镉的免疫毒性与促肾上腺皮质激素释放因子的关系
作者：张绪超 黎大明 董书芸 张静 余贵英 蔡承铿
单位：张静(广东省卫生防疫站环卫科)；张绪超 黎大明 董书芸 余贵英 蔡承铿(中山医科大学公共卫生学院，广州 510089)
关键词：镉；免疫毒性；促肾上腺皮质激素释放因子；下丘脑-垂体-肾上腺轴
卫生研究000401 摘要：对CdCl2和CdCl2+α-hCRF(α螺旋促肾上腺皮质激素释放因子)分别染毒的SD大鼠，用[3H-TdR]掺入法测定大鼠脾T、B淋巴细胞增殖转化功能，垂体前叶细胞培养法测定中枢下丘脑和外周血浆中的CRF含量。结果表明单独染镉组有丝分裂原诱导的鼠脾T、B淋巴细胞增殖转化均受到明显抑制，具有剂量-效应关系(P<0.05)；动物下丘脑CRF含量伴随着染镉剂量升高(P<0.05)；外周血浆CRF含量各组间差异无显著性(P>0.05)。当使用拮抗剂α-hCRF后，在含镉染毒各剂量组间鼠脾T、B细胞功能抑制差异无显著性(P>0.05)；下丘脑CRF含量在各含镉联合染毒组间差异无显著性(P>0.05)，但均较对照组高(P<0.05)；外周血浆CRF水平有升高趋势。结果提示单独染镉可引起下丘脑CRF含量升高和免疫功能抑制，联合使用α-hCRF后则能部分改善镉对大鼠脾细胞的免疫功能抑制。镉对大鼠脾淋巴细胞免疫毒作用过程中存在中枢CRF介导的免疫调节机制。
, http://www.100md.com
中图分类号：Q577 O614.242 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)04-0193-03
Study on the relationship between cadmium immunotoxicity
and corticotropin-releasing factor
Zhang Xuchao, Li Daming, Dong Shuyun, Zhang Jing, et al.
(Department of Environment Health, Sun Yat-Sen University of Medical Science, Guangzhou 510089，China)
, 百拇医药
Abstract：To explore the relationship between cadmium immunotoxicity and corticotropin-releasing factor(CRF), murine T- and B- lymphocytes mitogen-induced proliferation function(3H-TdR incorporation method) and CRF levels of hypothalami and blood plasma were observed both in cadmium chloride(CdCl2) and CdCl2+α-hCRF-treated animals in vivo. In cadmium-treated animals, T and B limphocytes stimulation indexes were significantly lower than those in control(P<0.05) with a dose dependent response. And interestingly, the central CRF levels in CdCl2-treated groups were significantly higher than those in control(P<0.05), an increasing CRF level was also observed accompanied by the increase of CdCl2 level. In peripheral blood plasma, no significant difference of CRF levels was found among all groups(P>0.05). When animals were treated with CdCl2 in combination with α-hCRF, no significant difference of B-lymphocyte proliferation function existed among the α-hCRF+CdCl2 groups (P>0.05). Similar results were also observed in detecting T-lymphocyte proliferation function. Hypothalamic CRF levels among various doses of CdCl2+α-hCRF groups showed no statistical difference, but all were higher than those in the control, and peripheral CRF levels had a trend to increase in α-hCRF+CdCl2 co-administrated groups. The results suggested that CdCl2 showed an immunosuppressive action upon murine T and B lymphocytes, CdCl2 could cause central CRF increase. α-hCRF could partially reduce the cadmium immunotoxicity. Central CRF-mediated immunomodulation was shown in cadmium immunotoxical effects on murine splenic lymphocytes.
