EB病毒转化的永生性人B淋巴母细胞中MTHFR基因的表达
作者：朱慧萍 赵如冰 李燕 李竹
单位：李燕(中国预防医学科学院病毒研究所)；朱慧萍 赵如冰 李竹(北京大学生育健康研究所，北京 100083)
关键词：EB病毒转化；B淋巴母细胞；N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)
卫生研究000402 摘要：为检测用EB病毒转化建立的永生性人B淋巴母细胞株中N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的表达及其cDNA序列，用EB病毒转化人外周血B淋巴细胞，建立永生性细胞株后，从培养细胞中提取总RNA，用RT-PCR法扩增MTHFR基因cDNA的不同片段，进行PAGE电泳分析和cDNA序列测定。结果显示永生性人B淋巴母细胞中有MTHFR基因表达，其cDNA序列与文献报道的人肝脏MTHFR基因cDNA序列一致。
中图分类号：Q754 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1000-8020(2000)04-0196-03
MTHFR gene expression in EB virus transformed human B lymphoblasts
Zhu Huiping, Zhao Rubing, Li Yan, Li Zhu
(Institute of Reproductive Health, Peking University,Beijing 100083,China)
Abstract：In order to detect the expression of N5, N10-methylene-tetra hydrofolate reductase(MTHFR) gene in Epstein-Barr virus(EBV) transformed human B lymphoblast, as well as the cDNA sequence, human peripheral blood was transformed by EBV to build B lymphoblast cell line. Total RNA was isolated from the cell culture. Variant segments of MTHFR cDNA were amplified using RT-PCR protocol and analysed by polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE). One of the cDNA segments was sequenced. Results showed MTHFR gene was expressed in human B lymphoblast cell line. The cDNA sequence was almost the same as that of human liver cDNA from Genbank.
, 百拇医药
Key words:EBV transformation, B lymphoblast, N5, N10-methylene-tetra hydrofolate reductase(MTHFR)
N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(N5,N10-methylene-tetra hydrofolate reductase, MTHFR)是一种重要的一碳单位代谢酶，其基因表达异常和酶活性缺陷可引起体内同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)蓄积[1]。近来有多项研究表明，MTHFR与心血管系统疾病和严重出生缺陷(如神经管畸形)的发生有关，尤其是第677位核苷酸C→T的多态性，可以作为同型半胱氨酸代谢的一种生物标志物[2～6]。标本的采集和保存是分子流行病学研究中的重要课题，本研究的目的旨在检测经EB病毒转化生成的永生性B淋巴母细胞株中MTHFR基因的表达，并比较其cDNA序列与文献报道的人肝脏MTHFR cDNA序列有无差别[7]，从而初步探讨用这种细胞株建立用于流行病学研究的标本库的可行性。
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1 材料与方法
1.1 外周血B淋巴细胞分离
常规取肘静脉血5～10 ml置于K2-EDTA抗凝管中，用等体积的PBS缓冲液(室温，pH7.4)稀释抗凝血；将稀释的血液混匀加到等体积的淋巴细胞分离液表面(室温)；室温离心1800r/min，20min；吸去上层液体(至离淋巴细胞层3mm处)，小心转移淋巴细胞层和一部分淋巴细胞分离液至一新离心管中；在离心管中加满PBS缓冲液，轻轻混匀，室温下离心10min。
1.2 EB病毒转化B淋巴细胞
弃去PBS缓冲液，用1 ml EB病毒储存液重悬淋巴细胞沉淀物，将混合物转移至细胞培养管，37℃孵育1 h；加入4 ml RPMI培养基(含15%胎牛血清和2μg/ml环孢菌素)，继续孵育；待细胞生长至最旺盛时期(培养基呈透明的黄色且可见到许多细胞团块，镜下观察细胞透明形状不规则，成簇生长)，将细胞转移至装有10 ml培养基的25 cm2培养瓶；再培养至生长旺盛期，转移至75 cm2 培养瓶，加入培养基使总体积达到40 ml；继续培养1～2天；一部分细胞置于液氮中保存。
, 百拇医药
1.3 用RT-PCR检测MTHFR的表达
