氧暴露剂量对自由基和红细胞免疫功能的影响
作者：王文波 刘景昌 郭峰 陈世明 倪大智 姜德玺
单位：王文波(海军医学研究所，上海市 200433)；刘景昌(海军医学研究所，上海市 200433)；倪大智(海军医学研究所，上海市 200433)；姜德玺(海军医学研究所，上海市 200433)；郭峰(第二军医大学长海医院)；陈世明(复旦大学分析测试中心)
关键词：高压氧；自由基；红细胞免疫；氧剂量
海军医学杂志000109 摘 要：目的：探讨高压氧(HBO)暴露剂量与肺组织内自由基和红 细胞免疫功能的量效关系。方法：采用SD大鼠在0.3MPa(3ATA) 下暴露，氧暴露剂量分别为400、650、700、850、1000和1 100UPTD。检测各暴露组、正常对照组和N2-O2组肺组织自由基和红细胞免疫受体花环率。结果：肺组织内自由基波谱峰值，随氧暴露剂量加大逐渐升高(P<0.01)；红细胞免 疫受体花环率则呈进行性下降(P<0.01～0.05)。结论：在本实验氧剂量范围内，肺组织自由基量变与氧暴露剂量有关。在一定剂量范围内，ESR波谱峰值随剂量加大逐渐升高。氧暴露剂量达到一定程度时，对红细胞免疫功能有明显影响。
, 百拇医药
Effects of Oxygen Exposure Doses on Free Radicals and
Red Blood Cell(RBC) Immunologic Function
Wang Wenbo, Liu Jingchang, Guo Feng
(Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433)
Abstract：Aim：To investgate the relation of different oxygen exposure doses with free radicals of lung tissue and red blood cell immun ologic function in rats. Methods：SD rats were exposed to 0.3MPa oxygen in six different doses, i.e., 400, 650, 700, 850, 1 000 and 1 100UPTD . Then the free radicals of lung tissue and rate of RBC immune receptor rosette were determined in these exposure groups respectively as well as in the normal control and N2-O2 groups. Results：The peak value of electron spin resonance(ESR) spectra of the lung tissue rose with increasing oxy gen exposure doses(P<0.01), while the RBC immune rece ptor rosette was on progrssive decrease(P<0.05～0.01). Conclusion：There was a significant correlation between chang es in free radicals of lung tissue and oxygen exposure doses in the oxygen dose range of the present experiment. The peak value of ESR spectra rose with the inc rease of oxygen exposure doses between 400 to 850 UPTD. The oxygen exposure dose s had remarkable effects on the RBC immunologic function.
, 百拇医药
Key words：hyperbaric oxygen; free radicals; red blood cell immunity; oxygen doses▲
高压氧对某些疾病的治疗作用已被确认，但 大剂量氧暴露时，可导致机体的超剂量反 应，甚至出现某些机能改变。而自由基和机体的免疫功能与机体的功能状况以及众多疾病密 切相关。氧暴露剂量、自由基和免疫功能的关系如何，这方面的研究并不多见， 亦未引起 人们足够的重视。为此， 本实验以SD大鼠为实验对象，探讨了氧暴露剂量、肺组织内自由基变化和红细胞免疫功能三者的量效 关系。
1 材料与方法
