潜艇常见气体对离体细胞化学发光的影响
作者：薛建华 刘忠权 李政年 常家文 鲁毅钧
单位：海军医学研究所，上海市 200433
关键词：化学发光；肺泡巨噬细胞；氧；二氧化碳；一氧化碳；正庚烷
海军医学杂志990110 摘要 目的：用化学发光法检测O2、CO2、CO和正庚烷(CxHy)四种气体对离体家兔肺泡巨噬细胞(AM)的直接效应。方法：将AM悬液暴露于上述气体，不同时间检测用PMA激发的细胞发光及其存活率。结果：培养在99.5%N2(0.5%O2)中的AM受激发光仅能维持10h；高浓度O2、CO2、CO和CxHy具有刺激或增强AM发光之效应；含16%O2、1.9%CO2、46mg/m3CO和176mg/m3CxHy的模拟潜艇混合气体未见对AM激发光功能和存活率产生不利影响。结论：空气氧含量对细胞十分重要，提高氧浓度有利于细胞存活，但氧浓度>16%和<20%的低氧还原性气体环境更有利细胞长时间生存。
, 百拇医药
Effects of Common Gases in Submarines on Chemiluminescence
of in vitro Pulmonary Alveolus Macrophage
Xue Jianhua, Liu Zhongquan, Li Zhengnian, et al.
Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433
Abstract Objective: To examinet he directeffects of four gases-O2,CO2,CO and heptane (CxHy) on chemilu minescence of in vitro alveolus macrophage(AM) from rabbits with a luminescence technique. Methods: The AM suspension was exposed to the above-mentioned gases and the chemil umine scence of AM stimulated with phorbol myristate acetate(PMA) was examined by chemiluminometry at differenttimes. The survival rate of AM was counted with a micr oscope.Results: In the air with 0.5% O2(99.5%N2), the excited chemiluminescence of AM was only maintained for 1 0 hours, and with high concentrations of O2，CO or CxHy, the excited chemi luminescences of AMs showed a transient enhancing effect. It was found that in the mixed air with 16%O2,1.9%CO2, 46mg/m3 CO and 176mg/m3 heptane, which simulated the submarine condition, neither the luminescence function nor the viability of AM was impaired. Conclusion:O2 in the ai r is very important for in vitro cells. High concentration of O2 is beneficial to cellsurvival, but the reducing gas environment with low O2 concentration (>16% and <20%) is more favourable for prolonged living of cells.
, 百拇医药
Key words chemiluminescence; pulmo nary alveolus macrophage; oxygen; carbon dioxide; carbon monoxide; heptane
研究表明，潜艇环境的空气质量对保持艇员身心健康十分重要，空气组分和浓度的较大变化常能改变艇员的生理和心理反应。甚至造成细胞和组织损伤。O2、CO2、CO和挥发性碳氢化合物(CxHy)是潜艇舱室空气的主要组分或常见污染成分，虽然早先已对它们的生理效应和毒性进行过较多研究，然而关于这些气体对细胞直接作用效果的实验资料并不多见。