用Qiagen RNeasy Kit和QIAshredder制备培养细胞的总RNA，紫外分光光度计测OD260/OD280值定量，取1μg总RNA进行反转录反应；反转录产物进行PCR扩增，引物由美国疾病控制与预防中心欧晋义博士惠赠，引物编号为337/372、339/372、425/372、368/372，引物序列见附表，PCR反应条件：95℃5min；[95℃ 15s，62℃ 35s，72℃ 30s]×36；72℃10min。
附表 用于反转录PCR的引物序列 引物序号
引物序列
NOLG337
5’-GAC AAG GAG ACC TCC TCC ATG ATG-3'
, 百拇医药
NOLG339
5’-GTG ATT GAG CCA ATC AAA GAC A-3'
NOLG368
5’-AAT TCC GGA GCC ATG GTG AAC GAA-3'
NOLG425
5’-GAA GCA GGG AGC TTT GAG GCT GAC CT-3'
NOLG372
5’-GGA CTT GCT CTT CAG GTA GAA GAG GTA-3'
1.4 PCR产物的纯化和序列测定
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用凝胶破碎法回收1298bp(368/372)的片段；Promega PCR产物纯化试剂盒纯化；用ABI 377型自动测序仪(Perkin Elmer)进行序列测定，测序由美国疾病控制与预防中心环境健康中心(NCEH，CDC)分子遗传学实验室协助完成；测序结果输入计算机，用PCGENE软件进行序列拼接和比较分析。
2 结果
2.1 B淋巴细胞转化
倒置显微镜镜下观察(Olympus,20×)，可见B细胞体积增大，迅速分裂成团，茂密生长，出现增生集落(图1a)；建立的细胞系可传代，能够连续培养，表明B淋巴细胞转化成功；图1b:未经转化的B细胞，培养2周后全部死亡。
a EB病毒转化成功的人B淋巴母细胞
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b 对照：未经转化的B淋巴细胞
图1 B淋巴细胞转化—倒置显微镜下观察(20×)
2.2 RT-PCR
4条扩增片段电泳图见图2，其分子量大小均符合引物设计时的预期值。
2.3 cDNA序列
长度为1298bp的扩增产物(368/372)经纯化后用ABI 377型自动测序仪进行分段的序列测定，拼接分析共得到1251个碱基的序列(图3)，与Goyette发表的序列比较[7]，序列一致性为99.8%。
图2 B淋巴母细胞株MTHFR mRNA的检测(RT-PCR)(8% PAGE，100V，45min) ID LYMPH
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PRELIMINARY；
cDNA;
1252 BP.
SQ
SEQUENCE
1252 BP；
281 A；
365 C；
366 G；
240 T；
GCCATGGTGA
ACGAAGCCAG
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AGGAAACAGC
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CCTGCTTGGA
GGGCAGTGCC
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GTGAGAGCTC
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, 百拇医药
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, 百拇医药
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, 百拇医药
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, 百拇医药
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, 百拇医药
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, 百拇医药
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, 百拇医药
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GTC
图3 人B淋巴母细胞MTHFR cDNA序列(部分)
3 讨论
本研究对EB病毒转化形成的永生性B淋巴母细胞株中MTHFR基因的表达进行检测，发现这种细胞株中MTHFR表达，且序列与文献报道和Genbank收录的人肝脏MTHFR cDNA序列基本一致，揭示EB病毒转化不会阻止MTHFR的表达，亦未改变其cDNA序列，但表达量是否有变化还需进一步证实，此外还应进一步查明EB病毒转化前后MTHFR酶活性的变化，以便正确地评估这种细胞株在MTHFR与疾病关系研究中的意义和价值。
分子流行病学是一门新兴的边缘学科，其主要特点是将分子生物学的方法应用于流行病学研究中，以“生物标志物”作为主要研究指标，探索疾病病因的分子机制和流行特点。分子流行病学方法除了用于对感染性疾病的研究外，也用于研究疾病的遗传易感性。标本库的建立是分子流行病学研究的重要内容和工作基础。由于样本量大，测量指标多，且不同指标对样品的要求可能不同，因此寻找一种有效、简便的标本收集方法十分重要。此外，随着研究的深入，必然会出现新的生物标志物，因此能长期保存的标本更有意义。EB病毒转化后的B淋巴母细胞可持续传代，且其它生化和分子特性变化不大，可作为标本库建立的供选方案之一。
, http://www.100md.com
基金项目：国家自然科学基金(No.39800130),国家“八六三”项目(No.863-102-10)