实验用96只雄性大鼠，体重226.5±41.5g,分批随机分为8个实验组。除对照组外，实验均在 高压舱内进行。0.3MPa气压暴露时，舱内CO2浓度<0.03%，氧暴露时O2浓度>99.5%(Nn an Jiaky-2F测氧仪)。氧暴露剂量按Wright法[1]计量，一次暴露完成。暴露剂量 分别为400、650、700、850、1 000和1 100UPTD，氮氧暴露组PO2为0.02MPa，暴 露时间与1 100UPTD组相同。
, 百拇医药
高压暴露后的大鼠用0.015mg/kg戊巴比妥钠麻醉，用ESR技术测定肺组织内自由基，方法见 参考文献[2]。红细胞免疫功能测定按参考文献[3]中方法进行。数据处理采用团体[ WT5BX t检验。
2 结 果
2.1 不同氧剂量暴露后肺组织内自由基的变化
不同的氧剂量暴露后，肺组织匀浆上清液测定的ESR波谱见图1。图谱信号的g=2.0054,αH =1.8G，△HPP=0.60G。
图1 大鼠暴露于不同氧剂量的肺匀浆ESR波谱
每个样品测定得到两个波峰，波峰高度表示肺组织内自由基含量的多少。将两 峰高的均值列于表1。
, 百拇医药
表1 不同氧剂量暴露后肺组织匀浆自由基信号强度的变化(
±s) 组 别
样本数(n)
ESR信号强度 (mm)
对照组
13
22. 33±4. 40
400 UPTD
10
27. 85±3. 35**
650 UPTD
, 百拇医药
8
29. 53±4. 06**
850 UPTD
20
33. 00±4. 09**
1100 UPTD
20
29. 11±6. 39**
与对照组比** P<0.01
由表1可见，随着氧暴露剂量的增大，自由基信号波幅亦随之显著增高。当氧暴露剂量 达4 00UPTD时，其峰值比对照值升高24.7%(P<0.01)；650UPTD时，比对 照值 升高32.24%(P<0.01)；850UPTD时，比对照值升高47.78%(P <0.01)；而当氧暴露剂量达到1 100UPTD时，其峰值虽仍比对照值升高30.36% (P<0.01)，但其升高的幅度却比暴露650和850UPTD时有所降低。
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2.2 不同氧剂量暴露后红细胞免疫功能的改变
各实验组在HBO暴露不同剂量后，红细胞免疫功能测定结果列于表2。
表2 不同氧剂量暴露后大鼠红细胞免疫功能的变化(±s) 分组(n=8)
红细胞C3b受体花环率(%)
免疫复合物花环率( %)
对照组
27.00±10.74
15.63±4.53
N2-O2
, 百拇医药
18.75±9.35
15.88±8.71
700 UPTD
17.50±6.30*
10.50±2.56*
850 UPTD
20.75±8.35
9.75±2.25**▲
900 UPTD
11.75±4.49**▲
, 百拇医药
9.75±1.67**▲
1 000 UPTD
5.38±2.20**▲▲
8.38±3.24**▲
1 100 UPTD
8.88±1.96**▲
6.63±3.20**▲▲
与对照组比较* P<0.05, ** P<0.01；与N2-O2组比较▲ P<0.05, ▲▲ P<0.01
, http://www.100md.com 从表2可见，红细胞C3b受体花环(RC3bRR)随氧暴露剂量加大而递减，当氧 暴露剂量达到1 000～1 100UPTD时，RC3bRR虽然仍呈现减低趋势，但两组间并未随剂 量增加而进一步降低，两者无显著差异(P>0.01)。
RC3bRR除850UPTD组外，各组与对照值相比均显著降低(P<0.05或P<0.01)。 由于氮氧组变异相对较大，因此，氧暴露组与其比较只在大剂量暴露时出现显著差异(P<0.0 5或P<0.01)。红细胞免疫复合物花环率(RICR)变化趋势基本与RC3bRR变化相同。
3 讨 论
3.1 氧暴露剂量对肺组织自由基的影响
氧对需氧生物体具有两重性，即利弊共存。氧支持着一切生命活动，但一定氧压时程的暴露 又可引起机体的超剂量反应或组织损伤。氧的这种截然不同的两种反应，在剂量时程上如何 界定，弄清两种反应的界限，不但可促进氧合理充分的利用，还可有效地预防超剂量反应或 组织损伤的发生。正常情况下，机体组织细胞有氧代谢过程中也有活性氧(ROS)生成。这种 具有很高生物活性物质的多寡，决定着组织细胞衰变或损伤程度[4，5]。在本实 验条件下，用ESR测得的自由基波谱表明，自由基含量与氧暴露剂量有关。在一定氧剂量范 围内，自由基波谱峰值随氧暴露剂量加大逐渐升高。这种升高可能是因外源性氧分压增高， 使机体代谢过程中ROS增多所致。Torbati等曾证实在αH=1.8G时出现的双峰波谱为维生素 C(Vc·-自由基。由于Vc是一种不饱和的多羟基 内酯化合物，其分子内C 2和C3之间的烯醇式羟基上的氢易解离， 通过与O2-和·OH反应，使自由基 解除活力。细胞膜中含有多价不饱和脂肪酸，这些多价不饱和脂肪酸都含有不稳定的双键结 构，易受氧自由基攻击产生分子内的电子跃迁，而发生脂质过氧化，影响细胞功能甚至细胞 凋亡。Vc与自由基反应保护了机体组织细胞，通过反应Vc自身也转变为脱氢Vc。此外，随着 高氧暴露时间的延长，机体内环境可能发生了一定的变化，即由高氧转变为缺氧[6] 。此时的金属离子可以由结合态转变为游离态[7]而使Vc由抗氧化状态变为促氧 化状态。这样致使Vc大量消耗，因而在1 100UPTD时，ERS波谱振幅亦随之降低。因此， 我们认为在短时的大剂量氧冲击下，正常生理情况下的Vc浓度不足以抑制脂质过氧化的发生 。
