重力生理学研究回顾
作者：吴兴裕 孙喜庆 姚永杰 张舒 曹新生 韩磊
单位：710032 西安，第四军医大学航空航天医学系
关键词：航空航天医学；加速度；失重；综述文献
中华航空航天医学杂志000403 【中国图书资料分类法分类号】 R853
重力生理学(gravitational physiology)是一门新兴的学科,它包含重力增加和减少(超重和失重)两个方面。其研究内容随着航空航天事业的发展而逐步形成并不断得到拓宽及延伸，极具发展前景。第四军医大学航空航天医学系在张立藩教授的倡导和关怀下，早在80年代初期就开设了航空生物动力学等专业课程，将分散在航空生理学和航空卫生学中的相关内容加以综合，现已发展成为航空航天医学的重要支脉；与此同时，组建了航空航天生物动力学教研室，使这个专业受到更多关注，展现更大的活力。近十年来，这个专业培养了一批硕士和博士研究生，开展了若干方向的研究工作，先后获得国家自然科学基金、863-2课题基金和全军医药卫生科技重大项目基金的资助，并取得初步成效。笔者结合国内外有关研究进展，回顾我们在重力生理学方面的研究成果。
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一、高G重复暴露致脑损伤及其机理的研究[1，2]
现代高性能战斗机在飞行中产生的正加速度(+GZ)高达+9 GZ，持续时间可达45 s，已超出了人体正常的耐受限度。正加速度引起的意识丧失(G induced loss of consciousness, G-LOC)主要是由于脑水平动脉压降低，脑血流量减少，进而引起脑组织缺血、缺氧所致。它不仅是限制飞行员工作能力的主要因素，也是威胁飞行安全的主要原因。Whinnery对G-LOC机理及其防护措施进行了较全面的研究，他认为，短时间低G值+GZ作用不会造成人脑的病理性损害[3-6]。但谢宝生等进行的动物实验则表明，+5 GZ/3 min或8 GZ/3 min作用一次即可引起大鼠脑皮质神经元线粒体结构的损伤[7]。我们首次建立了快速下体负压模拟G-LOC的大鼠模型，并首次提出以颈总动脉血流量降为零作为动物发生意识丧失的监测指标，还建立了+GZ作用对人体生理系统影响的数学模型，为深入研究G-LOC的机理提供了新的研究手段。系统地揭示了反复高G暴露后大鼠脑皮质神经元形态学改变的性质、时程及其恢复情况。首次阐明反复高G暴露致脑损伤至少涉及以下几个方面的生物化学及细胞生物学机制：即脑能量代谢降低、血脑屏障通透性增加及脑一氧化氮合酶增加。首次证明血液流变学特性改变在反复高G暴露致脑损伤中起重要作用，并揭示了+GZ作用下兔颅内压及心脏泵血功能的变化特点及影响因素。以上工作为进一步阐明高G值持续性+GZ反复作用对脑的影响及其机理，指导飞行员训练，发展新一代对抗措施，保障高性能战斗机飞行人员的健康与安全具有重要意义。
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二、热休克蛋白在加速度致脑损伤中的保护作用的研究
热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一种应激蛋白，细胞应激后HSP基因被激活而大量表达。目前，绝大多数研究认为，脑缺血、缺氧、热暴露、机械损伤等刺激可以诱导HSP70的表达，HSP70对脑缺血、缺氧等因素所致的脑损伤有保护作用[8-10]。我们观察了+GZ暴露大鼠脑中HSP70的变化，以探讨其在+GZ所致脑损伤中的作用。结果显示，+GZ暴露后6 h HSP70开始升高，1 d达到高峰，至6 d时基本恢复正常。不同+GZ暴露之间进行比较可以看出，+6 GZ组HSP70表达最高，+10 GZ组最少。表明+GZ暴露可以诱导大鼠脑HSP70 的表达，使其表达水平显著升高[11]。
三、不同重力环境对大鼠成骨细胞力学信号转导功能影响的研究[12]
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近年来有关骨骼功能适应性机理的研究在细胞生物学领域有了一些新的发现。经研究证实，骨骼内的某些细胞(目前认为，成骨细胞、骨细胞和骨衬细胞是骨骼组织内力学敏感性细胞)能够感知生物物理性信号(如力学信号、电信号等)，加工整合这些信号，并将其转化为相应的骨骼结构变化，这些细胞的这一功能被称为力学信号转导功能(mechanotransduction)。现认为，在骨陷窝和骨小管构成的多孔连通体系中，流体剪切应力(flow shear stress, FSS)是骨骼细胞所能感受的最主要的力学刺激信号[13，14]。在FSS作用过程中，激活骨骼细胞，引起最典型的细胞反应是前列腺素和一氧化氮(NO)分泌的变化。