, 百拇医药
Key words:cadmium, immunotoxicity, corticotropin-releasing factor, hypothalami-pituitary-adrenal axis
许多资料均已肯定镉的免疫毒性[1，2]，但至今其免疫毒性机理仍不十分清楚。近年研究指出外源毒物可通过神经内分泌系统内部某些与免疫系统关系密切的因素(神经递质、内分泌激素等)改变来间接修饰调节免疫系统功能。其中神经内分泌调节肽促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)是机体神经-内分泌-免疫应答系统中的重要中枢信息物质[3]。本研究据此采用CdCl2及CdCl2+α-hCRF染毒SD大鼠2周，观察下丘脑及外周血浆CRF含量，及鼠脾T、B淋巴细胞增殖转化功能，探讨CRF与镉的免疫毒性的关系。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 实验动物分组
二级雄性SD大鼠，体重130～150g。
1.1.1 单独氯化镉染毒实验 SD大鼠随机分为4组，即低镉(3.34mg/kgBW)、中镉(6.69mg/kgBW)、高镉(13.39mg/kgBW)剂量组和生理盐水对照组。经口投毒3周(每周6天)后，动物取材测定中枢下丘脑和外周血浆CRF含量及鼠脾T、B淋巴细胞增殖转化功能。
1.1.2 CRF拮抗剂(α-hCRF)与CdCl2联合染毒实验 SD大鼠随机分成5组。对接受联合染毒的动物先给拮抗剂α-hCRF(一次肌肉注射5μg/d)，3天后经口给CdCl2 2周(剂量同上)，并继续给α-hCRF。设空白对照组及拮抗剂α-hCRF组。动物取材处理同单独CdCl2染毒实验组。
1.2 主要试剂
, 百拇医药
氯化镉(CdCl2)AR国产；人/鼠促肾上腺皮质激素释放因子(h/rCRF)，Sigma;α-hCRF[9—41](α-螺旋CRF)，Sigma;3H-TdR([甲基-3H]胸腺嘧啶核苷)，37MBq/ml上海产；RPMI 1640培养基，Gibco;植物血凝素(PHA),广州医药工业研究所；脂多糖(LPS)，Sigma;HEPES分离缓冲液(HDB)，pH7.3；胶原酶Ⅲ型(collagenase type Ⅲ), Sigma;胰蛋白酶(trypsin),Promega;DNase I, Promega;标准CRF储备液5×10-4 mmol/L；β-PJ孵育液；β-PJ完全培养液；125I-ACTH放免试剂盒，天津产。
1.3 实验方法
1.3.1 垂体前叶细胞培养 无菌条件下取出大鼠垂体，轻轻分离垂体前叶置于HDB缓冲液中洗涤，充分剪碎，用胶原酶、DNase Ⅰ、胰蛋白酶进行细胞解离。37℃水浴振荡约20min，至垂体小组织块不见为止。用β-PJ孵育液洗涤离心1000 r/min×10min×2次，去上清后用β-PJ完全培养液稀释成3.3×105 /ml细胞悬液加以培养。并用台盼蓝染色观察细胞活性(要求90%以上)。
, 百拇医药
1.3.2 标准CRF刺激垂体前叶细胞分泌ACTH工作曲线建立 将3.3×105 /ml的垂体前叶细胞悬液按1ml/孔加入24孔培养板，37℃、5%CO2孵育3～5天后取出，用β-PJ孵育洗涤2～3次后以1ml孵育液定容，返回培养箱继续培养1g，加入标准CRF设0.005、0.05、0.5、5.0、25 nmol/L CRF系列及PBS空白对照组。轻轻摇匀继续培养4h后，收集并测定培养液中ACTH浓度，根据CRF系列标准浓度与分泌ACTH浓度的关系建立工作曲线。
1.3.3 按Bingaman 方法取下丘脑及常规分离血浆[4]，制成冻干粉，用少许PBS溶解后同样条件下加入培养孔，根据刺激垂体前叶细胞分泌[ACTH]查得相应的[CRF]，结果计算如下：
下丘脑(或血浆)CRF含量=[CRF]×V(体积)×n(稀释倍数)×CRF分子量/下丘脑蛋白含量(或血浆体积)
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1.3.4 鼠脾T、B淋巴细胞增殖转化功能测定(3H-TdR掺入法)参照文献[5]。
刺激指数(SI)=刺激孔平均放射计数率(cpm)/
对照孔平均放射计数率(cpm)
1.4 统计分析
用SPSS统计软件包进行ONEWAY ANOVA方差分析。
2 结果
2.1 经口给CdCl2对大鼠脾T、B淋巴细胞经PHA、LPS诱导增殖转化功能影响
表1 经口给CdCl2大鼠脾T、B淋巴细胞增殖转化功能检测结果 (
±s,n=8) 剂量组
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(mg/kgBW)
B细胞
T细胞
0
2.74±0.43
3.10±0.61
3.34
1.98±0.37(1)
2.16±0.49(1)
6.69
1.54±0.27(1,2)
, 百拇医药
1.78±0.28(1,2)
13.39
1.09±0.19(1,2,3)
1.18±0.25(1，2)
注：(1)(2)(3)分别为与对照、低镉、中镉组比较，P<0.05 从表1可见，单独染镉2周后，经LPS(20μg/ml)诱导的鼠脾B淋巴细胞增殖转化能力明显低于对照组，各染镉组的刺激指数明显低于对照组(P<0.05)，且有剂量-效应关系(r=-0.8026，P<0.01)。经PHA(25μg/ml)诱导后，各染镉组与对照组比较T淋巴细胞刺激指数都有明显降低，中、高镉剂量组受抑制程度明显高于低镉剂量组(P<0.05)，有一定的剂量-效应关系(r=-0.7173，P<0.01)。说明CdCl2经口染毒可明显抑制鼠脾T、B淋巴细胞免疫功能。
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2.2 CRF-ACTH工作曲线建立