, 百拇医药
3.2 氧暴露剂量对红细胞免疫功能的影响
自从1981年Siegel等提出了红细胞膜上C3b受体参与机体的免疫调控功能后，已被众 多实验所证实[3，8，10]。C3b受体虽然仅为白细胞的1/20～1/60，但 血液中红细胞总数约为白细胞的1 000倍。因此，C3b受体识别、粘附、浓缩、杀伤抗 原和清除有害物质的机遇相对多于白细胞，在许多疾病中起着极为重要的免疫调控作用。本 实验对大剂量氧暴露下C3b受体免疫功能改变进行的探讨表明，RC3bRR随氧剂 量增加而降低，在暴露剂量达到900UPTD后的各剂量组RC3bRR递减更为显著，RICR亦 呈现递减趋势。C3b受体是C3β-球蛋白受C3转化酶作用降解的生物活性受体，其 亚稳性结合部可与生物活性颗粒结合，如免疫复合物、酵母菌、细菌、寄生虫和肿瘤细胞。 本实验条件下批量受试动物RC3bRR低下，不能用占位学说解释，因为RICR亦随氧暴 露剂量增加而降低(P<0.05或P<0.01)。这种随氧暴露剂量增加花环率递 减的趋向，可能与HBO条件下抑制了与受体有关的含有巯基的酶的活性有关；此外，本实验 测得组织内活性氧自由基增多亦为花环率的降低提供了证据，因为C3b受体是一种糖 蛋白，它通过与糖基磷酸肌醇(GPI)共价锚着于细胞膜上，自由基的增加使其共价键受损而 使C3b受体失活或脱落，因而导致了RC3bRR下降。
, 百拇医药
从本实验测定结果看，HBO条件下大剂量氧暴露，肺组织内自由基增加迅速使得红细胞免疫 功能受损。RICR的下降表明RC3bRR低下为HBO条件下所致的原发性降低。自由基的增 加与氧暴露剂量有明显的正相关，而RC3bRR、RICR的下降与氧暴露剂量则呈负相关。
参考文献：
[1]Wright WB. Calculation of cumulative pulmonary oxygen toxicity. AD 742468,1972
[2]王文波，刘景昌，陈士明等.高压氧暴露后大鼠肺表面活性物质与肺组织自由基 的变化.中华航海医学杂志，1998，5(4)：203
[3]郭 峰，虞紫茜，赵中平.红细胞免疫功能的初步研究.中华医学杂志，1982，62：715
, 百拇医药
[4]Forrest VJ, Kang YH, McClain DE et al. Oxidative stress- induced apoptosis prevented by trolox. Free Rad Biol Med, 1994, 16(6):675
[5]Deneke SM, Fanburg BL. Oxygen toxicity of the lung:an update. Br J Anaesth, 1982, 54:737
[6]王恒星.氧中毒.见：龚锦涵主编.潜水医学.北京：人民军医出版社，1985.290
[7]Niki E. Action of ascorbic acid as a scavenger of active and stable oxygen radicals. Am J Clin Nutr, 1991, 54(suppl):1119
, http://www.100md.com
[8]Siegel I, Liu TL, Gleicher N. The red blood cell immune system. Lancet,1981, 2(8246):556
[9]Rasmussen JM, Jepsen HH. Svehag SE. Influence of processing by erythro cyte C3b/C4b receptors (CR) on binding of immune complexes to reji cells and polymorphonuclear granulocytes. Scad J Immunol, 1987, 26:437
收稿日期：1999-03-12, 百拇医药
单位：王文波(海军医学研究所，上海市 200433)；刘景昌(海军医学研究所，上海市 200433)；倪大智(海军医学研究所，上海市 200433)；姜德玺(海军医学研究所，上海市 200433)；郭峰(第二军医大学长海医院)；陈世明(复旦大学分析测试中心)