作者简介：朱慧萍，女，博士，讲师
参考文献
1，Whitehead AS, Gallagher P, Mills JL, et al. A genetic defect in 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase in neural tube defects. Q J Med, 1995,88：763—766
2，Frosst P, Blom HJ, Milos R, et al. A candidate genetic resk factors for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nat Genet, 1995,10：111—113
, http://www.100md.com
3，Fletcher O, Kessling AM. MTHFR association with ateriosclerotic vascular disease?Hum Genet, 1998,103：11—21
4，Motulsky AG. Nutritional ecogenetics:homocysteine-related arteriosclerotic vascular disease, neural tube defects, and folic acid. Am J Hum Genet, 1996,58：17—20
5，Dudman NPB, Guo XW, Gordon RB, et al. Human homocysteine catabolism:three major pathways and their relevance to development of arterial occlusive disease. J Nutr, 1996,126：1295s—1300s
, 百拇医药
6，Khoury MJ, Flanders WD. Non-traditional epidemiologic approaches in the analysis of gene-environment interaction:case-control studies with no controls. Am J Epidemiol, 1996,144：207—213
7，Goyette P, Sumner JS, Milos R, et al. Human methylene-tetrahydrofolate reductase:isolation of cDNA, mapping and mutation identification. Nat Genet, 1994,7：195—200
(2000-01-14收稿), 百拇医药
单位：李燕(中国预防医学科学院病毒研究所)；朱慧萍 赵如冰 李竹(北京大学生育健康研究所，北京 100083)
关键词：EB病毒转化；B淋巴母细胞；N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)
卫生研究000402 摘要：为检测用EB病毒转化建立的永生性人B淋巴母细胞株中N5，N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因的表达及其cDNA序列，用EB病毒转化人外周血B淋巴细胞，建立永生性细胞株后，从培养细胞中提取总RNA，用RT-PCR法扩增MTHFR基因cDNA的不同片段，进行PAGE电泳分析和cDNA序列测定。结果显示永生性人B淋巴母细胞中有MTHFR基因表达，其cDNA序列与文献报道的人肝脏MTHFR基因cDNA序列一致。
中图分类号：Q754 文献标识码：A
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文章编号：1000-8020(2000)04-0196-03
MTHFR gene expression in EB virus transformed human B lymphoblasts
Zhu Huiping, Zhao Rubing, Li Yan, Li Zhu
(Institute of Reproductive Health, Peking University,Beijing 100083,China)
Abstract：In order to detect the expression of N5, N10-methylene-tetra hydrofolate reductase(MTHFR) gene in Epstein-Barr virus(EBV) transformed human B lymphoblast, as well as the cDNA sequence, human peripheral blood was transformed by EBV to build B lymphoblast cell line. Total RNA was isolated from the cell culture. Variant segments of MTHFR cDNA were amplified using RT-PCR protocol and analysed by polyacrylamide gel electrophoresis(PAGE). One of the cDNA segments was sequenced. Results showed MTHFR gene was expressed in human B lymphoblast cell line. The cDNA sequence was almost the same as that of human liver cDNA from Genbank.
