采用基因释放剂对微量及陈早标本进行直接PCR扩增
作者：阎月 李世荣 韩英 晨智敏
单位：阎月(北京军区总医院消化科，北京100700)；李世荣(北京军区总医院消化科，北京100700)韩英(北京军区总医院消化科，北京100700)；晨智敏(北京军区总医院消化科，北京100700)
关键词：基因释放剂；直接PCR扩增；微量、陈旧标本
基础医学与临床000226
摘要：为简化PCR方法和减少标本用量，利用基因释放剂不提取DNA，比较了利用基因释放剂和不用基因释放剂，对微量肝素抗凝血、微量结肠粘膜组织(置-20℃，6个月)和含有PCR抑制剂的DNA标本直接进行PCR扩增。结果，利用基因释放剂，可扩增出目的产物，不用基因释放剂，未扩增出目的产物。提示利用基因释放剂直接进行PCR，简单快速，不用提取DNA，适于微量、含有PCR抑制物的DNA及陈旧组织标本的检测。
, http://www.100md.com
中图分类号 ：R349.8 文献标识码：A
文章编号：1001-6325 (2000)02-0087-02
Direct PCR amplification from samples of microliters/micrograms
and long term storage by using gene releaser
YAN Yue，LI Shi-rong，HAN Ying，et al
(GI Unit ,Beijing Army General Hospital Beijing 100700， China)
Abstract ：In order to simplify PCR without extraction of DNA,and to detect the samples with PCR inhibitors,and to minimize the size of samples to a few microliters/micrograms,gene releaser was used.Heparinized blood samples of microliters,colonic mucosa tissues(stored in -20℃ over 6 months)of micrograms and DNA samples with PCR inhibitors were checked with direct PCR with and without (as control) gene releaser.PCR amplification product was positive with gene releaser,but negative without.Gene releaser is a very useful agent for the rapid and simplified direct PCR amplification without extraction of DNA,and suitable for detection of samples of microliters/micrograms and DNA with PCR inhibitors as well as the long time stored tissues.
, 百拇医药
Key words ：gene releaser ；direct PCR amplification ；Samples of microliters/micrograms and long term stored
传统的PCR扩增前，将标本进行DNA提取作为扩增模板。一般程序包括对细胞或组织的裂解、DNA释放和提取，以去除蛋白质及PCR抑制剂。DNA模板的制备方法很多，有经典的去污剂、蛋白酶消化法、加热-裂解法等，所需的标本量多，程序复杂。当细胞或组织标本量太少不能按上述常规方法提取时，须用少量标本直接进行PCR。扩增前，需对组织标本进行破碎，酶消化，然后加热处理，这类方法限于新鲜血标本和冷藏完好的组织标本以及有经验的实验人员才能进行[1～4]。 本文采用基因释放剂对微量陈旧标本进行直接PCR，获得良好效果，现介绍如下：
1 材料与方法
1.1 标本的采集
, http://www.100md.com
下列标本均采自本院门诊、内窥镜室及手术室：常规采取肝素抗凝血，常温保存两天，备用；实验当时，按常规方法采取指(耳)末梢血，弃去第一滴血，取1mL，迅速放入盛有20mL基因释放剂的0.5mL eppendorf管；纤维结肠镜活检的结肠组织1mm3，放入0.5mL的eppendorf管，置-20℃冰箱，六个月，备用；粗提的DNA样品——由手术切除的结肠组织，用酚/氯仿、异戊醇法粗提的DNA，作PCR的模板，而没有扩增出PCR产物。
1.2 试剂
基因释放剂(Genereleaser)美国Bio Ventures公司生产。引物：APC基因15外显子的1596～1702密码子，即J 段，扩增长度为318bp，由赛百盛生物工程公司合成。dNTP及Taq DNA聚合酶为原平生物技术公司产品。
1.3 实验方法
