对氧磷单克隆抗体的研制及鉴定
作者：王刚垛 徐勤惠 马兆扬 荣康泰 何凤生
单位：王刚垛(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；徐勤惠(军事医学科学院药物毒物研究所)；马兆扬(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；荣康泰(军事医学科学院药物毒物研究所)；何凤生(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)
关键词：对氧磷；人工抗原；杂交瘤；单克隆抗体
卫生研究990601 摘要 重氮化法使对氧磷(E600)与牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白偶合合成人工抗原。用人工抗原E600-BSA免疫Balb/c小鼠，然后将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞和E600-BSA免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞融合，成功的建立了能分泌抗对氧磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株。并分析了该细胞株的染色体及对其产生的单克隆抗体的类型、特异性、亲和力进行了鉴定和检测。上述杂交瘤细胞连续传代或冻存10周，其分泌抗体水平稳定。
, 百拇医药
分类号 R139.3 Q591.2
Production and identification of anti-paraoxon monoclonal antibodies
Wang Gangduo, Xu Qinhui, Ma Zhaoyang, Rong Kangtai, et al.
(Institute of Occupational Medicine, Beijing 100050,China)
Paraoxon(E600)was conjugated to bovine serum albumin(BSA) or tachypleus tridentatus hemocyanin(TTH) by diazotization. Two hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies(McAb) against paraoxon have been established by fusing mouse myeloma cells and splenocytes from Balb/c mice immunized with E600-BSA.The chromosomes of the hybridoma cell 2B10 were analyzed. The immunoglobulin of the Mc Ab was classified. The affinity and specificity of this antibody were determinated. The hybridoma cells have fairly reserved the antibody-producing capacity after continuously growing or stored in liquid nitrogen for 10 weeks.
, 百拇医药
Key words:paraoxon, artificial antigen, hybridomas, monoclonal antibody
对硫磷是一种常见的有机磷农药，因其引起的急性中毒时有发生，但缺乏其接触的生物标 志物和诊断的特异性指标。对氧磷(E600)为对硫磷在体内的主要代谢物，本文成功地建立了能分泌抗对氧磷单克隆抗体(McAb)的小鼠杂交瘤细胞株，并对其分泌的McAb类型和性质进行了 鉴定。为对氧磷的免疫检测提供了必要的条件。也为探讨对硫磷接触生物标志物提供了新的技术路线。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 骨髓瘤细胞SP2/0引自中国预防医学科学院病毒研究所，PRMI1640培养基常规培养。
1.1.2 试剂 对氧磷和甲基对氧磷均为本实验室合成，纯度大于98%。对硫磷为中外合资绿色特种化学品有限公司产品，含量大于99%。甲基对硫磷为市售农药，经本实验室纯化，纯度98%以上。牛血清白蛋白(BSA)为Sigma产品，国内分装。中国鲎血蓝蛋白(TTH)为本课题组分离提纯。PRMI1640培养基、HAT、HT、Freund氏完全与不完全佐剂均为Gibco产品。PEG4000为Mereck公司产品。琼脂粉为日本产品国内分装。HRP标记的羊抗鼠IgG北方同正公司提供。兔抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM抗体为Sigma产品。其它化学试剂均为分析纯。
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1.1.3 仪器 酶标仪为Bio-Rad公司产品。
1.1.4 动物 Balb/c纯系雌性小鼠购自中国医学科学院动物研究所，鼠龄6～8周，体重18～22g，用于免疫和制备滋养细胞；经产1～2次的雌鼠用于制备腹水。
1.2 方法
1.2.1 人工抗原的合成 重氮化法使对氧磷偶合牛血清白蛋白(BSA)和血蓝蛋白(TTH)形成E600-BSA和E600-TTH。对氧磷和载体的结合比按人工抗原内磷含量计算。E600与BSA结合比为23∶1，E600和TTH的结合比为609～707∶1。