以不同剂量的标准CRF刺激离体培养的大鼠垂体前叶细胞，检测垂体合成分泌ACTH的量，一定范围内建立CRF-ACTH促分泌的工作曲线，如表2。
表2 标准CRF刺激垂体前叶细胞分泌ACTH测定结果(1)(±s,n=5) CRF
(nmol/L)
ACTH
(pmol/L)
0.000
12.05± 5.34
, 百拇医药
0.005
34.11± 6.00
0.050
57.99± 7.66
0.500
94.49± 7.41
5.000
128.50± 8.34
25.000
200.62±10.73
注：(1)经双变量对数变换得到线性回归方程为：Lg[ACTH]=0.257402 Lg(1+1000[CRF])+1.220229；t=14.391，P<0.001
, 百拇医药
2.3 单独染镉动物下丘脑及外周血浆CRF含量测定
下丘脑CRF含量在各染镉组均明显高于对照组(P<0.05)，且随着染镉剂量升高而升高。提示一定剂量镉暴露可引起动物下丘脑神经肽CRF合成分泌增加。而外周血浆CRF水平在各染镉组及对照组之间差异均无显著性(P>0.05)。
2.4 α-hCRF+CdCl2联合染毒对鼠脾T、B淋巴细胞经PHA、LPS诱导增殖转化功能影响
联合染毒后发现鼠脾B淋巴细胞增殖转化能力在各联合染毒组均明显低于α-hCRF组及空白对照组(P<0.05)，α-hCRF组与空白对照组比较差异无显著性(P>0.05)。但在α-hCRF+低、中、高镉各联合染毒组间差异无显著性(P>0.05)，提示α-hCRF可降低镉的免疫毒性。T淋巴细胞刺激指数在各联合染毒组均明显低于α-hCRF拮抗剂对照组(P<0.05);α-hCRF+中、高镉2组T淋巴细胞增殖转化能力明显低于空白对照组(P<0.05)；在联合染毒3组间仅见α-hCRF+低镉组与α-hCRF+高镉组间差异有显著性(P<0.05)。
, 百拇医药
表3 经口CdCl2染毒大鼠下丘脑和血浆CRF含量测定结果 (±s,n=8) 剂量组
(mg/kgBW)
下丘脑CRF含量
(ng/g蛋白)
血浆CRF含量
(pmol/L)
0
92.32±68.72
44.19±20.39
3.34
, 百拇医药
172.96±62.23(1)
48.45±10.07
6.69
247.36±65.34(1，2)
57.36±32.18
13.39
315.46±65.31(1，2，3)
65.06±23.19
注：(1) (2) (3)分别为与对照、低镉、中镉组比较 P<0.05表4 α-hCRF+CdCl2联合染毒大鼠脾T、B
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细胞增殖转化功能测定结果(±s) 组别
α-hCRF
剂量
(μg/d)
n
刺激指数
B细胞
T淋巴细胞
对照组
0
8
2.42±1.21
, 百拇医药
2.16±0.52
α-hCRF
5
8
2.72±0.74
2.29±0.50
α-hCRF+低镉
5
8
1.64±0.58
1.74±0.61(2)
α-hCRF+中镉
, 百拇医药
5
6
1.43±0.70(1，2)
1.56±0.58(1,2)
α-hCRF+高镉
5
8
1.19±0.46(1，2)
1.12±0.33(1,2,3)
注：(1)(2)(3)分别为与对照、α-hCRF、α-hCRF+低镉组比较，P<0.05；中镉组两样品缺失，以下同2.5 α-hCRF+CdCl2联合染毒对大鼠下丘脑及外周血浆CRF含量的影响
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表5 α-hCRF+CdCl2联合染毒大鼠下丘脑及外周血浆CRF含量测定结果 (±s) 组别
α-hCRF
剂量
(μg/d)
n
下丘脑CRF含量
(ng/g蛋白)
血浆CRF含量
(pmol/L)
对照组
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0
8
79.70±23.60
39.68±20.72
α-hCRF
5
8
139.86±21.90(1)
25.04±17.47
α-hCRF+低镉
5
8
, 百拇医药
142.72±29.02(1)
95.69±49.13(1，2)
α-hCRF+中镉
5
6
148.86±31.57(1)
64.62±37.48(2)
α-hCRF+高镉
5
8
131.62±42.70(1)
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77.75±40.64(1,2)
注：(1)(2)分别为与对照、α-hCRF组比较，P<0.05 表5可见，各联合染毒组及α-hCRF组动物下丘脑CRF含量均明显高于空白对照组(P<0.05)。但α-hCRF+低、中、高镉各联合染毒组间差异无显著性(P>0.05)。外周血浆CRF水平，在α-hCRF+低、中、高镉各组均高于α-hCRF组(P<0.05)，低、高镉+α-hCRF组高于空白对照组(P<0.05)，提示使用α-hCRF后外周血中CRF含量有升高趋势。
3 讨论
自Besedovsky(1977)首次提出神经-内分泌-免疫调节假说以来[6]，在大量研究基础上形成了神经内分泌免疫学说体系。研究表明下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPAaxis)和交感神经系统(SNS)-肾上腺髓质轴与机体免疫联系密切[3]。其中CRF是调节上述两轴的重要中枢信息物质，主要由下丘脑室旁核和视上核分泌。本研究着重从内分泌角度探讨了镉的免疫毒性与神经肽CRF的关系。
, 百拇医药