我们利用体外分离培养的原代成骨细胞，在不同重力环境下进行传代培养，以考察不同重力环境对成骨细胞力学信号转导功能的影响。
1.不同重力环境对流体剪切应力致成骨细胞前列腺素E2分泌的影响：前列腺素是成骨细胞在受到应力作用后产生的主要化学信号因子，其在骨骼功能适应性机理中起重要作用[15]。因此，可对体外培养的成骨细胞进行FSS刺激，通过观察前列腺素E2(prostaglandin E2， PGE2)分泌量的变化，来研究细胞的力学信号转导功能。我们利用小型回转器模拟失重环境，利用离心机实现超重环境。利用“剪切应力流室系统”对不同重力下培养的成骨细胞进行FSS刺激。以放射免疫分析法检测PGE2分泌量。结果发现，1 G重力组和3 G超重组，在0.5 Pa和1.5 Pa两种水平的FSS作用5 min，即可在灌流液中检测到PGE2的存在，其分泌量随FSS作用时间的延长而增加，FSS作用组与对照组之间差异有显著性意义，1 G重力组与3 G重力组之间差异无显著性意义。而模拟失重组在0.5 Pa组中未检测到PGE2的存在，1.5 Pa组在FSS作用30 min时才检测到PGE2的存在，其与正常对照组和0.5 Pa组之间的差异都有显著性意义。本实验结果提示，模拟失重组PGE2分泌量显著减少，细胞力学信号转导功能发生了显著下调性变化。这一变化可能是失重性骨质稀少的发生机理之一。
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2.不同重力环境对流体剪切应力致成骨细胞环氧合酶-2表达的影响：为了进一步探讨重力变化对成骨细胞力学信号转导功能的影响及PGE2分泌变化的机制，我们研究了不同重力环境培养的成骨细胞在FSS作用下环氧合酶-2(COX-2)蛋白和基因的表达，以及环氧合酶-1(COX-1)基因表达情况。实验结果为：①细胞免疫组织化学染色显示，COX-2主要分布在成骨细胞的核膜上，核膜呈棕褐色染色，成骨细胞胞质未见到染色颗粒。空白对照组和实验对照组未见到阳性染色；1 G和3 G超重组有明显阳性染色；模拟失重组，也仅在1.5 Pa作用1 h的细胞中可见轻微的阳性染色。②West Blot COX-2蛋白表达结果显示，1 G组和3 G超重组用COX-2多抗杂交后，有明显的阳性染色带，而对照组无阳性染色带。模拟失重组COX-2表达仅在1.5 Pa作用1 h组可见阳性染色带。③COX-1和COX-2 mRNA的RT-PCR(反转录-聚合酶链反应)结果显示，1 G重力组和3 G超重组FSS诱导COX-2基因的表达，且这种表达随FSS作用时间的延长而增强，不同应力水平间无明显变化；模拟失重组仅在1.5 Pa作用1 h时才出现轻度表达，余未见表达。COX-1基因表达各重力组间无显著差异。本实验中，COX-1基因表达在重力和FSS两种因素作用下，没有发生显著改变，而在模拟失重组仅有轻度表达下降趋势，可见其作为一种结构型表达基因，具有较高的稳定性，不易受外界因素的影响，而COX-2的蛋白及基因表达变化十分明显，这与之具有高诱导活性的特征分不开。COX-2的蛋白表达和基因表达与前面观察到的PGE2的变化规律相似，说明PGE2的分泌改变是由于COX-2的基因表达的变化导致的，在模拟失重组中，FSS作用对COX-2蛋白和基因表达的缺如或减缓，提示成骨细胞的力学信号转导功能在模拟失重情况下发生了下调性改变。
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本项研究首次证实了成骨细胞的力学信号转导功能可受模拟失重环境的影响。这为失重性骨质稀少的发生机理提供了新的解释思路，即骨骼功能适应性机理在失重环境下发生了改变，其本质可能是受应力应变作用后，所分泌的化学信号因子的减少，使得维持平衡的局部调节因素受到影响，致使骨骼结构功能的改变。为维持骨骼的功能适应性，就必须施加一定的重力刺激，才能有效地维持骨骼构建与重塑之间的平衡。
四、模拟失重对骨骼系统的影响及对抗措施的研究
