动力学光度法测定体液中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶
作者：袁亚莉 邓健 许金生 李振玉
单位：衡阳医学院 衡阳421001
关键词：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；动力学光度法；体液
数理医药学杂志990126
摘 要 建立了检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的动力学光度分析新方法。该方法灵敏、操作简便、结果可靠、试剂稳定，可用于各级各类医院对人体血清或尿样中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的检验。
N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)是细胞内溶酶体的一种酸性水解酶。研究结果表明，人体液(血液、尿液)中NAG活力的大小可用作多种疾病的有效辅助诊断指标[1～3]，检测体液中NAG活力具有重要的临床价值。NAG活力的测定主要有荧光分光光度法和可见分光光度法。前者因所需仪器价格昂贵，且对底物溶液配制的要求较高而不宜用作一般医院的常规检验；后者已见报道的方法在各种实验条件的选定上虽各有千秋，但有的操作麻烦费时，有的所选定的条件或试剂稳定性欠佳，难以满足临床检验要求。本文基于NAG催化水解对硝基苯-N-乙酶-β-D-氨基葡萄糖苷生成有色的对硝基酚这一反应，经反复试验确定了最佳实验条件，建立起简便、快速检测体液中NAG活力的动力学光度分析法，用于多种病人血清和尿样中NAG活力的测定，均获得满意结果。
, 百拇医药
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
723型分光光度计(上海第三分析仪器厂)，电热恒温水浴箱(上海跃进医疗器械厂)。
缓冲溶液：用双蒸水配制50mmol/L柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液,pH=4.6±0.05。
底物溶液：称取适量对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(相对分子质量342.3)，用缓冲溶液配成10mmol/L溶液。
终止液：0.1mmol/L氢氧化钠溶液。
标准溶液：准确称取适量在50℃干燥24h的对硝基酚，用双蒸水配成150μmol/L溶液。
1.2 实验方法
, 百拇医药
取4支试管编号(分别为空白管、标准管、测定管和对照管)，在空白管中加100μl蒸馏水，标准管中加入100μl标准溶液，测定管和对照管中各加入100μl血清或尿样，再在标准管和对照管中各加500μl蒸馏水，在空白管和测定管中各加500μl底物溶液，一同置于37℃恒温水浴中温育(血清为15min，尿样为30min)后，各加2000μl终止液终止反应，用1cm比色池于401nm处以蒸馏水调零测定吸光度，按下式计算NAG的活力：
(注：NAG的活力以国际单位表示，即1L样品中NAG在37℃水解底物，每分钟生成1μmol/L的对硝基苯酚相当1u/L)。
2 结果与讨论
2.1 吸收光谱
, 百拇医药
在本实验条件下从350～450nm范围内测定标准溶液的吸光度，得知对硝基苯酚最大吸收波长为401nm。
2.2 催化水解酸度
选用不同缓冲对构成的pH缓冲溶液溶解底物，结果表明，当反应液pH在4.50～4.75范围内，NAG催化底物水解反应效果最佳。本实验先用柠檬酸-柠檬酸三钠组成的pH为4.60±0.05的缓冲液为催化水解反应介质。
2.3 反应时间
将不同待测样品与底物溶液混匀置于37℃水浴中温育，并于不同时间加入终止液终止反应。结果表明，在20min和40min内，血清和尿样中NAG反应速度恒定。本法选定血清和尿样中酶催化水解反应时间分别为15min和30min。
2.4 缓冲溶液浓度
, 百拇医药
缓冲溶液浓度明显影响酶促反应速度。以不同浓度的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液配制底物溶液进行试验，结果表明，缓冲溶液浓度越大，NAG活力受抑制越明显；但当缓冲溶液浓度低于50mmol/L时，其缓冲能力减弱。
2.5 底物浓度