关键词：高压氧；自由基；红细胞免疫；氧剂量
海军医学杂志000109 摘 要：目的：探讨高压氧(HBO)暴露剂量与肺组织内自由基和红 细胞免疫功能的量效关系。方法：采用SD大鼠在0.3MPa(3ATA) 下暴露，氧暴露剂量分别为400、650、700、850、1000和1 100UPTD。检测各暴露组、正常对照组和N2-O2组肺组织自由基和红细胞免疫受体花环率。结果：肺组织内自由基波谱峰值，随氧暴露剂量加大逐渐升高(P<0.01)；红细胞免 疫受体花环率则呈进行性下降(P<0.01～0.05)。结论：在本实验氧剂量范围内，肺组织自由基量变与氧暴露剂量有关。在一定剂量范围内，ESR波谱峰值随剂量加大逐渐升高。氧暴露剂量达到一定程度时，对红细胞免疫功能有明显影响。
, 百拇医药
Effects of Oxygen Exposure Doses on Free Radicals and
Red Blood Cell(RBC) Immunologic Function
Wang Wenbo, Liu Jingchang, Guo Feng
(Naval Medical Research Institute, Shanghai 200433)
Abstract：Aim：To investgate the relation of different oxygen exposure doses with free radicals of lung tissue and red blood cell immun ologic function in rats. Methods：SD rats were exposed to 0.3MPa oxygen in six different doses, i.e., 400, 650, 700, 850, 1 000 and 1 100UPTD . Then the free radicals of lung tissue and rate of RBC immune receptor rosette were determined in these exposure groups respectively as well as in the normal control and N2-O2 groups. Results：The peak value of electron spin resonance(ESR) spectra of the lung tissue rose with increasing oxy gen exposure doses(P<0.01), while the RBC immune rece ptor rosette was on progrssive decrease(P<0.05～0.01). Conclusion：There was a significant correlation between chang es in free radicals of lung tissue and oxygen exposure doses in the oxygen dose range of the present experiment. The peak value of ESR spectra rose with the inc rease of oxygen exposure doses between 400 to 850 UPTD. The oxygen exposure dose s had remarkable effects on the RBC immunologic function.
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Key words：hyperbaric oxygen; free radicals; red blood cell immunity; oxygen doses▲
高压氧对某些疾病的治疗作用已被确认，但 大剂量氧暴露时，可导致机体的超剂量反 应，甚至出现某些机能改变。而自由基和机体的免疫功能与机体的功能状况以及众多疾病密 切相关。氧暴露剂量、自由基和免疫功能的关系如何，这方面的研究并不多见， 亦未引起 人们足够的重视。为此， 本实验以SD大鼠为实验对象，探讨了氧暴露剂量、肺组织内自由基变化和红细胞免疫功能三者的量效 关系。
1 材料与方法
实验用96只雄性大鼠，体重226.5±41.5g,分批随机分为8个实验组。除对照组外，实验均在 高压舱内进行。0.3MPa气压暴露时，舱内CO2浓度<0.03%，氧暴露时O2浓度>99.5%(Nn an Jiaky-2F测氧仪)。氧暴露剂量按Wright法[1]计量，一次暴露完成。暴露剂量 分别为400、650、700、850、1 000和1 100UPTD，氮氧暴露组PO2为0.02MPa，暴 露时间与1 100UPTD组相同。