1.3.1 用基因释放剂裂解细胞、释放DNA ：取1mL血标本、粗提的DNA或约半芝麻粒大小组织标本置入含有20mL GeneReleaser的0.5mL eppendorf管底，加50mL 液体石蜡油，按下列顺序在PCR仪中进行热处理：65℃ 30s，8℃ 30s，65℃ 90s，97℃ 180s，8℃ 60s，65℃ 180s，97℃ 60s，65℃ 60s，80℃放置。
, 百拇医药
1.3.2 进行PCR扩增参照J Sambrook方法[5]
将上述反应试管加入PCR反应体系(100mL体系中，含0.2mmol/L dNTPs，上下游引物各50pmol，1.5mmol/L MgCl2，10×PCR buffer 10mL)，加入Taq DNA聚合酶2u，混匀，在PCR仪上进行扩增反应，94℃预变性4s，94℃ 变性30s，53℃ 退火45s，72℃ 延伸45s，循环35次，72℃ 延伸10min。
1.3.3 PCR扩增产物的检测：取10mL 扩增产物点样于1.5% 琼脂糖凝胶(含EB)，50V，电泳1h，紫外灯下观察条带并照像。
2 结果与讨论
肝素化全血进行直接PCR未得到目的产物。根据报道，肝素保存的血样品很难扩增出来，肝素、血红蛋白及铁离子等有抑制PCR的作用，我们的实验也表明这些样品中含有PCR抑制物或DNA没有释放出来 ；使用基因释放剂将常温保存的肝素化全血扩增出了特异产物，得到与新鲜血标本同样的结果，表明基因释放剂有使DNA从细胞中释放，拮抗肝素等PCR抑制物的作用。有实验表明EDTA法收集的人类全血储存于4℃或更低温度扩增效果不好，可能由于细胞间蛋白质发生凝集所致。我们的实验提示采用室温保存两日的肝素化全血，能得到较好的扩增效果(见图1)。
, http://www.100md.com
我们直接扩增结肠组织，不使用基因释放剂未得到特异产物，表明结肠组织仅靠冻融，DNA可能未释放出来或有PCR抑制物存在；使用了基因释放剂，得到特异产物；表明基因释放剂有裂解细胞、释放DNA和拮抗PCR抑制物的作用。常规不用基因释放剂对组织进行PCR，须先将组织匀浆，微量组织经过冻融；使用基因释放剂，可以省略匀浆这一步，直接进行PCR。有实验表明基因释放剂能使-20℃存放45天的EDTA保存的血标本中DNA扩增出来，而对这种方法保存六个月的血标本扩增效果很不理想。我们扩增了-20℃存放六个月的陈归结肠组织标本，得到了良好效果。
对有PCR抑制剂的DNA标本，不用基因释放剂未得到特异扩增产物，采用基因释放剂，得到特异扩增产物。表明基因释放剂对于干扰扩增反应的抑制剂有拮抗作用。提示今后PCR实验时，遇到提取的DNA含有PCR抑制物时，可使用基因释放剂来解决(见图1)，其原因有待研究。
利用基因释放剂直接进行PCR优点如下：1.省略了复杂的提取DNA的步骤，省时、省力；2.解决了实验要求样品质量、数量严格的问题，对某些难得的样品如肝素化全血、陈旧组织标本等微量即可使用，使得特殊研究成为可能。
, http://www.100md.com
图1 基因释放剂对微量、陈旧标本直接进行PCR
Fig 1 Direct PCR from Samples of Microliters/Micrograms & Long Time Stored by Using Gene Releaser.
The PCR product for Exon 15-J of APC gene was electrophoresed in 1.5% agaarose gel and stain with ethidium bromide.
1:size marker(PBR 322/Hinfl). 2: colonic mucosa tissues+Gene Releaser. 3: colonic mucosa tissues.4:Heparinized blood +Gene Releaseer. 5: Heparinized blood. 6: fresh whole blood+Gene Releaseer. 7: DNA samples with PCR inhibitors. 8 : DNA samples with PCR inhibitors+Gene Releaser.
, 百拇医药
[1]McCusker J,Dawson MT,Noone D，et al.Improved method for direct PCR amplication from whole blood[J].Nucleic Acid Res，1992，20(24)：6747
[2]高惠兰，许建宁，方福德.用少量细胞直接进行聚合酶链反应[J].基础医学与临床，1993，13：236-237.
[3]Mercier B，Gaucher C,Feugeas O,et al.Direct PCR from whole blood，without DNA extratio[J].Nucleic Acids Res，1990，18(19):5908
[4]Makowski GS，Davis EL，Hopfer SM.The effect of storage on Guthrie cards :implications for deoxyibonucleicleic acid amplication[J].Ann Clin Lab Sci，1996, 26(5):458-69.
[5] J Sambrook，E F Fritsch and T Maniatis.分子克隆实验指南[M].科学出版社.