1.2.2 单克隆抗体的研制 E600-BSA的生理盐水溶液与等容积Freund氏 完全佐剂混合制成乳剂。给Balb/c小鼠背部皮下多点注射(50μg/只)作为基础免疫，2周后同样剂量E600-BSA的生理盐水溶液与等容积Freund氏不完全佐剂混合制成乳剂，背部皮下多点注射加强免疫。然后每隔2周再单用E600-BSA生理盐水溶液腹腔注射加强免疫1次，剂量同前。第3次加强免疫后10天，双相琼脂扩散法检测血清抗体水平，选择效价高者用于单克隆抗体的制备。
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第3次加强免疫后2周，100 μg/只再腹腔注射加强免疫1次，第2天传代培养骨髓瘤细胞SP2 /0，第3天用Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞制备滋养细胞，第4天取E600-BSA免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞与SP 2/0小鼠骨髓瘤细胞在50% PEG4000作用下融合。融合细胞置于含滋养细胞的HAT选择培养基中，5% CO2培养箱温育。融合10天后，E600-TTH包被酶标板，ELISA法检测融合孔培养上清液抗体水平，A490值大于阴性对照组值2倍者为阳性孔。对 阳性孔有限稀释法亚克隆3次，第3次稀释后各孔仍均为阳性者，即为筛选出的单克隆株。而后扩大培养、冻存、制备腹水和鉴定。
1.2.3 杂交瘤细胞染色体分析 秋水仙素阻断法[1]，即将上述细胞传代培养36h，加秋水仙素，继续培养6h，进行离心、低渗处理，3次固定后制片。10% Giemsa染液染色，油镜下观察100个完整的中期核细胞，分析染色体数目分布。
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1.2.4 单克隆抗体类型及亚类鉴定 取杂交瘤细胞培养上清液进行离心、浓缩处理，用标准的兔抗鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3抗体做双向琼脂扩散试验，鉴定单克隆抗体的免疫球蛋白类型和亚类。
1.2.5 单克隆抗体特异性测定 用抗对氧磷单克隆抗体与对氧磷、甲基对氧磷、对硫磷、甲基对硫磷进行酶联免疫交叉实验，计算P/N值。P/N=(A样-A空 )/(A阴-A空)(P代表阳性孔，N代表阴性孔。样为样品孔，空为空白孔，阴为阴性对照 孔)，P/N>2.1为阳性。
1.2.6 单克隆抗体亲和力测定 参照Beatty等建立的ELISA间接法进行检 测[2]。先测定对氧磷与其单克隆抗体的反应曲线，在曲线上找到最大结合A 490值的50%的McAb浓度(mol/L)，结合常数(Ka)即为该McAb浓度的倒数。
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2 结果
2.1 单克隆抗体的制备
进行细胞融合后，对阳性孔经3次有限稀释，获得2株分泌抗对氧磷单克隆抗体的杂交瘤细胞系，分别为2B6、2B10。以后传代培养发现2B6分泌不够稳定，于是对2B10 进行了进一步研究。2B10体外连续传代10周，能稳定分泌抗体，冻存10周后复苏，仍 能稳定分泌抗体。
ELISA法测定抗体效价，培养上清液为1∶103，腹水效价为1∶105(附表)。
附表 杂交瘤细胞培养上清液及腹水中McAb效价(1) 稀释度
上清液
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腹水
SP2/0
1∶10
1.59
-
0.19
1∶102
0.85
2.55
0.19
1∶103
0.45
, http://www.100md.com 1.74
0.18
1∶104
0.24
0.84
0.20
1∶105
0.48
0.20
注：(1)表内数值为A490双孔检测的均值;“-”：太高无法读出
2.2 杂交瘤细胞染色体分析
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制备杂交瘤细胞株中期染色体，计算100个分裂相，染色体数在96～104条之间。因小鼠脾脏淋巴细胞染色体为40条，而SP2/0在62～68之间，可见杂交瘤细胞染色体数基本上是小鼠脾脏细胞和SP2/0细胞染色体数之和。另外在杂交瘤染色体中均可见到中间着丝点和亚中部着丝点的染色体。
2.3 McAb类型及亚类鉴定
双向琼脂扩散法检测结果表明，该系抗对氧磷的单克隆抗体为IgG，其亚类是IgG1。
2.4 McAb特异性测定
McAb特异性检测结果发现，对氧磷P/N为4.2，对硫磷P/N为2.2，甲基对氧磷P/N为1.4，甲基对硫磷P/N为1.2。说明本实验室制备的单克隆抗体对对氧磷有明显的抗原-抗体反 应，P/N值明显大于2.1。与对硫磷有轻度的交叉反应(P/N=2.2)，与其它两种农药无交叉反应。显示出该抗对氧磷单克隆抗体有较好的特异性。
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2.5 McAb亲和力检测
ELISA间接法测定McAb的亲和力，以被检测McAb的不同浓度为横坐标，以相对应的A490值为纵坐标绘出McAb亲和力的测定曲线(见图1)，以曲线上部趋于平坦面的A值为100%，查出其A值的50%点的McAb浓度，再求出其倒数，以此表示McAb的相对亲和力。从曲线 上查出，达到最大结合50%所需2B10抗体浓度为7×10-6mol/L，故其McAb的K a=1.4×105L/mol。
附图 McAb亲和力检测曲线
3 讨论