, 百拇医药
高压暴露后的大鼠用0.015mg/kg戊巴比妥钠麻醉，用ESR技术测定肺组织内自由基，方法见 参考文献[2]。红细胞免疫功能测定按参考文献[3]中方法进行。数据处理采用团体[ WT5BX t检验。
2 结 果
2.1 不同氧剂量暴露后肺组织内自由基的变化
不同的氧剂量暴露后，肺组织匀浆上清液测定的ESR波谱见图1。图谱信号的g=2.0054,αH =1.8G，△HPP=0.60G。
图1 大鼠暴露于不同氧剂量的肺匀浆ESR波谱
每个样品测定得到两个波峰，波峰高度表示肺组织内自由基含量的多少。将两 峰高的均值列于表1。
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表1 不同氧剂量暴露后肺组织匀浆自由基信号强度的变化(
±s) 组 别样本数(n)
ESR信号强度 (mm)
对照组
13
22. 33±4. 40
400 UPTD
10
27. 85±3. 35**
650 UPTD
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8
29. 53±4. 06**
850 UPTD
20
33. 00±4. 09**
1100 UPTD
20
29. 11±6. 39**
与对照组比** P<0.01
由表1可见，随着氧暴露剂量的增大，自由基信号波幅亦随之显著增高。当氧暴露剂量 达4 00UPTD时，其峰值比对照值升高24.7%(P<0.01)；650UPTD时，比对 照值 升高32.24%(P<0.01)；850UPTD时，比对照值升高47.78%(P <0.01)；而当氧暴露剂量达到1 100UPTD时，其峰值虽仍比对照值升高30.36% (P<0.01)，但其升高的幅度却比暴露650和850UPTD时有所降低。
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2.2 不同氧剂量暴露后红细胞免疫功能的改变
各实验组在HBO暴露不同剂量后，红细胞免疫功能测定结果列于表2。
表2 不同氧剂量暴露后大鼠红细胞免疫功能的变化(
±s) 分组(n=8)红细胞C3b受体花环率(%)
免疫复合物花环率( %)
对照组
27.00±10.74
15.63±4.53
N2-O2
, 百拇医药
18.75±9.35
15.88±8.71
700 UPTD
17.50±6.30*
10.50±2.56*
850 UPTD
20.75±8.35
9.75±2.25**▲
900 UPTD
11.75±4.49**▲
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9.75±1.67**▲
1 000 UPTD
5.38±2.20**▲▲
8.38±3.24**▲
1 100 UPTD
8.88±1.96**▲
6.63±3.20**▲▲
与对照组比较* P<0.05, ** P<0.01；与N2-O2组比较▲ P<0.05, ▲▲ P<0.01
, http://www.100md.com 从表2可见，红细胞C3b受体花环(RC3bRR)随氧暴露剂量加大而递减，当氧 暴露剂量达到1 000～1 100UPTD时，RC3bRR虽然仍呈现减低趋势，但两组间并未随剂 量增加而进一步降低，两者无显著差异(P>0.01)。
RC3bRR除850UPTD组外，各组与对照值相比均显著降低(P<0.05或P<0.01)。 由于氮氧组变异相对较大，因此，氧暴露组与其比较只在大剂量暴露时出现显著差异(P<0.0 5或P<0.01)。红细胞免疫复合物花环率(RICR)变化趋势基本与RC3bRR变化相同。
3 讨 论
3.1 氧暴露剂量对肺组织自由基的影响
氧对需氧生物体具有两重性，即利弊共存。氧支持着一切生命活动，但一定氧压时程的暴露 又可引起机体的超剂量反应或组织损伤。氧的这种截然不同的两种反应，在剂量时程上如何 界定，弄清两种反应的界限，不但可促进氧合理充分的利用，还可有效地预防超剂量反应或 组织损伤的发生。正常情况下，机体组织细胞有氧代谢过程中也有活性氧(ROS)生成。这种 具有很高生物活性物质的多寡，决定着组织细胞衰变或损伤程度[4，5]。在本实 验条件下，用ESR测得的自由基波谱表明，自由基含量与氧暴露剂量有关。在一定氧剂量范 围内，自由基波谱峰值随氧暴露剂量加大逐渐升高。这种升高可能是因外源性氧分压增高， 使机体代谢过程中ROS增多所致。Torbati等曾证实在αH=1.8G时出现的双峰波谱为维生素 C(Vc·-自由基。由于Vc是一种不饱和的多羟基 内酯化合物，其分子内C 2和C3之间的烯醇式羟基上的氢易解离， 通过与O2-和·OH反应，使自由基 解除活力。细胞膜中含有多价不饱和脂肪酸，这些多价不饱和脂肪酸都含有不稳定的双键结 构，易受氧自由基攻击产生分子内的电子跃迁，而发生脂质过氧化，影响细胞功能甚至细胞 凋亡。Vc与自由基反应保护了机体组织细胞，通过反应Vc自身也转变为脱氢Vc。此外，随着 高氧暴露时间的延长，机体内环境可能发生了一定的变化，即由高氧转变为缺氧[6] 。此时的金属离子可以由结合态转变为游离态[7]而使Vc由抗氧化状态变为促氧 化状态。这样致使Vc大量消耗，因而在1 100UPTD时，ERS波谱振幅亦随之降低。因此， 我们认为在短时的大剂量氧冲击下，正常生理情况下的Vc浓度不足以抑制脂质过氧化的发生 。