1.模拟失重对大鼠承重骨的影响：失重性骨质稀少(osteopenia induced by weightless)主要表现为骨量丢失、骨质脱钙、骨密度降低等，这些变化无自限性，平均钙丢失总量与空间飞行时间呈弱相关[16]。骨质稀少主要发生在承重骨，在骨质脱钙的基础上，可能导致骨折、软组织钙化、肾结石及促使动脉粥样硬化等病理改变。我们采用了3 周尾部悬吊大鼠模型，考察了承重骨的变化情况，以骨骼的物理性状、组织形态学及生物力学特性等为指标。实验结果显示，股骨的物理性状(湿重、干重、灰分、直径和比重)显著降低，表明3周模拟失重抑制了承重骨的正常生长代谢。悬吊大鼠股骨的弹性载荷、最大载荷、最大挠度和刚性系数均较对照组显著下降(P<0.01或P<0.05)，韧性系数显著增大(P<0.01)，表明模拟失重使承重骨生物力学性能增长缓慢。能谱分析结果表明，股骨钙(Ca)百分比含量显著降低，磷(P)无显著差异。采用蒋氏改良的三色染色法观察骨组织形态学变化，首次观察到模拟失重大鼠股骨骨基质钙化障碍，有局部钙盐丢失、伴随钙盐沉积不良和出现原有钙盐沉积部位的脱钙现象等变化，表明钙盐沉积受到抑制。承重骨的细胞活性及胶原代谢在3周模拟失重后发生变化，作为细胞外基质成熟和骨细胞分化的早期标志物的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)显著减少，而反映骨吸收的骨酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)阳性区域显著增加，说明这两种酶都参与了失重状态下的骨丢失过程，成骨作用受到抑制，而破骨活性可能增强。3周尾吊后，皮质骨部位Ⅰ型胶原含量显著增加，但这种增加不是成骨细胞合成胶原增加，而是在微重力条件下，陈旧性胶原不能及时清除的结果。胶原排列发生改变，出现了大量不规则、杂乱排列的纤维。胶原纤维排列的变化，使骨胶原的稳定性降低，影响钙盐沉积。
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2.不同类型对抗措施作用效果的研究：航天失重条件下出现负钙平衡和骨量丢失的主要原因，包含重力作用消失、肌肉牵拉作用减弱、调节因素的变化以及局部血流动力学改变等[17]。因此，理想的对抗措施应具有能改善以上各方面的作用。现有航天飞行中的各种医学保障措施仅属于对“症”处理，并没有从根本上解决失重性骨丢失问题。我们在尾吊大鼠模型模拟失重的基础上，给予间断性水平位站立[18]、头高位(45°)站立、以及利用人工离心机进行不同G值水平(含1 G、1.5 G和2.6 G)的人工重力等多种类型对抗措施，试对其防护效果进行比较研究。结果表明，所采用的对抗措施都有一定的防护效应。每天1 h间断性暴露即可产生明显的对抗作用效果。1 G左右的对抗措施(水平站立、45°头高位站立、1.5 G人工重力等)的防护效果显著，增大G值或延长作用时间，对抗效果并无显著提高。骨形成和骨骼的细胞营养都离不开血液循环，局部血液的灌流情况是影响骨代谢的重要因素。尾吊大鼠给予间断性水平位或头高位站立，增大后肢的灌流压力，不仅可以增加血液供应，而且增大后肢的静水压力，增强骨间隙的液体流动，从而使骨细胞或成骨细胞受到力的刺激作用，促进成骨作用。采用45°头高位站立的对抗措施，作用效果并未见明显提高。究其原因，可能是悬吊和头高位两种体位的应激因素互相叠加，刺激作用的强度太大，影响了尾吊大鼠的整体生长情况。另外，人工重力的正性作用存在一个区间，并非G值越大越好。有研究表明，在重力环境改变后大鼠生长板的反应遵从Hurt曲线[19]，它反映骨骺软骨在重力改变时生长变化情况，促进骨骺软骨分化的G值有一定的范围，在此范围之外，不论G值增大或减小都会抑制分化活动，甚至使生长板活动停止。人工重力对抗措施被认为是全面解决失重对人体影响的根本方法或最佳方案。由旋转体产生的惯性离心力与真实力无异，在物理学上与天然重力是完全等效的，90年代始受到重视。采取装配在空间站内的短臂离心机旋转产生的间断性人工重力环境可对抗失重的影响，但仍有一些基本问题未经阐明。例如，G值大小、暴露的持续时间和频度等。我们采用尾吊大鼠模型，观察了3周模拟失重期间，给予间断性的1 G、1.5 G和2.6 G人工重力对抗措施的防护作用效果。结果提示，采用人工重力环境可以有效地对抗失重条件下骨骼系统的不良改变。其中，1.5 G组作用效果最佳，在有限范围内增大G值，可以提高整体对抗效果。
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3.骨骼局部调节因子的作用：近年来的研究认为，模拟失重后，骨代谢的系统调节因子，如甲状旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)、生长激素(growth hormone, GH)、1，25-(OH)2D3可能发挥重要作用，但局部调节因子，如骨钙素、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、转移生长因子β(transforming growth factor β， TGFβ)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α， TNFα)、骨桥素等发挥更主要调节作用。