农药等小分子化合物的检测多采用气相或液相色谱法，不仅仪器昂贵，提取纯化费时，还需要专门人员操作，给应用普及带来困难。免疫分析方法的应用使建立简便、快速、特异的检测方法成为现实。1982年Vallejo等用对硫磷与牛血清白蛋白结合后对兔免疫，结果发现兔产生的抗血清可以识别用来免疫的半抗原，但用放射免疫和酶联免疫检测时，检测不到对硫磷与抗血清的反应，作者认为对硫磷分子量小，制备特异性抗体有一定困难[3]。3年后Brimfield等制备出了对氧磷的高亲和力、特异性单克隆抗体 [4]。
, http://www.100md.com
本文成功地建立了分泌抗对氧磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其染色体数为96～104条之间，为小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞之和。其分泌的单克隆抗体较专一性地针对对氧磷分子的抗原决定簇，具有较高的特异性，且与对氧磷有高度的亲和力，其亲和力高于Brimfield等建 立的CE3细胞株产生的单克隆抗体，而与BD1株产生的McAb相近[4]。因此为建立对氧磷简便、快速、特异的生物检测方法提供了工具。
国家“九五”攻关基金资助项目(No.96-906-04-11)
王刚垛，男，博士研究生
4 参考文献
1，章静波主编.细胞生物实用方法和技术.北京：北京医科大学协和医科大学联 合出版社，1995，151-152
2，Beatty JD, Beatty BG, Vlahos W. Measurement of monoclonal antibody affinity by noncompetitive enzyme immunoassay. J Immunol Meth, 1987,100:173-181
, 百拇医药
3，Vallejo RP, Bogus ER, Mumma RO. Effects of hapten structure and bridging groups on antisera specificity in parathion immunoassay development. J Agric Food Ch em, 1982,30:573-580
4，Brimfield AA, Lenz DE, Graham C, et al. Mouse monoclonal antibodies against paraoxon:potential reagents for immunoassay with constant immunochemical characteristics. J Agric Food Chem, 1985,33:1237-1242
(1999-03-30收稿), http://www.100md.com
单位：王刚垛(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；徐勤惠(军事医学科学院药物毒物研究所)；马兆扬(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)；荣康泰(军事医学科学院药物毒物研究所)；何凤生(中国预防医学科学院劳动卫生与职业病研究所，北京 100050)
关键词：对氧磷；人工抗原；杂交瘤；单克隆抗体
卫生研究990601 摘要 重氮化法使对氧磷(E600)与牛血清白蛋白(BSA)、血蓝蛋白偶合合成人工抗原。用人工抗原E600-BSA免疫Balb/c小鼠，然后将SP2/0小鼠骨髓瘤细胞和E600-BSA免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞融合，成功的建立了能分泌抗对氧磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株。并分析了该细胞株的染色体及对其产生的单克隆抗体的类型、特异性、亲和力进行了鉴定和检测。上述杂交瘤细胞连续传代或冻存10周，其分泌抗体水平稳定。
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分类号 R139.3 Q591.2
Production and identification of anti-paraoxon monoclonal antibodies
Wang Gangduo, Xu Qinhui, Ma Zhaoyang, Rong Kangtai, et al.
(Institute of Occupational Medicine, Beijing 100050,China)
Paraoxon(E600)was conjugated to bovine serum albumin(BSA) or tachypleus tridentatus hemocyanin(TTH) by diazotization. Two hybridoma cell lines secreting monoclonal antibodies(McAb) against paraoxon have been established by fusing mouse myeloma cells and splenocytes from Balb/c mice immunized with E600-BSA.The chromosomes of the hybridoma cell 2B10 were analyzed. The immunoglobulin of the Mc Ab was classified. The affinity and specificity of this antibody were determinated. The hybridoma cells have fairly reserved the antibody-producing capacity after continuously growing or stored in liquid nitrogen for 10 weeks.
