内有多种酶的活性依赖锌的存在，锌可稳定某些酶的结构，调节其活性，锌以上两方面的作用对于氟致细胞内酶结构或活性异常改变从而引起DNA损伤具有积极意义。
基金项目：“九.五”国家医学科技攻关项目(No.96-906-04-02)
, 百拇医药
作者简介：陈军，男，博士研究生
参考文献
1，张本忠，吴德生.无机氟对大小鼠胚胎中脑细胞增殖和分化的影响.中国地方病学杂志，1998，13(3)：129—131
2，独立.慢性氟中毒对人胎脑发育的影响.中华病理学杂志，1992，21(4)：58—71
3，马道新，陈正岗，刘春生，等.氟化物遗传毒性的分子生物学研究进展.国外医学医学地理学分册，1999，20(1)：1—9
4，Dildy JE,Leslie SW.Ethanol inhibits NMDA-induced increase in free intracellular Ca2+ in dissociated brain cells.Brain Res,1989,499(31):383—389
, 百拇医药
5，Singh NP,Mccoy MT.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res,1988,175:184—189
6，Garberg P, Stahl A,Warholm M,et al.Studies of the role DNA fragmentation in selenium toxicity.Biochem Pharmacol,1988,37:3401—3406
7，Lu JX,Kaeck M,Jiang C,et al.Selenium induction of DNA strand breaks and apoptosis in mouse leukemic L1210 cells.Biochem Pharmacol,1994,47(9):1531—1535
8，孙淑庄，修瑞琴，邓海，等.氟硒联合毒性作用的研究.卫生研究，1996，25(1)：20—23
9，岑小波，王瑞淑.锌在细胞凋亡中的调控作用及其分子机制.国外医学卫生学分册，1999，26(1)：22—25
(2000-03-10收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学环境卫生教研室，武汉 430030
关键词：氟；硒；锌；DNA损伤；大脑皮层神经细胞
卫生研究000410 摘要：为研究氟对大鼠大脑皮层神经细胞的DNA损伤作用及硒、锌单独及联合作用对其的影响，对大鼠体外染毒后采用单细胞凝胶电泳技术检测DNA单链断裂。结果显示单独加氟、硒组DNA损伤程度显著大于对照组(P<0.01)，且氟的影响更为严重，氟硒组和氟锌组DNA损伤程度小于氟组，但差异无显著性意义，氟硒锌组DNA损伤程度显著低于氟组(P<0.05)。提示氟、硒单独作用均造成大脑皮层神经细胞DNA损伤，硒锌联合可明显拮抗氟对DNA的损伤作用。
中图分类号：R599 Q593.2 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)04-0216-02
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Effects of selenium and zinc on the DNA damage caused by
fluoride in pallium neural cells of rats
Chen Jun, Chen Xuemin, Yang Kedi
(Department of Environmental Health,Tongji Medical University,Wuhan 430030,China)
Abstract：To investigate the effects of fluoride on DNA damage as well as the effects of selenium and zinc against fluoride respectively or jointly in pallium neural cells of rats ,single cell gel electrophoresis was used to detect the DNA damage of neural cells prepared in vitro.The results showed that the degree of DNA damage in the fluoride group and the selenium group were significantly greater than that in control group(P<0～01).The damage in the fluoride group was even more serious.The damage in the fluoride+selenium group and fluoride+zinc group was slighter than that in the fluoride group but with no significant difference.The extent of DNA damage in the fluoride+selenium+zinc group was significantly slighter than that in the fluoride group(P<0～05).It suggested that fluoride and selenium could induce DNA damage in pallium neural cells of rats respectively.Moreover, the joint antagonistic effect of selenium and zinc against fluoride was more obvious.