肺泡巨噬细胞(AM)是直接接触呼吸空气的肺组织细胞之一。进行吞噬反应的AM会发生剧烈耗氧反应，释放大量可用化学发光法进行检测的自由基类物质[1]。本文利用发光技术测定了上述不同浓度气体对离体家兔AM受激发光功能的影响，以便了解潜艇常见气体在细胞水平上的作用特性。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 DMEM培养剂(LifeTechnologies Inc., U.S.A)；用双蒸水配制，贮4℃冰箱，鲁米诺(luminol,Sigma)；配制成0.07mmol/L的pH7.4磷酸缓冲溶液；PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate, Sigma);按要求配制成7.5μg/L的pH7.4磷酸缓冲溶液；正庚烷(上海化学试剂供应站)；分析纯，使挥发，作为CxHy之代表；配成钢瓶气：O2(99.07%)、N2(99.5%)、CO2(99.9%)和空气钢瓶气，上海第五钢铁厂产品；CO：化学发生法自制，配成钢瓶气。
1.2 主要设备 SHG-1型生物化学发光检测仪(上海市检测技术所工厂)；检测细胞发光的恒温通气培养装置(自制)；色谱分析仪。
1.3 肺泡巨噬细胞 新西兰种家兔，体重2～2.5kg，戊巴比妥纳耳缘静注麻醉，取整肺，气管灌注生理盐水洗出AM，离心洗涤3次后制成1×106AM/ml的DMEM悬液，台盼兰染料排除试验检查AM存活率。
, 百拇医药
1.4 通气培养 将AM悬液定量分装于特制平底(玻璃)培养皿(每皿1.2ml)，依次浸泡在一只培养盒的水浴中。将培养盒加盖密闭，放培养装置内37℃避光恒温培养。在培养过程中使预定浓度(色谱分析)的钢瓶气连续流经培养盒，流速100ml/min。
1.5 发光检测 接通培养装置与发光仪，待装置达到预定温度后，先测培养皿自发光本底(仪器设定：每次自动计数20s)，然后用注射器刺透培养盒盖上相应小孔的硅胶膜，向盒内每只处于装置透光窗位的培养皿先后加注0.25ml鲁米诺和0.25mlPMA工作液，立即计数，此后每隔3min自动计数1次，连续8次。
除测量AM发光的培养皿外，培养盒中用于测定AM存活率的培养皿，在培养结束后取出，用台盼兰染料排除法镜检细胞存活率。
2 结 果
2.1 检测误差
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同一样品的5个复份平均本底自发光和PMA激发发光峰积值(8次计数之和)分别为148±19cpm和4974±427cpm，变异系数(CV)分别为12.8%和8.8%。51只家兔AM暴露于空气(2h)之平均本底自发光和PMA激发光峰积值分别为137±21cpm和10165±5792cpm，CV值分别为15.3%和57.0%。
2.2 气体培养AM之激发光反应
由于AM激发光水平的个体差异较大，为便于比较，本法测定的气体暴露AM受激发光峰积值均用相对于暴露前(空气对照)值之百分率表示，结果见图1。
图1 气体对培养AM受激化学发光的影响
(图中每个数据点为3次测定之平均值)
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如图1A所示，在99.5%N2和正常空气中培养的AM激发光水平均迅速下降，分别在2h和7h左右降至暴露前的1/2，前者的培养10h激发光几乎消失。而接触50.5%O2的AM，最初3h激发光迅速增强至暴露前的2倍，然后逐步下降。图1B显示，4.9%CO2(19.8%O2)培养AM的发光反应时间曲线呈先降后升趋势，最初3h内急速下降至暴露前的43%，然后迅速回升，至第20h时达到暴露前的1.8倍。从图1C可见，CO对AM的受激发光具有强烈刺激作用。暴露于0.12和0.6g/m3CO中3h的AM激发光水平分别增加到暴露前的2.7倍和5.2倍，然后逐步下降。
相对而言，庚烷气对培养AM发光功能的影响较小(图1D)，直到浓度为6.1g/m3时，才见发光水平有较大增加(平均1倍左右，最高达到暴露前的3.8倍)。
2.3 气体培养AM的存活率
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由表1可见，空气培养AM的存活率明显随时间下降，N2气培养AM下降更显著，但在高浓度CO2、CO中培养10h或20h的AM存活率均比空气组明显有所提高，包括CxHy在内的低浓度组则不明显。
表1 气体浓度对培养AM存活率(%)的影响 气体
浓度(%)
n
通气时间(h)
0
5
10
20
空气
, http://www.100md.com
对照
7
95.4±2.0
86.3±9.4
64.7±1.4*
50.3±10.4***
N2
99.5
6
95.2±6.3
53.5±24.1△
, http://www.100md.com
-
-
O2
50.5
5
96.5±1.0
85.5±9.7*
71.2±5.0*
48.8±22.5**
CO2
1.1
, 百拇医药 5
97.9±0.2
72.8±3.0*
66.4±9.0*
52.8±6.0***
4.9
7
97.0±1.6
82.9±5.1*
81.7±12.1
82.5±6.8△△
, 百拇医药