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Key words:paraoxon, artificial antigen, hybridomas, monoclonal antibody
对硫磷是一种常见的有机磷农药，因其引起的急性中毒时有发生，但缺乏其接触的生物标 志物和诊断的特异性指标。对氧磷(E600)为对硫磷在体内的主要代谢物，本文成功地建立了能分泌抗对氧磷单克隆抗体(McAb)的小鼠杂交瘤细胞株，并对其分泌的McAb类型和性质进行了 鉴定。为对氧磷的免疫检测提供了必要的条件。也为探讨对硫磷接触生物标志物提供了新的技术路线。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 细胞 骨髓瘤细胞SP2/0引自中国预防医学科学院病毒研究所，PRMI1640培养基常规培养。
1.1.2 试剂 对氧磷和甲基对氧磷均为本实验室合成，纯度大于98%。对硫磷为中外合资绿色特种化学品有限公司产品，含量大于99%。甲基对硫磷为市售农药，经本实验室纯化，纯度98%以上。牛血清白蛋白(BSA)为Sigma产品，国内分装。中国鲎血蓝蛋白(TTH)为本课题组分离提纯。PRMI1640培养基、HAT、HT、Freund氏完全与不完全佐剂均为Gibco产品。PEG4000为Mereck公司产品。琼脂粉为日本产品国内分装。HRP标记的羊抗鼠IgG北方同正公司提供。兔抗小鼠IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgM抗体为Sigma产品。其它化学试剂均为分析纯。
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1.1.3 仪器 酶标仪为Bio-Rad公司产品。
1.1.4 动物 Balb/c纯系雌性小鼠购自中国医学科学院动物研究所，鼠龄6～8周，体重18～22g，用于免疫和制备滋养细胞；经产1～2次的雌鼠用于制备腹水。
1.2 方法
1.2.1 人工抗原的合成 重氮化法使对氧磷偶合牛血清白蛋白(BSA)和血蓝蛋白(TTH)形成E600-BSA和E600-TTH。对氧磷和载体的结合比按人工抗原内磷含量计算。E600与BSA结合比为23∶1，E600和TTH的结合比为609～707∶1。
1.2.2 单克隆抗体的研制 E600-BSA的生理盐水溶液与等容积Freund氏 完全佐剂混合制成乳剂。给Balb/c小鼠背部皮下多点注射(50μg/只)作为基础免疫，2周后同样剂量E600-BSA的生理盐水溶液与等容积Freund氏不完全佐剂混合制成乳剂，背部皮下多点注射加强免疫。然后每隔2周再单用E600-BSA生理盐水溶液腹腔注射加强免疫1次，剂量同前。第3次加强免疫后10天，双相琼脂扩散法检测血清抗体水平，选择效价高者用于单克隆抗体的制备。
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第3次加强免疫后2周，100 μg/只再腹腔注射加强免疫1次，第2天传代培养骨髓瘤细胞SP2 /0，第3天用Balb/c小鼠腹腔巨噬细胞制备滋养细胞，第4天取E600-BSA免疫的Balb/c小鼠脾脏细胞与SP 2/0小鼠骨髓瘤细胞在50% PEG4000作用下融合。融合细胞置于含滋养细胞的HAT选择培养基中，5% CO2培养箱温育。融合10天后，E600-TTH包被酶标板，ELISA法检测融合孔培养上清液抗体水平，A490值大于阴性对照组值2倍者为阳性孔。对 阳性孔有限稀释法亚克隆3次，第3次稀释后各孔仍均为阳性者，即为筛选出的单克隆株。而后扩大培养、冻存、制备腹水和鉴定。
1.2.3 杂交瘤细胞染色体分析 秋水仙素阻断法[1]，即将上述细胞传代培养36h，加秋水仙素，继续培养6h，进行离心、低渗处理，3次固定后制片。10% Giemsa染液染色，油镜下观察100个完整的中期核细胞，分析染色体数目分布。
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1.2.4 单克隆抗体类型及亚类鉴定 取杂交瘤细胞培养上清液进行离心、浓缩处理，用标准的兔抗鼠IgM、IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3抗体做双向琼脂扩散试验，鉴定单克隆抗体的免疫球蛋白类型和亚类。
1.2.5 单克隆抗体特异性测定 用抗对氧磷单克隆抗体与对氧磷、甲基对氧磷、对硫磷、甲基对硫磷进行酶联免疫交叉实验，计算P/N值。P/N=(A样-A空 )/(A阴-A空)(P代表阳性孔，N代表阴性孔。样为样品孔，空为空白孔，阴为阴性对照 孔)，P/N>2.1为阳性。
1.2.6 单克隆抗体亲和力测定 参照Beatty等建立的ELISA间接法进行检 测[2]。先测定对氧磷与其单克隆抗体的反应曲线，在曲线上找到最大结合A 490值的50%的McAb浓度(mol/L)，结合常数(Ka)即为该McAb浓度的倒数。
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2 结果
2.1 单克隆抗体的制备