结果表明CdCl2染毒明显抑制有丝分裂原诱导脾T、B淋巴细胞增殖转化功能。同时发现染镉组下丘脑CRF含量均高于对照组(P<0.05)，并伴随着镉剂量升高，而对血浆CRF水平无明显影响。可见镉影响中枢神经系统，引起神经-内分泌-免疫轴中的中枢信息物质CRF在下丘脑的合成增加，免疫细胞功能同时下调。CRF的拮抗剂α-hCRF是正常结构CRF的竞争性拮抗剂，可与CRF受体结合但并不表现CRF样生物活性[7]。当用α-hCRF与镉联合染毒后，B淋巴细胞功能抑制程度不再有伴随镉剂量的差异，比较单独染镉时B淋巴细胞功能抑制随染镉剂量升高而加重，可见α-hCRF阻断了不同剂量镉抑制B淋巴细胞功能的差异。单给α-hCRF5μg/d对脾淋巴细胞功能并无影响，而联合镉染毒时，α-hCRF能拮抗一定的镉免疫毒性。α-hCRF+中镉与α-hCRF+低、高镉组T淋巴细胞功能抑制无统计学差异，仅低镉+α-hCRF与高镉+α-hCRF组间有统计学差别，表明T淋巴细胞对镉耐受性可能较B淋巴细胞差一些。资料表明CRF是与其受体结合发挥作用的[8]。本研究中各联合染毒组中枢CRF无差异性升高，可能是各组都应用α-hCRF后，降低HPA轴或SNS-髓质轴功能，反馈引起中枢CRF合成分泌无差异性升高。血浆CRF水平在拮抗剂使用后有升高趋势，可能为α-hCRF竞争性阻断CRF受体而使游离CRF升高之故，因在外周组织也有CRF受体及CRF结合蛋白分布。α-hCRF减轻镉对T、B淋巴细胞免疫功能抑制，进一步说明下丘脑CRF含量升高介导了镉抑制免疫细胞功能。
, 百拇医药
外源物质除了直接作用于免疫系统，也可通过影响中枢CRF的合成分泌，激活HPA轴或/和SNS-髓质轴引起儿茶酚胺释放增多。继而经受体信号系统对免疫细胞进行负调节，即免疫抑制[9]。在本室以相同镉剂量染毒时，曾观察到大鼠血浆去甲肾上腺素(NE)肾上腺素(E)水平分别为(41.7±10.6)和(252.0±89.7)pg/ml，在高镉(13.36mg/kg BW)组分别升高至(202.2±129.8)和(455.0±193.5)pg/ml。提示暴露于一定剂量的镉可升高大鼠血浆NE、E水平。本研究观察到镉的免疫毒性中存在中枢CRF调节作用，与HPA轴活化引起免疫抑制的报道一致[10]。可见，镉免疫毒性中存在CRF免疫修饰调节，后者通过儿茶酚胺修饰免疫功能。
基金项目：国家自然科学基金(No.39570626)
作者简介：张绪超，男，博士研究生
, 百拇医药 参考文献
1，Bernier J, Brousseau P, Krzystyniak K, et al. Immunotoxicity of heavy metals indeletion to great lakes. Eviron Health Respect,1995,103(Sup19):23—24
2，黎大明，陈成章.镉对免疫功能的影响.环境与健康杂志，1990，7(3)：142
3，Fuchs BA, Sanders VM. The role of brain-immune interaction in immunotoxicology. Critical Rev Toxicol,1994,24(2):151—176
4，Bingaman EW， Magnuson DJ, Gray TS, et al. Androgen inhibits the increases in hypothalamic corticotropin-releasing hormone(CRH) and CRH-immunoreactivity following gonadectomy. Neuroendocrinology,1994,59(3)：228—234
, 百拇医药
5，薛彬.免疫毒理学实验技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995，22
6，Besedovsky HO, Sorkin E. Network of immunoneuroendocr-ineinteraction. Clin Exp Immunol,1977,27:1
7，Rivier J, Rivier C, Vale W. Synthetic competitive antagonists of corticotropin-releasing factor:effect on ACTH secretion in rat. Science,1984,224:889
8，de Souza EB. Corticotropin releasing factor receptors:phy-siology, pharmacology, biochemistry and role in central nervous system and immune disorders. Psychoneuroendocrinology, 1995,20(8):789—819
, http://www.100md.com
9，Kammer GM. The adenylate cyclase-cAMP-protein kinase A pathway and regulation of the immune response. Immunol Today,1988,9(718):222
10，Labeur MS, Ayzt E, Wiegers GJ, et al. Long-term intracerebroventricular corticotropin-releasing hormone administration induces distinct changes in rat splenocyte activation and cytokine expression. Endocrinology, 1995,136:2678—2688
(1999-11-01收稿), http://www.100md.com
单位：张静(广东省卫生防疫站环卫科)；张绪超 黎大明 董书芸 余贵英 蔡承铿(中山医科大学公共卫生学院，广州 510089)