配制不同的底物溶液测定血清和尿样中的NAG活力。当底物浓度低于8mmol/L时，测定结果随底物浓度的增大而增加，对样品尤其对高酶活性样品的检测结果不太理想；当底物浓度大于9.6mmol/L，酶促反应加快且吸光度稳定。本法选定底物为10mmol/L，可检测酶科学研究性高低不同的样品。
2.6 显色稳定性
取不同样品经显色终止反应后70min，其吸光度的增大未超出临床检验要求的误差范围。
2.7 线性范围与检测限
, 百拇医药
在本实验条件下，NAG活力小于310U/L时，待测液吸光度与酶量线性关系良好。最低检测限为0.6U/L。
2.8 干扰试验
样品中共存的乳酸、丙酮酸、酒石酸、尿酸、葡萄糖、果糖、甘露糖及正常量的抗坏血酸对测定无干扰，但浓度较大的抗坏血酸使NAG测定结果偏低，故要对大剂量服用维生素C的病人体液NAG活力进行检测最好在停药2天后进行。
2.9 样品分析
取不同人员的中段尿样和血清，在批内和批间各重复测定7次，结果见附表。
附表 样品中NAG活力分析结果
样品
测定均值
, http://www.100md.com
(n=7;U/L)
标准偏差
相对标准差
(%)
正常人血清
9.32
0.51
5.47
糖尿病人血清
32.77
1.45
4.42
肾炎病人血清
, 百拇医药
26.56
1.21
4.56
正常人尿
6.13
0.42
6.85
糖尿病人尿
21.38
1.13
5.28
肾炎病人尿
28.00
, 百拇医药
1.09
3.89
参考文献
1柳志浩.血清(或尿)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶测定的临床应用.医师进修杂志，1991，2：33.
2吴汉妮，沈迪，丁桂芝等.N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性测定在糖尿病微血管病变诊断中的临床意义.同济医科大学学报，1994，23(3)：195～197.
3徐九虹.尿液中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测及其临床应用.国外医学临床生物化学与检验分册，1995，16(30)：115～116.
收稿日期：1998-09-05, http://www.100md.com
单位：衡阳医学院 衡阳421001
关键词：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶；动力学光度法；体液
数理医药学杂志990126
摘 要 建立了检测N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的动力学光度分析新方法。该方法灵敏、操作简便、结果可靠、试剂稳定，可用于各级各类医院对人体血清或尿样中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的检验。
N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)是细胞内溶酶体的一种酸性水解酶。研究结果表明，人体液(血液、尿液)中NAG活力的大小可用作多种疾病的有效辅助诊断指标[1～3]，检测体液中NAG活力具有重要的临床价值。NAG活力的测定主要有荧光分光光度法和可见分光光度法。前者因所需仪器价格昂贵，且对底物溶液配制的要求较高而不宜用作一般医院的常规检验；后者已见报道的方法在各种实验条件的选定上虽各有千秋，但有的操作麻烦费时，有的所选定的条件或试剂稳定性欠佳，难以满足临床检验要求。本文基于NAG催化水解对硝基苯-N-乙酶-β-D-氨基葡萄糖苷生成有色的对硝基酚这一反应，经反复试验确定了最佳实验条件，建立起简便、快速检测体液中NAG活力的动力学光度分析法，用于多种病人血清和尿样中NAG活力的测定，均获得满意结果。
, 百拇医药
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
723型分光光度计(上海第三分析仪器厂)，电热恒温水浴箱(上海跃进医疗器械厂)。
缓冲溶液：用双蒸水配制50mmol/L柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液,pH=4.6±0.05。
底物溶液：称取适量对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(相对分子质量342.3)，用缓冲溶液配成10mmol/L溶液。