CO
0.01
5
96.6±7.0
78.2±4.8***
68.5±6.7***
38.4±11.2***
0.05
8
96.5±2.0
93.1±6.6
87.7±2.5△△
, http://www.100md.com
-
CxHy
0.05
2
96.1±1.3
68.9±6.3**
55.2±11.5**
29.2±9.5**
0.15
8
95.4±2.2
84.1±5.3*
, 百拇医药
-
-
与暴露前比：*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001
与空气对照比：△P<0.05;△△P<0.01
2.4 多组分混合气对培养AM的影响
在含有1.9%CO2、16.3%O2、46mg/m3CO和176mg/m3CxHy的模拟潜艇气体环境中，AM受激发光也有先降后升趋势(表2)，5h和20h的水平分别比暴露前低和高40%左右，细胞存活率也始终维持较高。
表2 多组分混合气对培养AM的影响(n=5) 检测项目
, 百拇医药
通气时间(h)
0
5
10
20
AM激发光(相对值)
100
59±17**
107±36
142±45
AM存活率(%)
97.9±0.9
, http://www.100md.com 78.6±8.7
79.4±7.7
81.9±5.2
与暴露前(0h)比：**P<0.01
3 讨 论
正常细胞内存在一种微妙的产能和耗能平衡，缺氧细胞常因不能合成足够维持正常代谢所需之ATP[2]而死亡。本试验测得暴露在99.5%N2中的AM，5h存活率降至53%，10h的受激发光能力几乎完全消失，提高氧浓度则使AM激发光和存活率均获改善。但高浓度氧也能引发细胞应激反应，产生氧中毒[3]而致细胞死亡和激发光水平下降，所以应避免机体长期暴露于高浓度氧下，短时间治疗性接触则是有益的。
高浓度CO2培养细胞存活率维持较高，其原因可用AM原先在体内比较适应高浓度CO2环境来解释。但本研究发现，当培养气体由空气转为4.9%CO2时，AM激发光出现先降后升现象，提示细胞在由高氧环境恢复适应于正常高CO2环境时需经历功能转换过程。
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高浓度CO和CxHy对培养AM激发光也有刺激增强效应，同样属于细胞应激反应表现。CO培养AM的存活率也比空气组维持较长时间，说明它们也对AM具有某种保护作用。有关CO的细胞学作用机制已有较多研究，Miro等人报道[4]，急性CO中毒细胞的线粒体细胞色素C氧化酶活性明显受抑，因而可能增强活性氧自由基的产率。另外，CO是一种普遍存在的细胞内源性信使物质[5]，能通过激活GMP环化酶而影响细胞的多种功能，所以空气CO也可能通过这一机制对细胞产生作用。
据有关资料报告[6]，我国长航潜艇舱室空气O2含量最低为16%，CO2最高含量约1.8%，最高CO和CxHy浓度分别为35mg/m3和57mg/m3。本试验在此模拟浓度混合气环境中测得的培养AM细胞反应状况良好，同样说明AM对低氧高CO2气体环境比较适应。但不能由此认定模拟空气对人无害，因为不能排除组成人体的不同细胞、组织、器官和系统对环境条件存在不同要求或敏感性差异。
, 百拇医药
参考文献
1 胡天喜，陈 杞，陈克明等.发光分析与医学.上海：华东师范大学出版社，1990.89-103
2 Kehrer JP. Contemporary issues in toxicology:Mechanisms of hypoxic cel l in iniury.Toxicol Appl Pharmacol, 1990,106:165
3 陈 瑗，周 玫主编.自由基医学.北京：人民军医出版社，1991.394
4 MiroO,CasademontJ, Barrientos A et al. Mitochondr ial cytochrome C oxidase inhibition during acutecarbon monoxide poisoning. Phar macol Toxicol, 1998, 82(4):199
5 Cook MN, Nakatsu K, Marks GS et al. Heme oxygenase a ctivity in the adult rat aorta and liver as measured by carbon monoxide formatio n. Can J Physiol Pharmacol, 1995, 73(4):515
6 肖存杰.核潜艇舱室空气中污染物的定量分析.海军军事医学，1993，14(2)：75
(收稿：1999-06-01), http://www.100md.com
单位：海军医学研究所，上海市 200433
关键词：化学发光；肺泡巨噬细胞；氧；二氧化碳；一氧化碳；正庚烷