关键词：镉；免疫毒性；促肾上腺皮质激素释放因子；下丘脑-垂体-肾上腺轴
卫生研究000401 摘要：对CdCl2和CdCl2+α-hCRF(α螺旋促肾上腺皮质激素释放因子)分别染毒的SD大鼠，用[3H-TdR]掺入法测定大鼠脾T、B淋巴细胞增殖转化功能，垂体前叶细胞培养法测定中枢下丘脑和外周血浆中的CRF含量。结果表明单独染镉组有丝分裂原诱导的鼠脾T、B淋巴细胞增殖转化均受到明显抑制，具有剂量-效应关系(P<0.05)；动物下丘脑CRF含量伴随着染镉剂量升高(P<0.05)；外周血浆CRF含量各组间差异无显著性(P>0.05)。当使用拮抗剂α-hCRF后，在含镉染毒各剂量组间鼠脾T、B细胞功能抑制差异无显著性(P>0.05)；下丘脑CRF含量在各含镉联合染毒组间差异无显著性(P>0.05)，但均较对照组高(P<0.05)；外周血浆CRF水平有升高趋势。结果提示单独染镉可引起下丘脑CRF含量升高和免疫功能抑制，联合使用α-hCRF后则能部分改善镉对大鼠脾细胞的免疫功能抑制。镉对大鼠脾淋巴细胞免疫毒作用过程中存在中枢CRF介导的免疫调节机制。
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中图分类号：Q577 O614.242 文献标识码：A
文章编号：1000-8020(2000)04-0193-03
Study on the relationship between cadmium immunotoxicity
and corticotropin-releasing factor
Zhang Xuchao, Li Daming, Dong Shuyun, Zhang Jing, et al.
(Department of Environment Health, Sun Yat-Sen University of Medical Science, Guangzhou 510089，China)
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Abstract：To explore the relationship between cadmium immunotoxicity and corticotropin-releasing factor(CRF), murine T- and B- lymphocytes mitogen-induced proliferation function(3H-TdR incorporation method) and CRF levels of hypothalami and blood plasma were observed both in cadmium chloride(CdCl2) and CdCl2+α-hCRF-treated animals in vivo. In cadmium-treated animals, T and B limphocytes stimulation indexes were significantly lower than those in control(P<0.05) with a dose dependent response. And interestingly, the central CRF levels in CdCl2-treated groups were significantly higher than those in control(P<0.05), an increasing CRF level was also observed accompanied by the increase of CdCl2 level. In peripheral blood plasma, no significant difference of CRF levels was found among all groups(P>0.05). When animals were treated with CdCl2 in combination with α-hCRF, no significant difference of B-lymphocyte proliferation function existed among the α-hCRF+CdCl2 groups (P>0.05). Similar results were also observed in detecting T-lymphocyte proliferation function. Hypothalamic CRF levels among various doses of CdCl2+α-hCRF groups showed no statistical difference, but all were higher than those in the control, and peripheral CRF levels had a trend to increase in α-hCRF+CdCl2 co-administrated groups. The results suggested that CdCl2 showed an immunosuppressive action upon murine T and B lymphocytes, CdCl2 could cause central CRF increase. α-hCRF could partially reduce the cadmium immunotoxicity. Central CRF-mediated immunomodulation was shown in cadmium immunotoxical effects on murine splenic lymphocytes.