我们选用了BMP、TGFβ、和TNFα三种因子，通过免疫组化染色观察其变化情况。经我们研究发现：BMP、TGFβ阳性细胞减少，而TNFα含量无明显变化。BMP在诱导成骨过程中发挥着重要作用[20]，在成骨细胞、骨膜和骨髓细胞中含有丰富的BMP，通过自分泌或旁分泌的形式，诱导成骨细胞分化，从而形成新骨。本研究结果提示去负荷后BMP生成受到抑制，使成骨细胞数量减少，可能是引起失重性骨质稀少的重要原因。TGFβ能刺激细胞增殖、分化和间质合成，还能协调诸多细胞因子的作用，它是局部细胞活动的协调者。Zhang R等[21]利用原位杂交检测大鼠去负荷骨，发现悬吊后大鼠TGFβ mRNA阳性的前成骨细胞、成骨细胞数量较正常对照组显著减少，骨细胞中TGFβ mRNA水平也明显降低。TGFβ在成骨细胞和骨细胞中的减少，提示可能是引起去负荷后大鼠骨质丧失的重要因素之一。本实验结果与文献一致。
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TNFα对骨代谢有着重要的调节作用，它通过抑制成骨细胞样细胞增殖、Ⅰ型胶原合成和ALP活性等而阻碍骨的形成[22，23]。同时，TNFα又能通过成骨细胞间接刺激前破骨细胞的增殖而促进成熟破骨细胞的形成。TNFα在调节破骨细胞分化和骨吸收过程中发挥着重要作用。模拟失重大鼠在尾吊15 d后血中TNFα呈降低趋势，30 d达到显著水平，这可能与骨髓细胞增殖能力降低有关。本研究TNFα在模拟失重组与正常对照组之间未发现明显差异，提示3周去负荷大鼠，由TNFα介导的破骨细胞活性未发生明显变化。以往关于不同类型对抗措施的研究，多集中于对抗作用效果，有关机理的研究涉及很少。本研究观察了不同G值间断性对抗措施对承重骨的组织学变化及可能作用途径，即探讨了局部调节因子的改变及对骨代谢的可能影响。实验结果表明，采取对抗措施后，骨的生长代谢、物理性状和生物力学特性等均有明显改善。骨量丢失、骨质脱钙等开始恢复。三色染色法显示各对抗组钙盐代谢部分改善；组织化学染色法各对抗组ALP水平无变化，ACP活性降低；免疫组化染色法结果显示，Ⅰ型胶原的排列紊乱状态有所恢复；骨质内BMP、TGFβ和TNFα含量无明显变化。提示，采取各种对抗措施后，钙盐沉积增加，胶原代谢有所改善，成骨细胞未见明显变化，破骨细胞在较高G值负荷(2.6 G)下受到阻抑。
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五、下体负压对抗头低位(-6°)卧床致立位耐力不良防护效果的研究
失重(模拟失重)时，在缺乏对抗措施的条件下，心血管系统脱适应致使立位耐力不良现象，几乎是不可避免。立位耐力不良明显影响了航天活动及返回1 G环境时的再适应能力。我们通过建立3周头低位倾斜卧床(HDT-6°)人体试验模型，由18名健康男性志愿者，随机分为卧床对照组、卧床最后一周施加间断性(1 h/d)下体负压(lower-body negative pressure, LBNP)(-30 mm Hg)对抗组(对抗1组)、卧床第1周和最后1周施加间断性LBNP对抗组(对抗2组)，每组6名受试者，各组间的年龄、身高、体重无显著差异。考察了LBNP对抗措施对立位耐力和心血管功能变化情况的影响，就LBNP不同方案的作用效果进行了筛选和比较。试验结果如下：①体重、小腿周径和尿量改变：对照组和对抗1组在卧床第3、7 d，平均体重低于卧床前(P<0.01)，对抗2组体重无显著变化，在第14、21 d又恢复到卧床前水平，各对抗组在第21 d较卧床前显著增加(P<0.05)或有增加趋势。小腿最大周径和横截面积随卧床时间增加而减少，各组间无显著差异。日尿量对照组在实验期间无显著差异，各对抗组在施加对抗措施期间较对照组显著减少(P<0.05或P<0.01)。②立位耐力(75°、20 min)检查：卧床前、卧床后第10、21 d共进行3次检查。结果为：卧床前，18名受试者均通过立位耐力检查；卧床第10 d，除对抗2组6名受试者均通过外，其余12名受试者中，10名均未通过检查，出现晕厥前症状或晕厥，平均耐受时间为(14.68±5.1) min，显著低于卧床前(P<0.05)。卧床第21 d，对照组5人未通过，平均耐受时间为(13.0±4.0) min，而各对抗组仅1人未通过。③心脏泵血及收缩功能指标的变化：卧床初期阶段，对照组心率和收缩压低于卧床前，卧床第12 d后达到显著水平。心脏泵血功能(SV、CO、CI)亦较卧床前降低，起床后显著升高。