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Key words:fluoride, selenium, zinc, DNA damage,pallium neural cells
氟的毒性作用涉及到全身各器官(组织)，氟对中枢神经系统可产生直接毒性作用，如对脑细胞增殖和分化造成不良影响[1]，大脑中氟蓄积及神经细胞发育迟缓[2]。研究表明，氟的遗传毒性与其引起DNA损伤有密切关系[3]，本实验采用单细胞凝胶电泳技术(SCGE or Comet Assay)研究了氟引起的大鼠大脑皮层神经细胞DNA损伤，同时观察了硒、锌单独及联合作用对这种损伤的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
胰蛋白酶(Difco)，牛血清白蛋白(BM)，低熔点琼脂糖(low melting point agrose,Sangon),Triton X-100(Sigma),Tris(进口分装)，肌氨酸钠(sodium sarcosinate SLS,进口分装)，其它试剂为国产分析纯。水平电泳槽和电泳仪(北京六一仪器厂)，Olympus BX60荧光显微镜(日本)，Shel CO2培养箱(美国)。
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1.2 大脑皮层神经细胞悬液制备
参照Dildy的方法稍作改进[4]。将(210±15)g雄性SD大鼠断头处死，取出大脑，剥去脑膜，置于pH7.4的冰Hanks液中清洗2次。用眼科剪剪碎脑组织后加入0.125%胰蛋白酶，置于37℃水浴中消化20分钟，边消化边轻微振摇。然后用含0.5%牛血清白蛋白的RPMI 1640培养基终止消化，经250目筛网过滤，滤液1500r/min离心5分钟后弃上清，用Hanks液洗涤细胞1次，最后用RPMI 1640培养基制成约106个/ml的细胞悬液。经台盼蓝染色，细胞存活率不低于95%。将细胞置于CO2培养箱中37℃培养3小时，pH74 PBS清洗细胞2次后仍以PBS悬浮细胞。
1.3 实验分组与处理
取上述细胞悬液850μl为一份，每组4份共8组，即对照组、F、F+Se+Zn、Se+Zn、F+Se、Se、F+Zn、Zn组，加入受试物至1ml,NaF、Na2SeO3、ZnSO4各自终浓度分别为5mmol/L、10μmol/L和1.5mmol/L。37℃温育2小时，离心去上清，用PBS清洗一次，再将细胞悬于100μl PBS中待用。
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1.4 单细胞凝胶电泳
按Singh方法在磨砂载玻片上铺胶[5]。第1层为0.7%正常熔点琼脂糖75μl，第2层为混有10μl细胞悬液的0.7%低熔点琼脂糖75μl，第3层为0.7%低熔点琼脂糖75μl。待胶完全凝固后放入预冷的细胞裂解液中(2.5mol/L NaCl,100mmol/L EDTA-Na2,10mmol/L Tris,1% SLS,新鲜加入的1% Triton X-100,10% DMSO)1小时，然后取出玻片置于盛有电泳液(300mmol/L NaOH,1mmol/L EDTA-Na2， pH12)的电泳槽内浸泡20分钟。接通电源，在100mA、25V条件下电泳40分钟后取出玻片，用中和液(0.4mol/L Tris,pH7～5)洗3次。滴加2mg/L吖啶橙75μl染色，盖上盖玻片。尽快在荧光显微镜下观察，每片检查计数50个细胞。镜下受到损伤的DNA出现拖尾现象，根据拖尾DNA的量占细胞总DNA的比例，可将DNA损伤程度分为5级：0级，无损伤(<5%)；1级，低度损伤(5%～20%)；2级，中度损伤，(20%～40%)；3级，高度损伤，(40%～95%)；4级，重度损伤，(>95%)。
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1.5 统计方法
采用Ridit分析。
2 结果
F组和Se组细胞DNA损伤程度均显著大于对照组(P<0.01)，Ridit 值分别为0.3844、0.4976和0.6501。Zn组与对照组差异无显著性(P>0.05)。F+Se+Zn组Ridit值显著高于F组(P<0.05)，F+Se组和F+Zn组Ridit值高于F组，但差异无显著性，见附表。
附表 硒、锌与氟对大鼠大脑皮层神经细胞DNA损伤的影响 组别
计数细胞
0级
1级
2级
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3级
4级
总损伤率
(%)
Ridit值
对照组
200
184
14
2
0
0
9.0
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F
200
85
30
44
20
21
57.5
0.3844(1)
F+Se+Zn
201
118
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19
35
20
9