, 百拇医药
Key words:cadmium, immunotoxicity, corticotropin-releasing factor, hypothalami-pituitary-adrenal axis
许多资料均已肯定镉的免疫毒性[1，2]，但至今其免疫毒性机理仍不十分清楚。近年研究指出外源毒物可通过神经内分泌系统内部某些与免疫系统关系密切的因素(神经递质、内分泌激素等)改变来间接修饰调节免疫系统功能。其中神经内分泌调节肽促肾上腺皮质激素释放因子(CRF)是机体神经-内分泌-免疫应答系统中的重要中枢信息物质[3]。本研究据此采用CdCl2及CdCl2+α-hCRF染毒SD大鼠2周，观察下丘脑及外周血浆CRF含量，及鼠脾T、B淋巴细胞增殖转化功能，探讨CRF与镉的免疫毒性的关系。
1 材料与方法
, 百拇医药 1.1 实验动物分组
二级雄性SD大鼠，体重130～150g。
1.1.1 单独氯化镉染毒实验 SD大鼠随机分为4组，即低镉(3.34mg/kgBW)、中镉(6.69mg/kgBW)、高镉(13.39mg/kgBW)剂量组和生理盐水对照组。经口投毒3周(每周6天)后，动物取材测定中枢下丘脑和外周血浆CRF含量及鼠脾T、B淋巴细胞增殖转化功能。
1.1.2 CRF拮抗剂(α-hCRF)与CdCl2联合染毒实验 SD大鼠随机分成5组。对接受联合染毒的动物先给拮抗剂α-hCRF(一次肌肉注射5μg/d)，3天后经口给CdCl2 2周(剂量同上)，并继续给α-hCRF。设空白对照组及拮抗剂α-hCRF组。动物取材处理同单独CdCl2染毒实验组。
1.2 主要试剂
, 百拇医药
氯化镉(CdCl2)AR国产；人/鼠促肾上腺皮质激素释放因子(h/rCRF)，Sigma;α-hCRF[9—41](α-螺旋CRF)，Sigma;3H-TdR([甲基-3H]胸腺嘧啶核苷)，37MBq/ml上海产；RPMI 1640培养基，Gibco;植物血凝素(PHA),广州医药工业研究所；脂多糖(LPS)，Sigma;HEPES分离缓冲液(HDB)，pH7.3；胶原酶Ⅲ型(collagenase type Ⅲ), Sigma;胰蛋白酶(trypsin),Promega;DNase I, Promega;标准CRF储备液5×10-4 mmol/L；β-PJ孵育液；β-PJ完全培养液；125I-ACTH放免试剂盒，天津产。
1.3 实验方法
1.3.1 垂体前叶细胞培养 无菌条件下取出大鼠垂体，轻轻分离垂体前叶置于HDB缓冲液中洗涤，充分剪碎，用胶原酶、DNase Ⅰ、胰蛋白酶进行细胞解离。37℃水浴振荡约20min，至垂体小组织块不见为止。用β-PJ孵育液洗涤离心1000 r/min×10min×2次，去上清后用β-PJ完全培养液稀释成3.3×105 /ml细胞悬液加以培养。并用台盼蓝染色观察细胞活性(要求90%以上)。
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1.3.2 标准CRF刺激垂体前叶细胞分泌ACTH工作曲线建立 将3.3×105 /ml的垂体前叶细胞悬液按1ml/孔加入24孔培养板，37℃、5%CO2孵育3～5天后取出，用β-PJ孵育洗涤2～3次后以1ml孵育液定容，返回培养箱继续培养1g，加入标准CRF设0.005、0.05、0.5、5.0、25 nmol/L CRF系列及PBS空白对照组。轻轻摇匀继续培养4h后，收集并测定培养液中ACTH浓度，根据CRF系列标准浓度与分泌ACTH浓度的关系建立工作曲线。
1.3.3 按Bingaman 方法取下丘脑及常规分离血浆[4]，制成冻干粉，用少许PBS溶解后同样条件下加入培养孔，根据刺激垂体前叶细胞分泌[ACTH]查得相应的[CRF]，结果计算如下：
下丘脑(或血浆)CRF含量=[CRF]×V(体积)×n(稀释倍数)×CRF分子量/下丘脑蛋白含量(或血浆体积)
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1.3.4 鼠脾T、B淋巴细胞增殖转化功能测定(3H-TdR掺入法)参照文献[5]。
刺激指数(SI)=刺激孔平均放射计数率(cpm)/
对照孔平均放射计数率(cpm)
1.4 统计分析
用SPSS统计软件包进行ONEWAY ANOVA方差分析。
2 结果
2.1 经口给CdCl2对大鼠脾T、B淋巴细胞经PHA、LPS诱导增殖转化功能影响
表1 经口给CdCl2大鼠脾T、B淋巴细胞增殖转化功能检测结果 (
±s,n=8) 剂量组, http://www.100md.com
(mg/kgBW)
B细胞
T细胞
0
2.74±0.43
3.10±0.61
3.34
1.98±0.37(1)
2.16±0.49(1)
6.69
1.54±0.27(1,2)
, 百拇医药
1.78±0.28(1,2)
13.39
1.09±0.19(1,2,3)
1.18±0.25(1，2)
注：(1)(2)(3)分别为与对照、低镉、中镉组比较，P<0.05 从表1可见，单独染镉2周后，经LPS(20μg/ml)诱导的鼠脾B淋巴细胞增殖转化能力明显低于对照组，各染镉组的刺激指数明显低于对照组(P<0.05)，且有剂量-效应关系(r=-0.8026，P<0.01)。经PHA(25μg/ml)诱导后，各染镉组与对照组比较T淋巴细胞刺激指数都有明显降低，中、高镉剂量组受抑制程度明显高于低镉剂量组(P<0.05)，有一定的剂量-效应关系(r=-0.7173，P<0.01)。说明CdCl2经口染毒可明显抑制鼠脾T、B淋巴细胞免疫功能。