, 百拇医药
Key words:EBV transformation, B lymphoblast, N5, N10-methylene-tetra hydrofolate reductase(MTHFR)
N5,N10-亚甲基四氢叶酸还原酶(N5,N10-methylene-tetra hydrofolate reductase, MTHFR)是一种重要的一碳单位代谢酶，其基因表达异常和酶活性缺陷可引起体内同型半胱氨酸(homocysteine, HCY)蓄积[1]。近来有多项研究表明，MTHFR与心血管系统疾病和严重出生缺陷(如神经管畸形)的发生有关，尤其是第677位核苷酸C→T的多态性，可以作为同型半胱氨酸代谢的一种生物标志物[2～6]。标本的采集和保存是分子流行病学研究中的重要课题，本研究的目的旨在检测经EB病毒转化生成的永生性B淋巴母细胞株中MTHFR基因的表达，并比较其cDNA序列与文献报道的人肝脏MTHFR cDNA序列有无差别[7]，从而初步探讨用这种细胞株建立用于流行病学研究的标本库的可行性。
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1 材料与方法
1.1 外周血B淋巴细胞分离
常规取肘静脉血5～10 ml置于K2-EDTA抗凝管中，用等体积的PBS缓冲液(室温，pH7.4)稀释抗凝血；将稀释的血液混匀加到等体积的淋巴细胞分离液表面(室温)；室温离心1800r/min，20min；吸去上层液体(至离淋巴细胞层3mm处)，小心转移淋巴细胞层和一部分淋巴细胞分离液至一新离心管中；在离心管中加满PBS缓冲液，轻轻混匀，室温下离心10min。
1.2 EB病毒转化B淋巴细胞
弃去PBS缓冲液，用1 ml EB病毒储存液重悬淋巴细胞沉淀物，将混合物转移至细胞培养管，37℃孵育1 h；加入4 ml RPMI培养基(含15%胎牛血清和2μg/ml环孢菌素)，继续孵育；待细胞生长至最旺盛时期(培养基呈透明的黄色且可见到许多细胞团块，镜下观察细胞透明形状不规则，成簇生长)，将细胞转移至装有10 ml培养基的25 cm2培养瓶；再培养至生长旺盛期，转移至75 cm2 培养瓶，加入培养基使总体积达到40 ml；继续培养1～2天；一部分细胞置于液氮中保存。
, 百拇医药
1.3 用RT-PCR检测MTHFR的表达
用Qiagen RNeasy Kit和QIAshredder制备培养细胞的总RNA，紫外分光光度计测OD260/OD280值定量，取1μg总RNA进行反转录反应；反转录产物进行PCR扩增，引物由美国疾病控制与预防中心欧晋义博士惠赠，引物编号为337/372、339/372、425/372、368/372，引物序列见附表，PCR反应条件：95℃5min；[95℃ 15s，62℃ 35s，72℃ 30s]×36；72℃10min。
附表 用于反转录PCR的引物序列 引物序号
引物序列
NOLG337
5’-GAC AAG GAG ACC TCC TCC ATG ATG-3'
, 百拇医药
NOLG339
5’-GTG ATT GAG CCA ATC AAA GAC A-3'
NOLG368
5’-AAT TCC GGA GCC ATG GTG AAC GAA-3'
NOLG425
5’-GAA GCA GGG AGC TTT GAG GCT GAC CT-3'
NOLG372
5’-GGA CTT GCT CTT CAG GTA GAA GAG GTA-3'
1.4 PCR产物的纯化和序列测定
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用凝胶破碎法回收1298bp(368/372)的片段；Promega PCR产物纯化试剂盒纯化；用ABI 377型自动测序仪(Perkin Elmer)进行序列测定，测序由美国疾病控制与预防中心环境健康中心(NCEH，CDC)分子遗传学实验室协助完成；测序结果输入计算机，用PCGENE软件进行序列拼接和比较分析。
2 结果
2.1 B淋巴细胞转化
倒置显微镜镜下观察(Olympus,20×)，可见B细胞体积增大，迅速分裂成团，茂密生长，出现增生集落(图1a)；建立的细胞系可传代，能够连续培养，表明B淋巴细胞转化成功；图1b:未经转化的B细胞，培养2周后全部死亡。
a EB病毒转化成功的人B淋巴母细胞
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b 对照：未经转化的B淋巴细胞
图1 B淋巴细胞转化—倒置显微镜下观察(20×)
2.2 RT-PCR
4条扩增片段电泳图见图2，其分子量大小均符合引物设计时的预期值。
2.3 cDNA序列
长度为1298bp的扩增产物(368/372)经纯化后用ABI 377型自动测序仪进行分段的序列测定，拼接分析共得到1251个碱基的序列(图3)，与Goyette发表的序列比较[7]，序列一致性为99.8%。
图2 B淋巴母细胞株MTHFR mRNA的检测(RT-PCR)(8% PAGE，100V，45min) ID LYMPH
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PRELIMINARY；
cDNA;