终止液：0.1mmol/L氢氧化钠溶液。
标准溶液：准确称取适量在50℃干燥24h的对硝基酚，用双蒸水配成150μmol/L溶液。
1.2 实验方法
, 百拇医药
取4支试管编号(分别为空白管、标准管、测定管和对照管)，在空白管中加100μl蒸馏水，标准管中加入100μl标准溶液，测定管和对照管中各加入100μl血清或尿样，再在标准管和对照管中各加500μl蒸馏水，在空白管和测定管中各加500μl底物溶液，一同置于37℃恒温水浴中温育(血清为15min，尿样为30min)后，各加2000μl终止液终止反应，用1cm比色池于401nm处以蒸馏水调零测定吸光度，按下式计算NAG的活力：
(注：NAG的活力以国际单位表示，即1L样品中NAG在37℃水解底物，每分钟生成1μmol/L的对硝基苯酚相当1u/L)。
2 结果与讨论
2.1 吸收光谱
, 百拇医药
在本实验条件下从350～450nm范围内测定标准溶液的吸光度，得知对硝基苯酚最大吸收波长为401nm。
2.2 催化水解酸度
选用不同缓冲对构成的pH缓冲溶液溶解底物，结果表明，当反应液pH在4.50～4.75范围内，NAG催化底物水解反应效果最佳。本实验先用柠檬酸-柠檬酸三钠组成的pH为4.60±0.05的缓冲液为催化水解反应介质。
2.3 反应时间
将不同待测样品与底物溶液混匀置于37℃水浴中温育，并于不同时间加入终止液终止反应。结果表明，在20min和40min内，血清和尿样中NAG反应速度恒定。本法选定血清和尿样中酶催化水解反应时间分别为15min和30min。
2.4 缓冲溶液浓度
, 百拇医药
缓冲溶液浓度明显影响酶促反应速度。以不同浓度的柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲溶液配制底物溶液进行试验，结果表明，缓冲溶液浓度越大，NAG活力受抑制越明显；但当缓冲溶液浓度低于50mmol/L时，其缓冲能力减弱。
2.5 底物浓度
配制不同的底物溶液测定血清和尿样中的NAG活力。当底物浓度低于8mmol/L时，测定结果随底物浓度的增大而增加，对样品尤其对高酶活性样品的检测结果不太理想；当底物浓度大于9.6mmol/L，酶促反应加快且吸光度稳定。本法选定底物为10mmol/L，可检测酶科学研究性高低不同的样品。
2.6 显色稳定性
取不同样品经显色终止反应后70min，其吸光度的增大未超出临床检验要求的误差范围。
2.7 线性范围与检测限
, 百拇医药
在本实验条件下，NAG活力小于310U/L时，待测液吸光度与酶量线性关系良好。最低检测限为0.6U/L。
2.8 干扰试验
样品中共存的乳酸、丙酮酸、酒石酸、尿酸、葡萄糖、果糖、甘露糖及正常量的抗坏血酸对测定无干扰，但浓度较大的抗坏血酸使NAG测定结果偏低，故要对大剂量服用维生素C的病人体液NAG活力进行检测最好在停药2天后进行。
2.9 样品分析
取不同人员的中段尿样和血清，在批内和批间各重复测定7次，结果见附表。
附表 样品中NAG活力分析结果
样品
测定均值
, http://www.100md.com
(n=7;U/L)
标准偏差
相对标准差
(%)
正常人血清
9.32
0.51
5.47
糖尿病人血清
32.77
1.45
4.42
肾炎病人血清
, 百拇医药
26.56
1.21
4.56
正常人尿
6.13
0.42
6.85
糖尿病人尿
21.38
1.13
5.28
肾炎病人尿
28.00
, 百拇医药
1.09
3.89
参考文献
1柳志浩.血清(或尿)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶测定的临床应用.医师进修杂志，1991，2：33.
2吴汉妮，沈迪，丁桂芝等.N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性测定在糖尿病微血管病变诊断中的临床意义.同济医科大学学报，1994，23(3)：195～197.
3徐九虹.尿液中N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的检测及其临床应用.国外医学临床生物化学与检验分册，1995，16(30)：115～116.
收稿日期：1998-09-05, http://www.100md.com