施加LBNP刺激时(-30 mm Hg,1 h/d),上述指标变化均未达到显著水平。心脏收缩功能变化主要表现为射血前期(pre-ejection period, PEP)在卧床期间显著延长，PEP/LVET(left ventricular ejection time)和ICT(isovolumic contraction time)/LVET较卧床前升高。LBNP各组的PEP和PEP/LVET在第21 d及起床后第2 d，仍显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)。本试验结果再次证明，21 d HDT-6°可致立位耐力显著下降。LBNP组的主要心血管功能检测指标均较对照组有较大改善。LBNP作为一种对抗心血管系统脱适应的物理性对抗措施，有可靠的作用效果。
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总之，G负荷及其防护是现阶段军事航空医学领域中，需要着力研究解决的最重要课题之一。从航天医学角度看，中、长期空间飞行对骨骼系统的影响以及防护对策，最引人注目。我们在重力生理学领域的研究工作仅仅是初步的，愿与国内外学术机构加强学术交流与合作，共同谋求发展。
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[收稿日期：2000-09-26], http://www.100md.com
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二、热休克蛋白在加速度致脑损伤中的保护作用的研究
热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一种应激蛋白，细胞应激后HSP基因被激活而大量表达。目前，绝大多数研究认为，脑缺血、缺氧、热暴露、机械损伤等刺激可以诱导HSP70的表达，HSP70对脑缺血、缺氧等因素所致的脑损伤有保护作用[8-10]。我们观察了+GZ暴露大鼠脑中HSP70的变化，以探讨其在+GZ所致脑损伤中的作用。结果显示，+GZ暴露后6 h HSP70开始升高，1 d达到高峰，至6 d时基本恢复正常。不同+GZ暴露之间进行比较可以看出，+6 GZ组HSP70表达最高，+10 GZ组最少。表明+GZ暴露可以诱导大鼠脑HSP70 的表达，使其表达水平显著升高[11]。
三、不同重力环境对大鼠成骨细胞力学信号转导功能影响的研究[12]
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近年来有关骨骼功能适应性机理的研究在细胞生物学领域有了一些新的发现。经研究证实，骨骼内的某些细胞(目前认为，成骨细胞、骨细胞和骨衬细胞是骨骼组织内力学敏感性细胞)能够感知生物物理性信号(如力学信号、电信号等)，加工整合这些信号，并将其转化为相应的骨骼结构变化，这些细胞的这一功能被称为力学信号转导功能(mechanotransduction)。现认为，在骨陷窝和骨小管构成的多孔连通体系中，流体剪切应力(flow shear stress, FSS)是骨骼细胞所能感受的最主要的力学刺激信号[13，14]。在FSS作用过程中，激活骨骼细胞，引起最典型的细胞反应是前列腺素和一氧化氮(NO)分泌的变化。
我们利用体外分离培养的原代成骨细胞，在不同重力环境下进行传代培养，以考察不同重力环境对成骨细胞力学信号转导功能的影响。
1.不同重力环境对流体剪切应力致成骨细胞前列腺素E2分泌的影响：前列腺素是成骨细胞在受到应力作用后产生的主要化学信号因子，其在骨骼功能适应性机理中起重要作用[15]。因此，可对体外培养的成骨细胞进行FSS刺激，通过观察前列腺素E2(prostaglandin E2， PGE2)分泌量的变化，来研究细胞的力学信号转导功能。我们利用小型回转器模拟失重环境，利用离心机实现超重环境。利用“剪切应力流室系统”对不同重力下培养的成骨细胞进行FSS刺激。以放射免疫分析法检测PGE2分泌量。结果发现，1 G重力组和3 G超重组，在0.5 Pa和1.5 Pa两种水平的FSS作用5 min，即可在灌流液中检测到PGE2的存在，其分泌量随FSS作用时间的延长而增加，FSS作用组与对照组之间差异有显著性意义，1 G重力组与3 G重力组之间差异无显著性意义。而模拟失重组在0.5 Pa组中未检测到PGE2的存在，1.5 Pa组在FSS作用30 min时才检测到PGE2的存在，其与正常对照组和0.5 Pa组之间的差异都有显著性意义。本实验结果提示，模拟失重组PGE2分泌量显著减少，细胞力学信号转导功能发生了显著下调性变化。这一变化可能是失重性骨质稀少的发生机理之一。