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2.2 CRF-ACTH工作曲线建立
以不同剂量的标准CRF刺激离体培养的大鼠垂体前叶细胞，检测垂体合成分泌ACTH的量，一定范围内建立CRF-ACTH促分泌的工作曲线，如表2。
表2 标准CRF刺激垂体前叶细胞分泌ACTH测定结果(1)(
±s,n=5) CRF(nmol/L)
ACTH
(pmol/L)
0.000
12.05± 5.34
, 百拇医药
0.005
34.11± 6.00
0.050
57.99± 7.66
0.500
94.49± 7.41
5.000
128.50± 8.34
25.000
200.62±10.73
注：(1)经双变量对数变换得到线性回归方程为：Lg[ACTH]=0.257402 Lg(1+1000[CRF])+1.220229；t=14.391，P<0.001
, 百拇医药
2.3 单独染镉动物下丘脑及外周血浆CRF含量测定
下丘脑CRF含量在各染镉组均明显高于对照组(P<0.05)，且随着染镉剂量升高而升高。提示一定剂量镉暴露可引起动物下丘脑神经肽CRF合成分泌增加。而外周血浆CRF水平在各染镉组及对照组之间差异均无显著性(P>0.05)。
2.4 α-hCRF+CdCl2联合染毒对鼠脾T、B淋巴细胞经PHA、LPS诱导增殖转化功能影响
联合染毒后发现鼠脾B淋巴细胞增殖转化能力在各联合染毒组均明显低于α-hCRF组及空白对照组(P<0.05)，α-hCRF组与空白对照组比较差异无显著性(P>0.05)。但在α-hCRF+低、中、高镉各联合染毒组间差异无显著性(P>0.05)，提示α-hCRF可降低镉的免疫毒性。T淋巴细胞刺激指数在各联合染毒组均明显低于α-hCRF拮抗剂对照组(P<0.05);α-hCRF+中、高镉2组T淋巴细胞增殖转化能力明显低于空白对照组(P<0.05)；在联合染毒3组间仅见α-hCRF+低镉组与α-hCRF+高镉组间差异有显著性(P<0.05)。
, 百拇医药
表3 经口CdCl2染毒大鼠下丘脑和血浆CRF含量测定结果 (
±s,n=8) 剂量组(mg/kgBW)
下丘脑CRF含量
(ng/g蛋白)
血浆CRF含量
(pmol/L)
0
92.32±68.72
44.19±20.39
3.34
, 百拇医药
172.96±62.23(1)
48.45±10.07
6.69
247.36±65.34(1，2)
57.36±32.18
13.39
315.46±65.31(1，2，3)
65.06±23.19
注：(1) (2) (3)分别为与对照、低镉、中镉组比较 P<0.05表4 α-hCRF+CdCl2联合染毒大鼠脾T、B
, 百拇医药
细胞增殖转化功能测定结果(
±s) 组别α-hCRF
剂量
(μg/d)
n
刺激指数
B细胞
T淋巴细胞
对照组
0
8
2.42±1.21
, 百拇医药
2.16±0.52
α-hCRF
5
8
2.72±0.74
2.29±0.50
α-hCRF+低镉
5
8
1.64±0.58
1.74±0.61(2)
α-hCRF+中镉
, 百拇医药
5
6
1.43±0.70(1，2)
1.56±0.58(1,2)
α-hCRF+高镉
5
8
1.19±0.46(1，2)
1.12±0.33(1,2,3)
注：(1)(2)(3)分别为与对照、α-hCRF、α-hCRF+低镉组比较，P<0.05；中镉组两样品缺失，以下同2.5 α-hCRF+CdCl2联合染毒对大鼠下丘脑及外周血浆CRF含量的影响
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表5 α-hCRF+CdCl2联合染毒大鼠下丘脑及外周血浆CRF含量测定结果 (
±s) 组别α-hCRF
剂量
(μg/d)
n
下丘脑CRF含量
(ng/g蛋白)
血浆CRF含量
(pmol/L)
对照组
, http://www.100md.com
0
8
79.70±23.60
39.68±20.72
α-hCRF
5
8
139.86±21.90(1)
25.04±17.47
α-hCRF+低镉
5
8
, 百拇医药
142.72±29.02(1)
95.69±49.13(1，2)
α-hCRF+中镉
5
6
148.86±31.57(1)
64.62±37.48(2)
α-hCRF+高镉
5
8
131.62±42.70(1)
, 百拇医药
77.75±40.64(1,2)
注：(1)(2)分别为与对照、α-hCRF组比较，P<0.05 表5可见，各联合染毒组及α-hCRF组动物下丘脑CRF含量均明显高于空白对照组(P<0.05)。但α-hCRF+低、中、高镉各联合染毒组间差异无显著性(P>0.05)。外周血浆CRF水平，在α-hCRF+低、中、高镉各组均高于α-hCRF组(P<0.05)，低、高镉+α-hCRF组高于空白对照组(P<0.05)，提示使用α-hCRF后外周血中CRF含量有升高趋势。
3 讨论
自Besedovsky(1977)首次提出神经-内分泌-免疫调节假说以来[6]，在大量研究基础上形成了神经内分泌免疫学说体系。研究表明下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPAaxis)和交感神经系统(SNS)-肾上腺髓质轴与机体免疫联系密切[3]。其中CRF是调节上述两轴的重要中枢信息物质，主要由下丘脑室旁核和视上核分泌。本研究着重从内分泌角度探讨了镉的免疫毒性与神经肽CRF的关系。