收稿日期：1998-08-01；修订日期：1998-09-14, 百拇医药
单位：阎月(北京军区总医院消化科，北京100700)；李世荣(北京军区总医院消化科，北京100700)韩英(北京军区总医院消化科，北京100700)；晨智敏(北京军区总医院消化科，北京100700)
关键词：基因释放剂；直接PCR扩增；微量、陈旧标本
基础医学与临床000226
摘要：为简化PCR方法和减少标本用量，利用基因释放剂不提取DNA，比较了利用基因释放剂和不用基因释放剂，对微量肝素抗凝血、微量结肠粘膜组织(置-20℃，6个月)和含有PCR抑制剂的DNA标本直接进行PCR扩增。结果，利用基因释放剂，可扩增出目的产物，不用基因释放剂，未扩增出目的产物。提示利用基因释放剂直接进行PCR，简单快速，不用提取DNA，适于微量、含有PCR抑制物的DNA及陈旧组织标本的检测。
, http://www.100md.com
中图分类号 ：R349.8 文献标识码：A
文章编号：1001-6325 (2000)02-0087-02
Direct PCR amplification from samples of microliters/micrograms
and long term storage by using gene releaser
YAN Yue，LI Shi-rong，HAN Ying，et al
(GI Unit ,Beijing Army General Hospital Beijing 100700， China)
Abstract ：In order to simplify PCR without extraction of DNA,and to detect the samples with PCR inhibitors,and to minimize the size of samples to a few microliters/micrograms,gene releaser was used.Heparinized blood samples of microliters,colonic mucosa tissues(stored in -20℃ over 6 months)of micrograms and DNA samples with PCR inhibitors were checked with direct PCR with and without (as control) gene releaser.PCR amplification product was positive with gene releaser,but negative without.Gene releaser is a very useful agent for the rapid and simplified direct PCR amplification without extraction of DNA,and suitable for detection of samples of microliters/micrograms and DNA with PCR inhibitors as well as the long time stored tissues.
, 百拇医药
Key words ：gene releaser ；direct PCR amplification ；Samples of microliters/micrograms and long term stored
传统的PCR扩增前，将标本进行DNA提取作为扩增模板。一般程序包括对细胞或组织的裂解、DNA释放和提取，以去除蛋白质及PCR抑制剂。DNA模板的制备方法很多，有经典的去污剂、蛋白酶消化法、加热-裂解法等，所需的标本量多，程序复杂。当细胞或组织标本量太少不能按上述常规方法提取时，须用少量标本直接进行PCR。扩增前，需对组织标本进行破碎，酶消化，然后加热处理，这类方法限于新鲜血标本和冷藏完好的组织标本以及有经验的实验人员才能进行[1～4]。 本文采用基因释放剂对微量陈旧标本进行直接PCR，获得良好效果，现介绍如下：
1 材料与方法
1.1 标本的采集
, http://www.100md.com
下列标本均采自本院门诊、内窥镜室及手术室：常规采取肝素抗凝血，常温保存两天，备用；实验当时，按常规方法采取指(耳)末梢血，弃去第一滴血，取1mL，迅速放入盛有20mL基因释放剂的0.5mL eppendorf管；纤维结肠镜活检的结肠组织1mm3，放入0.5mL的eppendorf管，置-20℃冰箱，六个月，备用；粗提的DNA样品——由手术切除的结肠组织，用酚/氯仿、异戊醇法粗提的DNA，作PCR的模板，而没有扩增出PCR产物。
1.2 试剂
基因释放剂(Genereleaser)美国Bio Ventures公司生产。引物：APC基因15外显子的1596～1702密码子，即J 段，扩增长度为318bp，由赛百盛生物工程公司合成。dNTP及Taq DNA聚合酶为原平生物技术公司产品。
1.3 实验方法
1.3.1 用基因释放剂裂解细胞、释放DNA ：取1mL血标本、粗提的DNA或约半芝麻粒大小组织标本置入含有20mL GeneReleaser的0.5mL eppendorf管底，加50mL 液体石蜡油，按下列顺序在PCR仪中进行热处理：65℃ 30s，8℃ 30s，65℃ 90s，97℃ 180s，8℃ 60s，65℃ 180s，97℃ 60s，65℃ 60s，80℃放置。