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2.不同重力环境对流体剪切应力致成骨细胞环氧合酶-2表达的影响：为了进一步探讨重力变化对成骨细胞力学信号转导功能的影响及PGE2分泌变化的机制，我们研究了不同重力环境培养的成骨细胞在FSS作用下环氧合酶-2(COX-2)蛋白和基因的表达，以及环氧合酶-1(COX-1)基因表达情况。实验结果为：①细胞免疫组织化学染色显示，COX-2主要分布在成骨细胞的核膜上，核膜呈棕褐色染色，成骨细胞胞质未见到染色颗粒。空白对照组和实验对照组未见到阳性染色；1 G和3 G超重组有明显阳性染色；模拟失重组，也仅在1.5 Pa作用1 h的细胞中可见轻微的阳性染色。②West Blot COX-2蛋白表达结果显示，1 G组和3 G超重组用COX-2多抗杂交后，有明显的阳性染色带，而对照组无阳性染色带。模拟失重组COX-2表达仅在1.5 Pa作用1 h组可见阳性染色带。③COX-1和COX-2 mRNA的RT-PCR(反转录-聚合酶链反应)结果显示，1 G重力组和3 G超重组FSS诱导COX-2基因的表达，且这种表达随FSS作用时间的延长而增强，不同应力水平间无明显变化；模拟失重组仅在1.5 Pa作用1 h时才出现轻度表达，余未见表达。COX-1基因表达各重力组间无显著差异。本实验中，COX-1基因表达在重力和FSS两种因素作用下，没有发生显著改变，而在模拟失重组仅有轻度表达下降趋势，可见其作为一种结构型表达基因，具有较高的稳定性，不易受外界因素的影响，而COX-2的蛋白及基因表达变化十分明显，这与之具有高诱导活性的特征分不开。COX-2的蛋白表达和基因表达与前面观察到的PGE2的变化规律相似，说明PGE2的分泌改变是由于COX-2的基因表达的变化导致的，在模拟失重组中，FSS作用对COX-2蛋白和基因表达的缺如或减缓，提示成骨细胞的力学信号转导功能在模拟失重情况下发生了下调性改变。
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本项研究首次证实了成骨细胞的力学信号转导功能可受模拟失重环境的影响。这为失重性骨质稀少的发生机理提供了新的解释思路，即骨骼功能适应性机理在失重环境下发生了改变，其本质可能是受应力应变作用后，所分泌的化学信号因子的减少，使得维持平衡的局部调节因素受到影响，致使骨骼结构功能的改变。为维持骨骼的功能适应性，就必须施加一定的重力刺激，才能有效地维持骨骼构建与重塑之间的平衡。
四、模拟失重对骨骼系统的影响及对抗措施的研究
1.模拟失重对大鼠承重骨的影响：失重性骨质稀少(osteopenia induced by weightless)主要表现为骨量丢失、骨质脱钙、骨密度降低等，这些变化无自限性，平均钙丢失总量与空间飞行时间呈弱相关[16]。骨质稀少主要发生在承重骨，在骨质脱钙的基础上，可能导致骨折、软组织钙化、肾结石及促使动脉粥样硬化等病理改变。我们采用了3 周尾部悬吊大鼠模型，考察了承重骨的变化情况，以骨骼的物理性状、组织形态学及生物力学特性等为指标。实验结果显示，股骨的物理性状(湿重、干重、灰分、直径和比重)显著降低，表明3周模拟失重抑制了承重骨的正常生长代谢。悬吊大鼠股骨的弹性载荷、最大载荷、最大挠度和刚性系数均较对照组显著下降(P<0.01或P<0.05)，韧性系数显著增大(P<0.01)，表明模拟失重使承重骨生物力学性能增长缓慢。能谱分析结果表明，股骨钙(Ca)百分比含量显著降低，磷(P)无显著差异。采用蒋氏改良的三色染色法观察骨组织形态学变化，首次观察到模拟失重大鼠股骨骨基质钙化障碍，有局部钙盐丢失、伴随钙盐沉积不良和出现原有钙盐沉积部位的脱钙现象等变化，表明钙盐沉积受到抑制。承重骨的细胞活性及胶原代谢在3周模拟失重后发生变化，作为细胞外基质成熟和骨细胞分化的早期标志物的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)显著减少，而反映骨吸收的骨酸性磷酸酶(acid phosphatase, ACP)阳性区域显著增加，说明这两种酶都参与了失重状态下的骨丢失过程，成骨作用受到抑制，而破骨活性可能增强。3周尾吊后，皮质骨部位Ⅰ型胶原含量显著增加，但这种增加不是成骨细胞合成胶原增加，而是在微重力条件下，陈旧性胶原不能及时清除的结果。胶原排列发生改变，出现了大量不规则、杂乱排列的纤维。胶原纤维排列的变化，使骨胶原的稳定性降低，影响钙盐沉积。