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3.2 氧暴露剂量对红细胞免疫功能的影响
自从1981年Siegel等提出了红细胞膜上C3b受体参与机体的免疫调控功能后，已被众 多实验所证实[3，8，10]。C3b受体虽然仅为白细胞的1/20～1/60，但 血液中红细胞总数约为白细胞的1 000倍。因此，C3b受体识别、粘附、浓缩、杀伤抗 原和清除有害物质的机遇相对多于白细胞，在许多疾病中起着极为重要的免疫调控作用。本 实验对大剂量氧暴露下C3b受体免疫功能改变进行的探讨表明，RC3bRR随氧剂 量增加而降低，在暴露剂量达到900UPTD后的各剂量组RC3bRR递减更为显著，RICR亦 呈现递减趋势。C3b受体是C3β-球蛋白受C3转化酶作用降解的生物活性受体，其 亚稳性结合部可与生物活性颗粒结合，如免疫复合物、酵母菌、细菌、寄生虫和肿瘤细胞。 本实验条件下批量受试动物RC3bRR低下，不能用占位学说解释，因为RICR亦随氧暴 露剂量增加而降低(P<0.05或P<0.01)。这种随氧暴露剂量增加花环率递 减的趋向，可能与HBO条件下抑制了与受体有关的含有巯基的酶的活性有关；此外，本实验 测得组织内活性氧自由基增多亦为花环率的降低提供了证据，因为C3b受体是一种糖 蛋白，它通过与糖基磷酸肌醇(GPI)共价锚着于细胞膜上，自由基的增加使其共价键受损而 使C3b受体失活或脱落，因而导致了RC3bRR下降。
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从本实验测定结果看，HBO条件下大剂量氧暴露，肺组织内自由基增加迅速使得红细胞免疫 功能受损。RICR的下降表明RC3bRR低下为HBO条件下所致的原发性降低。自由基的增 加与氧暴露剂量有明显的正相关，而RC3bRR、RICR的下降与氧暴露剂量则呈负相关。
参考文献：
[1]Wright WB. Calculation of cumulative pulmonary oxygen toxicity. AD 742468,1972
[2]王文波，刘景昌，陈士明等.高压氧暴露后大鼠肺表面活性物质与肺组织自由基 的变化.中华航海医学杂志，1998，5(4)：203
[3]郭 峰，虞紫茜，赵中平.红细胞免疫功能的初步研究.中华医学杂志，1982，62：715
, 百拇医药
[4]Forrest VJ, Kang YH, McClain DE et al. Oxidative stress- induced apoptosis prevented by trolox. Free Rad Biol Med, 1994, 16(6):675
[5]Deneke SM, Fanburg BL. Oxygen toxicity of the lung:an update. Br J Anaesth, 1982, 54:737
[6]王恒星.氧中毒.见：龚锦涵主编.潜水医学.北京：人民军医出版社，1985.290
[7]Niki E. Action of ascorbic acid as a scavenger of active and stable oxygen radicals. Am J Clin Nutr, 1991, 54(suppl):1119
, http://www.100md.com
[8]Siegel I, Liu TL, Gleicher N. The red blood cell immune system. Lancet,1981, 2(8246):556
[9]Rasmussen JM, Jepsen HH. Svehag SE. Influence of processing by erythro cyte C3b/C4b receptors (CR) on binding of immune complexes to reji cells and polymorphonuclear granulocytes. Scad J Immunol, 1987, 26:437
收稿日期：1999-03-12, 百拇医药