1252 BP.
SQ
SEQUENCE
1252 BP；
281 A；
365 C；
366 G；
240 T；
GCCATGGTGA
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GTTACATCTA
CCGTACCCAG
GAGTGGGACG
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CTTCCCCTGC
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CTGAAGGACT
ACTACCTCTT
CTACCTGAAG
, 百拇医药
AGCAAGTCCC
CCAAGGAGGA
GTC
图3 人B淋巴母细胞MTHFR cDNA序列(部分)
3 讨论
本研究对EB病毒转化形成的永生性B淋巴母细胞株中MTHFR基因的表达进行检测，发现这种细胞株中MTHFR表达，且序列与文献报道和Genbank收录的人肝脏MTHFR cDNA序列基本一致，揭示EB病毒转化不会阻止MTHFR的表达，亦未改变其cDNA序列，但表达量是否有变化还需进一步证实，此外还应进一步查明EB病毒转化前后MTHFR酶活性的变化，以便正确地评估这种细胞株在MTHFR与疾病关系研究中的意义和价值。
分子流行病学是一门新兴的边缘学科，其主要特点是将分子生物学的方法应用于流行病学研究中，以“生物标志物”作为主要研究指标，探索疾病病因的分子机制和流行特点。分子流行病学方法除了用于对感染性疾病的研究外，也用于研究疾病的遗传易感性。标本库的建立是分子流行病学研究的重要内容和工作基础。由于样本量大，测量指标多，且不同指标对样品的要求可能不同，因此寻找一种有效、简便的标本收集方法十分重要。此外，随着研究的深入，必然会出现新的生物标志物，因此能长期保存的标本更有意义。EB病毒转化后的B淋巴母细胞可持续传代，且其它生化和分子特性变化不大，可作为标本库建立的供选方案之一。
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基金项目：国家自然科学基金(No.39800130),国家“八六三”项目(No.863-102-10)
作者简介：朱慧萍，女，博士，讲师
参考文献
1，Whitehead AS, Gallagher P, Mills JL, et al. A genetic defect in 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase in neural tube defects. Q J Med, 1995,88：763—766
2，Frosst P, Blom HJ, Milos R, et al. A candidate genetic resk factors for vascular disease: a common mutation in methylenetetrahydrofolate reductase. Nat Genet, 1995,10：111—113
, http://www.100md.com
3，Fletcher O, Kessling AM. MTHFR association with ateriosclerotic vascular disease?Hum Genet, 1998,103：11—21
4，Motulsky AG. Nutritional ecogenetics:homocysteine-related arteriosclerotic vascular disease, neural tube defects, and folic acid. Am J Hum Genet, 1996,58：17—20
5，Dudman NPB, Guo XW, Gordon RB, et al. Human homocysteine catabolism:three major pathways and their relevance to development of arterial occlusive disease. J Nutr, 1996,126：1295s—1300s
, 百拇医药
6，Khoury MJ, Flanders WD. Non-traditional epidemiologic approaches in the analysis of gene-environment interaction:case-control studies with no controls. Am J Epidemiol, 1996,144：207—213
7，Goyette P, Sumner JS, Milos R, et al. Human methylene-tetrahydrofolate reductase:isolation of cDNA, mapping and mutation identification. Nat Genet, 1994,7：195—200
(2000-01-14收稿), 百拇医药