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2.不同类型对抗措施作用效果的研究：航天失重条件下出现负钙平衡和骨量丢失的主要原因，包含重力作用消失、肌肉牵拉作用减弱、调节因素的变化以及局部血流动力学改变等[17]。因此，理想的对抗措施应具有能改善以上各方面的作用。现有航天飞行中的各种医学保障措施仅属于对“症”处理，并没有从根本上解决失重性骨丢失问题。我们在尾吊大鼠模型模拟失重的基础上，给予间断性水平位站立[18]、头高位(45°)站立、以及利用人工离心机进行不同G值水平(含1 G、1.5 G和2.6 G)的人工重力等多种类型对抗措施，试对其防护效果进行比较研究。结果表明，所采用的对抗措施都有一定的防护效应。每天1 h间断性暴露即可产生明显的对抗作用效果。1 G左右的对抗措施(水平站立、45°头高位站立、1.5 G人工重力等)的防护效果显著，增大G值或延长作用时间，对抗效果并无显著提高。骨形成和骨骼的细胞营养都离不开血液循环，局部血液的灌流情况是影响骨代谢的重要因素。尾吊大鼠给予间断性水平位或头高位站立，增大后肢的灌流压力，不仅可以增加血液供应，而且增大后肢的静水压力，增强骨间隙的液体流动，从而使骨细胞或成骨细胞受到力的刺激作用，促进成骨作用。采用45°头高位站立的对抗措施，作用效果并未见明显提高。究其原因，可能是悬吊和头高位两种体位的应激因素互相叠加，刺激作用的强度太大，影响了尾吊大鼠的整体生长情况。另外，人工重力的正性作用存在一个区间，并非G值越大越好。有研究表明，在重力环境改变后大鼠生长板的反应遵从Hurt曲线[19]，它反映骨骺软骨在重力改变时生长变化情况，促进骨骺软骨分化的G值有一定的范围，在此范围之外，不论G值增大或减小都会抑制分化活动，甚至使生长板活动停止。人工重力对抗措施被认为是全面解决失重对人体影响的根本方法或最佳方案。由旋转体产生的惯性离心力与真实力无异，在物理学上与天然重力是完全等效的，90年代始受到重视。采取装配在空间站内的短臂离心机旋转产生的间断性人工重力环境可对抗失重的影响，但仍有一些基本问题未经阐明。例如，G值大小、暴露的持续时间和频度等。我们采用尾吊大鼠模型，观察了3周模拟失重期间，给予间断性的1 G、1.5 G和2.6 G人工重力对抗措施的防护作用效果。结果提示，采用人工重力环境可以有效地对抗失重条件下骨骼系统的不良改变。其中，1.5 G组作用效果最佳，在有限范围内增大G值，可以提高整体对抗效果。
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3.骨骼局部调节因子的作用：近年来的研究认为，模拟失重后，骨代谢的系统调节因子，如甲状旁腺激素(parathyroid hormone, PTH)、生长激素(growth hormone, GH)、1，25-(OH)2D3可能发挥重要作用，但局部调节因子，如骨钙素、骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)、转移生长因子β(transforming growth factor β， TGFβ)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor α， TNFα)、骨桥素等发挥更主要调节作用。我们选用了BMP、TGFβ、和TNFα三种因子，通过免疫组化染色观察其变化情况。经我们研究发现：BMP、TGFβ阳性细胞减少，而TNFα含量无明显变化。BMP在诱导成骨过程中发挥着重要作用[20]，在成骨细胞、骨膜和骨髓细胞中含有丰富的BMP，通过自分泌或旁分泌的形式，诱导成骨细胞分化，从而形成新骨。本研究结果提示去负荷后BMP生成受到抑制，使成骨细胞数量减少，可能是引起失重性骨质稀少的重要原因。TGFβ能刺激细胞增殖、分化和间质合成，还能协调诸多细胞因子的作用，它是局部细胞活动的协调者。Zhang R等[21]利用原位杂交检测大鼠去负荷骨，发现悬吊后大鼠TGFβ mRNA阳性的前成骨细胞、成骨细胞数量较正常对照组显著减少，骨细胞中TGFβ mRNA水平也明显降低。TGFβ在成骨细胞和骨细胞中的减少，提示可能是引起去负荷后大鼠骨质丧失的重要因素之一。本实验结果与文献一致。