海军医学杂志990110 摘要 目的：用化学发光法检测O2、CO2、CO和正庚烷(CxHy)四种气体对离体家兔肺泡巨噬细胞(AM)的直接效应。方法：将AM悬液暴露于上述气体，不同时间检测用PMA激发的细胞发光及其存活率。结果：培养在99.5%N2(0.5%O2)中的AM受激发光仅能维持10h；高浓度O2、CO2、CO和CxHy具有刺激或增强AM发光之效应；含16%O2、1.9%CO2、46mg/m3CO和176mg/m3CxHy的模拟潜艇混合气体未见对AM激发光功能和存活率产生不利影响。结论：空气氧含量对细胞十分重要，提高氧浓度有利于细胞存活，但氧浓度>16%和<20%的低氧还原性气体环境更有利细胞长时间生存。
, 百拇医药
Effects of Common Gases in Submarines on Chemiluminescence
of in vitro Pulmonary Alveolus Macrophage
Xue Jianhua, Liu Zhongquan, Li Zhengnian, et al.
Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433
Abstract Objective: To examinet he directeffects of four gases-O2,CO2,CO and heptane (CxHy) on chemilu minescence of in vitro alveolus macrophage(AM) from rabbits with a luminescence technique. Methods: The AM suspension was exposed to the above-mentioned gases and the chemil umine scence of AM stimulated with phorbol myristate acetate(PMA) was examined by chemiluminometry at differenttimes. The survival rate of AM was counted with a micr oscope.Results: In the air with 0.5% O2(99.5%N2), the excited chemiluminescence of AM was only maintained for 1 0 hours, and with high concentrations of O2，CO or CxHy, the excited chemi luminescences of AMs showed a transient enhancing effect. It was found that in the mixed air with 16%O2,1.9%CO2, 46mg/m3 CO and 176mg/m3 heptane, which simulated the submarine condition, neither the luminescence function nor the viability of AM was impaired. Conclusion:O2 in the ai r is very important for in vitro cells. High concentration of O2 is beneficial to cellsurvival, but the reducing gas environment with low O2 concentration (>16% and <20%) is more favourable for prolonged living of cells.
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Key words chemiluminescence; pulmo nary alveolus macrophage; oxygen; carbon dioxide; carbon monoxide; heptane
研究表明，潜艇环境的空气质量对保持艇员身心健康十分重要，空气组分和浓度的较大变化常能改变艇员的生理和心理反应。甚至造成细胞和组织损伤。O2、CO2、CO和挥发性碳氢化合物(CxHy)是潜艇舱室空气的主要组分或常见污染成分，虽然早先已对它们的生理效应和毒性进行过较多研究，然而关于这些气体对细胞直接作用效果的实验资料并不多见。
肺泡巨噬细胞(AM)是直接接触呼吸空气的肺组织细胞之一。进行吞噬反应的AM会发生剧烈耗氧反应，释放大量可用化学发光法进行检测的自由基类物质[1]。本文利用发光技术测定了上述不同浓度气体对离体家兔AM受激发光功能的影响，以便了解潜艇常见气体在细胞水平上的作用特性。
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1 材料与方法