进行细胞融合后，对阳性孔经3次有限稀释，获得2株分泌抗对氧磷单克隆抗体的杂交瘤细胞系，分别为2B6、2B10。以后传代培养发现2B6分泌不够稳定，于是对2B10 进行了进一步研究。2B10体外连续传代10周，能稳定分泌抗体，冻存10周后复苏，仍 能稳定分泌抗体。
ELISA法测定抗体效价，培养上清液为1∶103，腹水效价为1∶105(附表)。
附表 杂交瘤细胞培养上清液及腹水中McAb效价(1) 稀释度
上清液
, 百拇医药
腹水
SP2/0
1∶10
1.59
-
0.19
1∶102
0.85
2.55
0.19
1∶103
0.45
, http://www.100md.com 1.74
0.18
1∶104
0.24
0.84
0.20
1∶105
0.48
0.20
注：(1)表内数值为A490双孔检测的均值;“-”：太高无法读出
2.2 杂交瘤细胞染色体分析
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制备杂交瘤细胞株中期染色体，计算100个分裂相，染色体数在96～104条之间。因小鼠脾脏淋巴细胞染色体为40条，而SP2/0在62～68之间，可见杂交瘤细胞染色体数基本上是小鼠脾脏细胞和SP2/0细胞染色体数之和。另外在杂交瘤染色体中均可见到中间着丝点和亚中部着丝点的染色体。
2.3 McAb类型及亚类鉴定
双向琼脂扩散法检测结果表明，该系抗对氧磷的单克隆抗体为IgG，其亚类是IgG1。
2.4 McAb特异性测定
McAb特异性检测结果发现，对氧磷P/N为4.2，对硫磷P/N为2.2，甲基对氧磷P/N为1.4，甲基对硫磷P/N为1.2。说明本实验室制备的单克隆抗体对对氧磷有明显的抗原-抗体反 应，P/N值明显大于2.1。与对硫磷有轻度的交叉反应(P/N=2.2)，与其它两种农药无交叉反应。显示出该抗对氧磷单克隆抗体有较好的特异性。
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2.5 McAb亲和力检测
ELISA间接法测定McAb的亲和力，以被检测McAb的不同浓度为横坐标，以相对应的A490值为纵坐标绘出McAb亲和力的测定曲线(见图1)，以曲线上部趋于平坦面的A值为100%，查出其A值的50%点的McAb浓度，再求出其倒数，以此表示McAb的相对亲和力。从曲线 上查出，达到最大结合50%所需2B10抗体浓度为7×10-6mol/L，故其McAb的K a=1.4×105L/mol。
附图 McAb亲和力检测曲线
3 讨论
农药等小分子化合物的检测多采用气相或液相色谱法，不仅仪器昂贵，提取纯化费时，还需要专门人员操作，给应用普及带来困难。免疫分析方法的应用使建立简便、快速、特异的检测方法成为现实。1982年Vallejo等用对硫磷与牛血清白蛋白结合后对兔免疫，结果发现兔产生的抗血清可以识别用来免疫的半抗原，但用放射免疫和酶联免疫检测时，检测不到对硫磷与抗血清的反应，作者认为对硫磷分子量小，制备特异性抗体有一定困难[3]。3年后Brimfield等制备出了对氧磷的高亲和力、特异性单克隆抗体 [4]。
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本文成功地建立了分泌抗对氧磷单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其染色体数为96～104条之间，为小鼠脾脏细胞和骨髓瘤细胞之和。其分泌的单克隆抗体较专一性地针对对氧磷分子的抗原决定簇，具有较高的特异性，且与对氧磷有高度的亲和力，其亲和力高于Brimfield等建 立的CE3细胞株产生的单克隆抗体，而与BD1株产生的McAb相近[4]。因此为建立对氧磷简便、快速、特异的生物检测方法提供了工具。
国家“九五”攻关基金资助项目(No.96-906-04-11)
王刚垛，男，博士研究生
4 参考文献
1，章静波主编.细胞生物实用方法和技术.北京：北京医科大学协和医科大学联 合出版社，1995，151-152
2，Beatty JD, Beatty BG, Vlahos W. Measurement of monoclonal antibody affinity by noncompetitive enzyme immunoassay. J Immunol Meth, 1987,100:173-181
, 百拇医药
3，Vallejo RP, Bogus ER, Mumma RO. Effects of hapten structure and bridging groups on antisera specificity in parathion immunoassay development. J Agric Food Ch em, 1982,30:573-580
4，Brimfield AA, Lenz DE, Graham C, et al. Mouse monoclonal antibodies against paraoxon:potential reagents for immunoassay with constant immunochemical characteristics. J Agric Food Chem, 1985,33:1237-1242
(1999-03-30收稿), http://www.100md.com