41.3
0.4684(1,2)
Se+Zn
201
138
26
24
7
6
, 百拇医药
31.3
0.5318(1，2，4)
F+Se
200
100
23
44
18
15
50.0
0.4234(1)
Se
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126
25
30
14
6
37.3
0.4976(1,2)
F+Zn
200
90
35
39
, 百拇医药
18
18
55.0
0.4035(1,4)
Zn
200
180
16
3
1
0
10.0
0.6407(2，3)
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注：与对照组相比(1)P<0.01；与F组相比(2)P<0.01；与F+Se+Zn组相比(3)P<0.01 (4)P<0.05
3 讨论
单细胞凝胶电泳可检测DNA单链断裂，是一种敏感且快速的检测化学物致DNA损伤的方法。本研究结果表明，氟、硒单独作用均可引起大鼠大脑皮层神经细胞DNA损伤，氟的影响更为严重，而锌对细胞DNA的损伤作用不明显。据报道，用碱洗脱法检测知NaF 0.1～0.2g/L可引起JHU-1细胞DNA单链断裂[3]，结合本次结果来看，5mmol/L甚至更小浓度的NaF就足以造成DNA损伤。氟对DNA的损伤既可是直接起断裂剂的作用，也可以干扰某些酶的活性起间接作用。此外，也可能与氟致脑组织脂质过氧化有关。本研究发现10μmol/L Na2SeO3可引起大鼠大脑神经细胞DNA单链断裂，Garberg等也发现体外20～50μmol/L Na2SeO3可明显诱导肝细胞DNA单链断裂[6]，而Lu的研究表明硒不但可诱导DNA单链断裂，而且紧接着激活核酸内切酶引起DNA双链断裂，最终导致细胞凋亡，该过程在硒抗肿瘤作用中可能起至关重要的作用[7]。
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本研究还发现，硒、锌单独对氟致大鼠大脑皮层神经细胞DNA损伤起到一定保护作用，但无显著性意义。而当硒、锌联合时表现出相加作用，明显地减轻了氟对DNA的损伤(P<0.01)。硒、锌可能是从不同角度发挥其保护作用，孙淑庄等认为硒有可能象硼那样与氟形成难解离的氟硒复合物[8]，而硒的抗氧化性也可能对氟毒性产生拮抗作用。由于硒的生物学效应较为复杂，其拮抗氟致DNA损伤机理值得进一步深入研究。目前已经发现的4种核酸内切酶中DNAase-1 NuC-1及NuC-18均可受到锌的抑制，当细胞内钙离子浓度升高时，锌对细胞内DNAase的抑制作用减弱[9]，此外，细胞内有多种酶的活性依赖锌的存在，锌可稳定某些酶的结构，调节其活性，锌以上两方面的作用对于氟致细胞内酶结构或活性异常改变从而引起DNA损伤具有积极意义。
基金项目：“九.五”国家医学科技攻关项目(No.96-906-04-02)
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作者简介：陈军，男，博士研究生
参考文献
1，张本忠，吴德生.无机氟对大小鼠胚胎中脑细胞增殖和分化的影响.中国地方病学杂志，1998，13(3)：129—131
2，独立.慢性氟中毒对人胎脑发育的影响.中华病理学杂志，1992，21(4)：58—71
3，马道新，陈正岗，刘春生，等.氟化物遗传毒性的分子生物学研究进展.国外医学医学地理学分册，1999，20(1)：1—9
4，Dildy JE,Leslie SW.Ethanol inhibits NMDA-induced increase in free intracellular Ca2+ in dissociated brain cells.Brain Res,1989,499(31):383—389
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5，Singh NP,Mccoy MT.A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Res,1988,175:184—189
6，Garberg P, Stahl A,Warholm M,et al.Studies of the role DNA fragmentation in selenium toxicity.Biochem Pharmacol,1988,37:3401—3406
7，Lu JX,Kaeck M,Jiang C,et al.Selenium induction of DNA strand breaks and apoptosis in mouse leukemic L1210 cells.Biochem Pharmacol,1994,47(9):1531—1535
8，孙淑庄，修瑞琴，邓海，等.氟硒联合毒性作用的研究.卫生研究，1996，25(1)：20—23
9，岑小波，王瑞淑.锌在细胞凋亡中的调控作用及其分子机制.国外医学卫生学分册，1999，26(1)：22—25
(2000-03-10收稿), 百拇医药