1.1 主要试剂 DMEM培养剂(LifeTechnologies Inc., U.S.A)；用双蒸水配制，贮4℃冰箱，鲁米诺(luminol,Sigma)；配制成0.07mmol/L的pH7.4磷酸缓冲溶液；PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate, Sigma);按要求配制成7.5μg/L的pH7.4磷酸缓冲溶液；正庚烷(上海化学试剂供应站)；分析纯，使挥发，作为CxHy之代表；配成钢瓶气：O2(99.07%)、N2(99.5%)、CO2(99.9%)和空气钢瓶气，上海第五钢铁厂产品；CO：化学发生法自制，配成钢瓶气。
1.2 主要设备 SHG-1型生物化学发光检测仪(上海市检测技术所工厂)；检测细胞发光的恒温通气培养装置(自制)；色谱分析仪。
1.3 肺泡巨噬细胞 新西兰种家兔，体重2～2.5kg，戊巴比妥纳耳缘静注麻醉，取整肺，气管灌注生理盐水洗出AM，离心洗涤3次后制成1×106AM/ml的DMEM悬液，台盼兰染料排除试验检查AM存活率。
, 百拇医药
1.4 通气培养 将AM悬液定量分装于特制平底(玻璃)培养皿(每皿1.2ml)，依次浸泡在一只培养盒的水浴中。将培养盒加盖密闭，放培养装置内37℃避光恒温培养。在培养过程中使预定浓度(色谱分析)的钢瓶气连续流经培养盒，流速100ml/min。
1.5 发光检测 接通培养装置与发光仪，待装置达到预定温度后，先测培养皿自发光本底(仪器设定：每次自动计数20s)，然后用注射器刺透培养盒盖上相应小孔的硅胶膜，向盒内每只处于装置透光窗位的培养皿先后加注0.25ml鲁米诺和0.25mlPMA工作液，立即计数，此后每隔3min自动计数1次，连续8次。
除测量AM发光的培养皿外，培养盒中用于测定AM存活率的培养皿，在培养结束后取出，用台盼兰染料排除法镜检细胞存活率。
2 结 果
2.1 检测误差
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同一样品的5个复份平均本底自发光和PMA激发发光峰积值(8次计数之和)分别为148±19cpm和4974±427cpm，变异系数(CV)分别为12.8%和8.8%。51只家兔AM暴露于空气(2h)之平均本底自发光和PMA激发光峰积值分别为137±21cpm和10165±5792cpm，CV值分别为15.3%和57.0%。
2.2 气体培养AM之激发光反应
由于AM激发光水平的个体差异较大，为便于比较，本法测定的气体暴露AM受激发光峰积值均用相对于暴露前(空气对照)值之百分率表示，结果见图1。
图1 气体对培养AM受激化学发光的影响
(图中每个数据点为3次测定之平均值)
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如图1A所示，在99.5%N2和正常空气中培养的AM激发光水平均迅速下降，分别在2h和7h左右降至暴露前的1/2，前者的培养10h激发光几乎消失。而接触50.5%O2的AM，最初3h激发光迅速增强至暴露前的2倍，然后逐步下降。图1B显示，4.9%CO2(19.8%O2)培养AM的发光反应时间曲线呈先降后升趋势，最初3h内急速下降至暴露前的43%，然后迅速回升，至第20h时达到暴露前的1.8倍。从图1C可见，CO对AM的受激发光具有强烈刺激作用。暴露于0.12和0.6g/m3CO中3h的AM激发光水平分别增加到暴露前的2.7倍和5.2倍，然后逐步下降。
相对而言，庚烷气对培养AM发光功能的影响较小(图1D)，直到浓度为6.1g/m3时，才见发光水平有较大增加(平均1倍左右，最高达到暴露前的3.8倍)。
2.3 气体培养AM的存活率
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由表1可见，空气培养AM的存活率明显随时间下降，N2气培养AM下降更显著，但在高浓度CO2、CO中培养10h或20h的AM存活率均比空气组明显有所提高，包括CxHy在内的低浓度组则不明显。
表1 气体浓度对培养AM存活率(%)的影响 气体
浓度(%)
n
通气时间(h)
0
5
10
20
空气
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对照
7
95.4±2.0
86.3±9.4
64.7±1.4*
50.3±10.4***
N2
99.5
6
95.2±6.3
53.5±24.1△
, http://www.100md.com
-
-
O2
50.5
5
96.5±1.0
85.5±9.7*
71.2±5.0*
48.8±22.5**
CO2
1.1
, 百拇医药 5
97.9±0.2
72.8±3.0*
66.4±9.0*
52.8±6.0***
4.9
7
97.0±1.6
82.9±5.1*
81.7±12.1
82.5±6.8△△
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CO
0.01
5