, 百拇医药
1.3.2 进行PCR扩增参照J Sambrook方法[5]
将上述反应试管加入PCR反应体系(100mL体系中，含0.2mmol/L dNTPs，上下游引物各50pmol，1.5mmol/L MgCl2，10×PCR buffer 10mL)，加入Taq DNA聚合酶2u，混匀，在PCR仪上进行扩增反应，94℃预变性4s，94℃ 变性30s，53℃ 退火45s，72℃ 延伸45s，循环35次，72℃ 延伸10min。
1.3.3 PCR扩增产物的检测：取10mL 扩增产物点样于1.5% 琼脂糖凝胶(含EB)，50V，电泳1h，紫外灯下观察条带并照像。
2 结果与讨论
肝素化全血进行直接PCR未得到目的产物。根据报道，肝素保存的血样品很难扩增出来，肝素、血红蛋白及铁离子等有抑制PCR的作用，我们的实验也表明这些样品中含有PCR抑制物或DNA没有释放出来 ；使用基因释放剂将常温保存的肝素化全血扩增出了特异产物，得到与新鲜血标本同样的结果，表明基因释放剂有使DNA从细胞中释放，拮抗肝素等PCR抑制物的作用。有实验表明EDTA法收集的人类全血储存于4℃或更低温度扩增效果不好，可能由于细胞间蛋白质发生凝集所致。我们的实验提示采用室温保存两日的肝素化全血，能得到较好的扩增效果(见图1)。
, http://www.100md.com
我们直接扩增结肠组织，不使用基因释放剂未得到特异产物，表明结肠组织仅靠冻融，DNA可能未释放出来或有PCR抑制物存在；使用了基因释放剂，得到特异产物；表明基因释放剂有裂解细胞、释放DNA和拮抗PCR抑制物的作用。常规不用基因释放剂对组织进行PCR，须先将组织匀浆，微量组织经过冻融；使用基因释放剂，可以省略匀浆这一步，直接进行PCR。有实验表明基因释放剂能使-20℃存放45天的EDTA保存的血标本中DNA扩增出来，而对这种方法保存六个月的血标本扩增效果很不理想。我们扩增了-20℃存放六个月的陈归结肠组织标本，得到了良好效果。
对有PCR抑制剂的DNA标本，不用基因释放剂未得到特异扩增产物，采用基因释放剂，得到特异扩增产物。表明基因释放剂对于干扰扩增反应的抑制剂有拮抗作用。提示今后PCR实验时，遇到提取的DNA含有PCR抑制物时，可使用基因释放剂来解决(见图1)，其原因有待研究。
利用基因释放剂直接进行PCR优点如下：1.省略了复杂的提取DNA的步骤，省时、省力；2.解决了实验要求样品质量、数量严格的问题，对某些难得的样品如肝素化全血、陈旧组织标本等微量即可使用，使得特殊研究成为可能。
, http://www.100md.com
图1 基因释放剂对微量、陈旧标本直接进行PCR
Fig 1 Direct PCR from Samples of Microliters/Micrograms & Long Time Stored by Using Gene Releaser.
The PCR product for Exon 15-J of APC gene was electrophoresed in 1.5% agaarose gel and stain with ethidium bromide.
1:size marker(PBR 322/Hinfl). 2: colonic mucosa tissues+Gene Releaser. 3: colonic mucosa tissues.4:Heparinized blood +Gene Releaseer. 5: Heparinized blood. 6: fresh whole blood+Gene Releaseer. 7: DNA samples with PCR inhibitors. 8 : DNA samples with PCR inhibitors+Gene Releaser.
, 百拇医药
[1]McCusker J,Dawson MT,Noone D，et al.Improved method for direct PCR amplication from whole blood[J].Nucleic Acid Res，1992，20(24)：6747
[2]高惠兰，许建宁，方福德.用少量细胞直接进行聚合酶链反应[J].基础医学与临床，1993，13：236-237.
[3]Mercier B，Gaucher C,Feugeas O,et al.Direct PCR from whole blood，without DNA extratio[J].Nucleic Acids Res，1990，18(19):5908
[4]Makowski GS，Davis EL，Hopfer SM.The effect of storage on Guthrie cards :implications for deoxyibonucleicleic acid amplication[J].Ann Clin Lab Sci，1996, 26(5):458-69.
[5] J Sambrook，E F Fritsch and T Maniatis.分子克隆实验指南[M].科学出版社.
收稿日期：1998-08-01；修订日期：1998-09-14, 百拇医药