, 百拇医药
结果表明CdCl2染毒明显抑制有丝分裂原诱导脾T、B淋巴细胞增殖转化功能。同时发现染镉组下丘脑CRF含量均高于对照组(P<0.05)，并伴随着镉剂量升高，而对血浆CRF水平无明显影响。可见镉影响中枢神经系统，引起神经-内分泌-免疫轴中的中枢信息物质CRF在下丘脑的合成增加，免疫细胞功能同时下调。CRF的拮抗剂α-hCRF是正常结构CRF的竞争性拮抗剂，可与CRF受体结合但并不表现CRF样生物活性[7]。当用α-hCRF与镉联合染毒后，B淋巴细胞功能抑制程度不再有伴随镉剂量的差异，比较单独染镉时B淋巴细胞功能抑制随染镉剂量升高而加重，可见α-hCRF阻断了不同剂量镉抑制B淋巴细胞功能的差异。单给α-hCRF5μg/d对脾淋巴细胞功能并无影响，而联合镉染毒时，α-hCRF能拮抗一定的镉免疫毒性。α-hCRF+中镉与α-hCRF+低、高镉组T淋巴细胞功能抑制无统计学差异，仅低镉+α-hCRF与高镉+α-hCRF组间有统计学差别，表明T淋巴细胞对镉耐受性可能较B淋巴细胞差一些。资料表明CRF是与其受体结合发挥作用的[8]。本研究中各联合染毒组中枢CRF无差异性升高，可能是各组都应用α-hCRF后，降低HPA轴或SNS-髓质轴功能，反馈引起中枢CRF合成分泌无差异性升高。血浆CRF水平在拮抗剂使用后有升高趋势，可能为α-hCRF竞争性阻断CRF受体而使游离CRF升高之故，因在外周组织也有CRF受体及CRF结合蛋白分布。α-hCRF减轻镉对T、B淋巴细胞免疫功能抑制，进一步说明下丘脑CRF含量升高介导了镉抑制免疫细胞功能。
, 百拇医药
外源物质除了直接作用于免疫系统，也可通过影响中枢CRF的合成分泌，激活HPA轴或/和SNS-髓质轴引起儿茶酚胺释放增多。继而经受体信号系统对免疫细胞进行负调节，即免疫抑制[9]。在本室以相同镉剂量染毒时，曾观察到大鼠血浆去甲肾上腺素(NE)肾上腺素(E)水平分别为(41.7±10.6)和(252.0±89.7)pg/ml，在高镉(13.36mg/kg BW)组分别升高至(202.2±129.8)和(455.0±193.5)pg/ml。提示暴露于一定剂量的镉可升高大鼠血浆NE、E水平。本研究观察到镉的免疫毒性中存在中枢CRF调节作用，与HPA轴活化引起免疫抑制的报道一致[10]。可见，镉免疫毒性中存在CRF免疫修饰调节，后者通过儿茶酚胺修饰免疫功能。
基金项目：国家自然科学基金(No.39570626)
作者简介：张绪超，男，博士研究生
, 百拇医药 参考文献
1，Bernier J, Brousseau P, Krzystyniak K, et al. Immunotoxicity of heavy metals indeletion to great lakes. Eviron Health Respect,1995,103(Sup19):23—24
2，黎大明，陈成章.镉对免疫功能的影响.环境与健康杂志，1990，7(3)：142
3，Fuchs BA, Sanders VM. The role of brain-immune interaction in immunotoxicology. Critical Rev Toxicol,1994,24(2):151—176
4，Bingaman EW， Magnuson DJ, Gray TS, et al. Androgen inhibits the increases in hypothalamic corticotropin-releasing hormone(CRH) and CRH-immunoreactivity following gonadectomy. Neuroendocrinology,1994,59(3)：228—234
, 百拇医药
5，薛彬.免疫毒理学实验技术.北京：北京医科大学、中国协和医科大学联合出版社，1995，22
6，Besedovsky HO, Sorkin E. Network of immunoneuroendocr-ineinteraction. Clin Exp Immunol,1977,27:1
7，Rivier J, Rivier C, Vale W. Synthetic competitive antagonists of corticotropin-releasing factor:effect on ACTH secretion in rat. Science,1984,224:889
8，de Souza EB. Corticotropin releasing factor receptors:phy-siology, pharmacology, biochemistry and role in central nervous system and immune disorders. Psychoneuroendocrinology, 1995,20(8):789—819
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9，Kammer GM. The adenylate cyclase-cAMP-protein kinase A pathway and regulation of the immune response. Immunol Today,1988,9(718):222
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(1999-11-01收稿), http://www.100md.com