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TNFα对骨代谢有着重要的调节作用，它通过抑制成骨细胞样细胞增殖、Ⅰ型胶原合成和ALP活性等而阻碍骨的形成[22，23]。同时，TNFα又能通过成骨细胞间接刺激前破骨细胞的增殖而促进成熟破骨细胞的形成。TNFα在调节破骨细胞分化和骨吸收过程中发挥着重要作用。模拟失重大鼠在尾吊15 d后血中TNFα呈降低趋势，30 d达到显著水平，这可能与骨髓细胞增殖能力降低有关。本研究TNFα在模拟失重组与正常对照组之间未发现明显差异，提示3周去负荷大鼠，由TNFα介导的破骨细胞活性未发生明显变化。以往关于不同类型对抗措施的研究，多集中于对抗作用效果，有关机理的研究涉及很少。本研究观察了不同G值间断性对抗措施对承重骨的组织学变化及可能作用途径，即探讨了局部调节因子的改变及对骨代谢的可能影响。实验结果表明，采取对抗措施后，骨的生长代谢、物理性状和生物力学特性等均有明显改善。骨量丢失、骨质脱钙等开始恢复。三色染色法显示各对抗组钙盐代谢部分改善；组织化学染色法各对抗组ALP水平无变化，ACP活性降低；免疫组化染色法结果显示，Ⅰ型胶原的排列紊乱状态有所恢复；骨质内BMP、TGFβ和TNFα含量无明显变化。提示，采取各种对抗措施后，钙盐沉积增加，胶原代谢有所改善，成骨细胞未见明显变化，破骨细胞在较高G值负荷(2.6 G)下受到阻抑。
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五、下体负压对抗头低位(-6°)卧床致立位耐力不良防护效果的研究
失重(模拟失重)时，在缺乏对抗措施的条件下，心血管系统脱适应致使立位耐力不良现象，几乎是不可避免。立位耐力不良明显影响了航天活动及返回1 G环境时的再适应能力。我们通过建立3周头低位倾斜卧床(HDT-6°)人体试验模型，由18名健康男性志愿者，随机分为卧床对照组、卧床最后一周施加间断性(1 h/d)下体负压(lower-body negative pressure, LBNP)(-30 mm Hg)对抗组(对抗1组)、卧床第1周和最后1周施加间断性LBNP对抗组(对抗2组)，每组6名受试者，各组间的年龄、身高、体重无显著差异。考察了LBNP对抗措施对立位耐力和心血管功能变化情况的影响，就LBNP不同方案的作用效果进行了筛选和比较。试验结果如下：①体重、小腿周径和尿量改变：对照组和对抗1组在卧床第3、7 d，平均体重低于卧床前(P<0.01)，对抗2组体重无显著变化，在第14、21 d又恢复到卧床前水平，各对抗组在第21 d较卧床前显著增加(P<0.05)或有增加趋势。小腿最大周径和横截面积随卧床时间增加而减少，各组间无显著差异。日尿量对照组在实验期间无显著差异，各对抗组在施加对抗措施期间较对照组显著减少(P<0.05或P<0.01)。②立位耐力(75°、20 min)检查：卧床前、卧床后第10、21 d共进行3次检查。结果为：卧床前，18名受试者均通过立位耐力检查；卧床第10 d，除对抗2组6名受试者均通过外，其余12名受试者中，10名均未通过检查，出现晕厥前症状或晕厥，平均耐受时间为(14.68±5.1) min，显著低于卧床前(P<0.05)。卧床第21 d，对照组5人未通过，平均耐受时间为(13.0±4.0) min，而各对抗组仅1人未通过。③心脏泵血及收缩功能指标的变化：卧床初期阶段，对照组心率和收缩压低于卧床前，卧床第12 d后达到显著水平。心脏泵血功能(SV、CO、CI)亦较卧床前降低，起床后显著升高。施加LBNP刺激时(-30 mm Hg,1 h/d),上述指标变化均未达到显著水平。心脏收缩功能变化主要表现为射血前期(pre-ejection period, PEP)在卧床期间显著延长，PEP/LVET(left ventricular ejection time)和ICT(isovolumic contraction time)/LVET较卧床前升高。LBNP各组的PEP和PEP/LVET在第21 d及起床后第2 d，仍显著高于对照组(P<0.05或P<0.01)。本试验结果再次证明，21 d HDT-6°可致立位耐力显著下降。LBNP组的主要心血管功能检测指标均较对照组有较大改善。LBNP作为一种对抗心血管系统脱适应的物理性对抗措施，有可靠的作用效果。
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总之，G负荷及其防护是现阶段军事航空医学领域中，需要着力研究解决的最重要课题之一。从航天医学角度看，中、长期空间飞行对骨骼系统的影响以及防护对策，最引人注目。我们在重力生理学领域的研究工作仅仅是初步的，愿与国内外学术机构加强学术交流与合作，共同谋求发展。
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[收稿日期：2000-09-26], http://www.100md.com