96.6±7.0
78.2±4.8***
68.5±6.7***
38.4±11.2***
0.05
8
96.5±2.0
93.1±6.6
87.7±2.5△△
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-
CxHy
0.05
2
96.1±1.3
68.9±6.3**
55.2±11.5**
29.2±9.5**
0.15
8
95.4±2.2
84.1±5.3*
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-
-
与暴露前比：*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001
与空气对照比：△P<0.05;△△P<0.01
2.4 多组分混合气对培养AM的影响
在含有1.9%CO2、16.3%O2、46mg/m3CO和176mg/m3CxHy的模拟潜艇气体环境中，AM受激发光也有先降后升趋势(表2)，5h和20h的水平分别比暴露前低和高40%左右，细胞存活率也始终维持较高。
表2 多组分混合气对培养AM的影响(n=5) 检测项目
, 百拇医药
通气时间(h)
0
5
10
20
AM激发光(相对值)
100
59±17**
107±36
142±45
AM存活率(%)
97.9±0.9
, http://www.100md.com 78.6±8.7
79.4±7.7
81.9±5.2
与暴露前(0h)比：**P<0.01
3 讨 论
正常细胞内存在一种微妙的产能和耗能平衡，缺氧细胞常因不能合成足够维持正常代谢所需之ATP[2]而死亡。本试验测得暴露在99.5%N2中的AM，5h存活率降至53%，10h的受激发光能力几乎完全消失，提高氧浓度则使AM激发光和存活率均获改善。但高浓度氧也能引发细胞应激反应，产生氧中毒[3]而致细胞死亡和激发光水平下降，所以应避免机体长期暴露于高浓度氧下，短时间治疗性接触则是有益的。
高浓度CO2培养细胞存活率维持较高，其原因可用AM原先在体内比较适应高浓度CO2环境来解释。但本研究发现，当培养气体由空气转为4.9%CO2时，AM激发光出现先降后升现象，提示细胞在由高氧环境恢复适应于正常高CO2环境时需经历功能转换过程。
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高浓度CO和CxHy对培养AM激发光也有刺激增强效应，同样属于细胞应激反应表现。CO培养AM的存活率也比空气组维持较长时间，说明它们也对AM具有某种保护作用。有关CO的细胞学作用机制已有较多研究，Miro等人报道[4]，急性CO中毒细胞的线粒体细胞色素C氧化酶活性明显受抑，因而可能增强活性氧自由基的产率。另外，CO是一种普遍存在的细胞内源性信使物质[5]，能通过激活GMP环化酶而影响细胞的多种功能，所以空气CO也可能通过这一机制对细胞产生作用。
据有关资料报告[6]，我国长航潜艇舱室空气O2含量最低为16%，CO2最高含量约1.8%，最高CO和CxHy浓度分别为35mg/m3和57mg/m3。本试验在此模拟浓度混合气环境中测得的培养AM细胞反应状况良好，同样说明AM对低氧高CO2气体环境比较适应。但不能由此认定模拟空气对人无害，因为不能排除组成人体的不同细胞、组织、器官和系统对环境条件存在不同要求或敏感性差异。
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参考文献
1 胡天喜，陈 杞，陈克明等.发光分析与医学.上海：华东师范大学出版社，1990.89-103
2 Kehrer JP. Contemporary issues in toxicology:Mechanisms of hypoxic cel l in iniury.Toxicol Appl Pharmacol, 1990,106:165
3 陈 瑗，周 玫主编.自由基医学.北京：人民军医出版社，1991.394
4 MiroO,CasademontJ, Barrientos A et al. Mitochondr ial cytochrome C oxidase inhibition during acutecarbon monoxide poisoning. Phar macol Toxicol, 1998, 82(4):199
5 Cook MN, Nakatsu K, Marks GS et al. Heme oxygenase a ctivity in the adult rat aorta and liver as measured by carbon monoxide formatio n. Can J Physiol Pharmacol, 1995, 73(4):515
6 肖存杰.核潜艇舱室空气中污染物的定量分析.海军军事医学，1993，14(2)：75
(收稿：1999-06-01), http://www.100md.com